Name: detection of endotoxin in nano-formulations using limulus amoebocyte lysate (lal) assays
Uploaded: 2019-01-30T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays at JoVE.com

Studien har finansierats av federala medel från National Cancer Institute, National Institutes of Health, kontrakterade HHSN261200800001E. Innehållet i denna publikation återspeglar inte nödvändigtvis åsikter eller politik av Department of Health and Human Services, eller nämner av varunamn, kommersiella produkter eller organisationer antyda av den amerikanska regeringen.

1. beredning av nanopartiklar prover
<ol><li>Förbereda studien provet i LAL grade vatten.</li>
	<li>Om provet pH-värdet är utanför intervallet 6-8, justera pH med hjälp av pyrogenfri natriumhydroxid eller saltsyra.</li>
	<li>Med hjälp av LAL grade vatten förbereda flera spädningar av studien provet. Se till att den högsta utspädningen inte överstiger maximal giltig utspädning (MVD). Se diskussionsavsnittet för mer information om MVD uppskattning.</li>
</ol>2. beredning av reagens Comm...

<ol>
	<li>Perkins, D. J., Patel, M. C., Blanco, J. C., Vogel, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+Mechanisms+Governing+Innate+Inflammatory+Responses.">Epigenetic Mechanisms Governing Innate Inflammatory Responses.</a> Journal of Interferon &amp; Cytokine Research. 36 (7), 454-461 (2016).</li><li>Vogel, S. N., Awomoyi, A. A., Rallabhandi, P., Medvedev, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+TLR4+signaling+that+lead+to+increased+susceptibility+to+infection+in+humans:+an+overview.">Mutations in TLR4 signaling that lead to increased susceptibility to infection in humans: an overview.</a> Journal of Endotoxin Research. 11 (6), 333-339 (2005).</li><li>Dobrovolskaia, M. A., Vogel, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll+receptors,+CD14,+and+macrophage+activation+and+deactivation+by+LPS.">Toll receptors, CD14, and macrophage activation and deactivation by LPS.</a> Microbes and Infection. 4 (9), 903-914 (2002).</li><li>US Pharmacopeia. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacterial Endotoxins Test. , (2011).</li><li>FDA, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidance for Industry: Pyrogen and Endotoxins Testing: Questions and Answers. , (2012).</li><li>FDA, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Endotoxin Testing Recommendations for Single-Use Intraocular Ophthalmic Devices. , (2015).</li><li>Fennrich, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+than+70+years+of+pyrogen+detection:+Current+state+and+future+perspectives.">More than 70 years of pyrogen detection: Current state and future perspectives.</a> Alternatives to Laboratory Animals. 44 (3), 239-253 (2016).</li><li>Kumar, M. S., Ghosh, S., Nayak, S., Das, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+biosensor+based+diagnosis+of+urinary+tract+infection.">Recent advances in biosensor based diagnosis of urinary tract infection.</a> Biosensors and Bioelectronics. 80, 497-510 (2016).</li><li>Solano, G., Gomez, A., Leon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+endotoxins+in+equine-derived+snake+antivenoms:+Comparison+of+the+USP+pyrogen+test+and+the+Limulus+Amoebocyte+Lysate+assay+(LAL).">Assessing endotoxins in equine-derived snake antivenoms: Comparison of the USP pyrogen test and the Limulus Amoebocyte Lysate assay (LAL).</a> Toxicon. , 13-18 (2015).</li><li>Akbar John, B., Kamaruzzaman, B. Y., Jalal, K. C. A., Zaleha, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAL+-+a+source+of+bacterial+endotoxin+detector+in+liquid+biological+samples.">TAL - a source of bacterial endotoxin detector in liquid biological samples.</a> International Food Research Journal. 19 (2), 423-425 (2012).</li><li>Fujita, Y., Tokunaga, T., Kataoka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saline+and+buffers+minimize+the+action+of+interfering+factors+in+the+bacterial+endotoxins+test.">Saline and buffers minimize the action of interfering factors in the bacterial endotoxins test.</a> Analytical Biochemistry. 409 (1), 46-53 (2011).</li><li>Dobrovolskaia, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-clinical+immunotoxicity+studies+of+nanotechnology-formulated+drugs:+Challenges,+considerations+and+strategy.">Pre-clinical immunotoxicity studies of nanotechnology-formulated drugs: Challenges, considerations and strategy.</a> Journal of Controlled Release. 220 (Pt B), 571-583 (2015).</li><li>Dobrovolskaia, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ambiguities+in+applying+traditional+Limulus+amebocyte+lysate+tests+to+quantify+endotoxin+in+nanoparticle+formulations.">Ambiguities in applying traditional Limulus amebocyte lysate tests to quantify endotoxin in nanoparticle formulations.</a> Nanomedicine (London). 5 (4), 555-562 (2010).</li><li>Dobrovolskaia, M. A., Neun, B. W., Clogston, J. D., Grossman, J. H., McNeil, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice+of+method+for+endotoxin+detection+depends+on+nanoformulation.">Choice of method for endotoxin detection depends on nanoformulation.</a> Nanomedicine (London). 9 (12), 1847-1856 (2014).</li><li>Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+and+Some+Practical+Solutions+to+Overcome+Nanoparticle+Interference+with+LAL+Assays+and+to+Avoid+Endotoxin+Contamination+in+Nanoformulations.">Considerations and Some Practical Solutions to Overcome Nanoparticle Interference with LAL Assays and to Avoid Endotoxin Contamination in Nanoformulations.</a> Methods in Molecular Biology. 1682, 23-33 (2018).</li><li>Boratynski, J., Szermer-Olearnik, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin+Removal+from+Escherichia+coli+Bacterial+Lysate+Using+a+Biphasic+Liquid+System.">Endotoxin Removal from Escherichia coli Bacterial Lysate Using a Biphasic Liquid System.</a> Methods in Molecular Biology. 1600, 107-112 (2017).</li><li>Li, H., Hitchins, V. M., Wickramasekara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+bacterial+endotoxins+in+ophthalmic+viscosurgical+device+materials+by+direct+analysis+in+real+time+mass+spectrometry.">Rapid detection of bacterial endotoxins in ophthalmic viscosurgical device materials by direct analysis in real time mass spectrometry.</a> Analytica Chimica Acta. 943, 98-105 (2016).</li><li>Uhlig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+3-hydroxy+fatty+acids+as+environmental+markers+of+endotoxin+using+liquid+chromatography+coupled+to+tandem+mass+spectrometry.">Profiling of 3-hydroxy fatty acids as environmental markers of endotoxin using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography A. 1434, 119-126 (2016).</li><li>Smulders, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contamination+of+nanoparticles+by+endotoxin:+evaluation+of+different+test+methods.">Contamination of nanoparticles by endotoxin: evaluation of different test methods.</a> Particle and Fibre Toxicology. 9, 41 (2012).</li><li>. NCL assay cascade Available from: <a target="_blank" href="https://ncl.cancer.gov/resources/assay-cascade-protocols">https://ncl.cancer.gov/resources/assay-cascade-protocols</a> (2015)</li><li>Dobrovolskaia, M. A., Germolec, D. R., Weaver, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+nanoparticle+immunotoxicity.">Evaluation of nanoparticle immunotoxicity.</a> Nature Nanotechnology. 4 (7), 411-414 (2009).</li><li>Borton, L. K., Coleman, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Material-mediated+pyrogens+in+medical+devices:+Applicability+of+the+in+vitro+Monocyte+Activation+Test.">Material-mediated pyrogens in medical devices: Applicability of the in vitro Monocyte Activation Test.</a> Altex. , (2018).</li><li>Stoppelkamp, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speeding+up+pyrogenicity+testing:+Identification+of+suitable+cell+components+and+readout+parameters+for+an+accelerated+monocyte+activation+test+(MAT).">Speeding up pyrogenicity testing: Identification of suitable cell components and readout parameters for an accelerated monocyte activation test (MAT).</a> Drug Testing and Analysis. 9 (2), 260-273 (2017).</li><li>Vipond, C., Findlay, L., Feavers, I., Care, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+the+rabbit+pyrogen+test+for+assessing+meningococcal+OMV+based+vaccines.">Limitations of the rabbit pyrogen test for assessing meningococcal OMV based vaccines.</a> Altex. 33 (1), 47-53 (2016).</li><li>Barenholz, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxil(R)--the+first+FDA-approved+nano-drug:+lessons+learned.">Doxil(R)--the first FDA-approved nano-drug: lessons learned.</a> Journal of Controlled Release. 160 (2), 117-134 (2012).</li><li>Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantitative+evaluation+of+endotoxin+contamination+in+nanoparticle+formulations+by+LAL-based+assays.">Detection and quantitative evaluation of endotoxin contamination in nanoparticle formulations by LAL-based assays.</a> Methods in Molecular Biology. 697, 121-130 (2011).</li><li>FDA, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidance for Industry: Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers. , (2005).</li><li>Mohan, P., Rapoport, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin+as+a+molecular+nanotheranostic+agent:+effect+of+doxorubicin+encapsulation+in+micelles+or+nanoemulsions+on+the+ultrasound-mediated+intracellular+delivery+and+nuclear+trafficking.">Doxorubicin as a molecular nanotheranostic agent: effect of doxorubicin encapsulation in micelles or nanoemulsions on the ultrasound-mediated intracellular delivery and nuclear trafficking.</a> Molecular Pharmaceutics. 7 (6), 1959-1973 (2010).</li><li>Dabbagh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-melting-point+polymeric+nanoshells+for+thermal-triggered+drug+release+under+hyperthermia+condition.">Low-melting-point polymeric nanoshells for thermal-triggered drug release under hyperthermia condition.</a> International Journal of Hyperthermia. 31 (8), 920-929 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimising+the+use+of+commercial+LAL+assays+for+the+analysis+of+endotoxin+contamination+in+metal+colloids+and+metal+oxide+nanoparticles.">Optimising the use of commercial LAL assays for the analysis of endotoxin contamination in metal colloids and metal oxide nanoparticles.</a> Nanotoxicology. 9 (4), 462-473 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+endotoxin+(lipopolysaccharide)+binds+to+the+surface+of+gold+nanoparticles,+interferes+with+biocorona+formation+and+induces+human+monocyte+inflammatory+activation.">Bacterial endotoxin (lipopolysaccharide) binds to the surface of gold nanoparticles, interferes with biocorona formation and induces human monocyte inflammatory activation.</a> Nanotoxicology. 11 (9-10), 1157-1175 (2017).</li></ol>

Informationen i detta protokoll har beskrivits innan15,26 och bygger på flera reglerande dokument som publiceras av oss mat och Drug Administration (FDA eller FDA) och USA farmakopén (USP)4 , 5 , 6 , 27, och finns också på NCL hemsida20 i protokoll STE1.2 (grumlighet LAL), STE1.3 (gel-clot LAL) och STE1.4 (kr...

En endotoxin är en byggsten av gramnegativa bakteriella cellväggen1,2. Det kan aktivera immuncellerna på mycket låg (pikogram) koncentrationer1,2. Den proinflammatoriska mediatorer (cytokiner, leukotriener, eikosanoider, etc.) produceras av celler som svar på en endotoxin ansvarar för feber, hypotoni, hypertoni och mer allvarliga hälsoproblem, inklusive multipel organsvikt 1 , 2 , 3. svårighetsgraden av immunmedierade biverkningar utlöses av endotoxin beror på dess styrka bestäms av endotoxin sammansättning och struktur och mäts i internationella endotoxin enheter (hormonspiral eller EUs)3. Antalet dessa enheter per kilogram kroppsvikt används för att ange en tröskel pyrogent dos endotoxin. Denna dos är 5 EU/kg för läkemedel administreras via alla vägar men intratekal rutten. Läkemedel doseras per kvadratmeter kroppsyta, intraokulära vätskor, radiofarmaka och produkter administreras via intratekal rutten har en olika pyrogent tröskeldos, vilket är 100 EU/m2, 0,2 EU/mL, 175 EU/V (där V är den volymen av den produkt som är avsedd för administrering), 0,2 EU/kg respektive4. Mer information om tröskelvärdet pyrogent dosen för olika läkemedel och enheter tillhandahålls och diskuterade någon annanstans4,5,6.
Djur varierar stort i sin känslighet för endotoxin-medierade reaktioner. Människor, icke-mänskliga primater och kaniner är bland de mest extremt känsliga för endotoxiner3arterna. För att undvika endotoxin-medierade biverkningar hos patienter och förebygga felaktiga slutsatser av preklinisk toxicitet och effektstudier, är det viktigt att exakt identifiera och kvantifiera endotoxiner i både kliniska och prekliniska grade formuleringar. Flera tillgängliga metoder kan uppnå denna uppgift. En av dem är Limulus immobiliserat Lysate (LAL) analysen, som används över hela världen att skärmen biomedicinska produkter för potentiella endotoxin föroreningen samt att upptäcka bakterieinfektioner7,8,9. Den lysate är beredd från amoebocytes presenterar cellerna i blodet hos hästsko krabbor Limulus Polyfemos bosatta i östra stranden av kontinenten av Nordamerika7. Intressant, finns det några olika arter av hästsko krabbor (Tachypleus gigas och Tachypleus tridentatus) i Asien10. Den Tachypleus immobiliserat Lysate (TAL) används i flera asiatiska länder för detektion av endotoxin liknar hur LAL används i andra cuntries10. Lysates (LAL och TAL) innehåller en grupp av proteiner som vid aktivering ger proteas aktivitet. Ett av dessa proteiner, så kallade faktorn C aktiveras vid kontakt med endotoxin. Aktiverad faktor C klyver faktor B, som i sin tur också blir ett proteas och klyver en pro-koagulering enzym för att producera ett enzym som deltar i koagulationen. Resultatet av denna kedja av reaktioner är bildandet av en gel, en ökning av provet turbiditeten och i närvaro av ett kromogent substrat, uppkomsten av en färgad produkt, som tjänar som en grund för gel-propp, grumlighet och kromogen analyser, respektive. Medan det finns ingen obligatorisk LAL-format, den amerikanska Food and Drug Administration (FDA) förklarar i vägledningen för baserat branschen dokument, att vid avvikelser i resultaten mellan olika LAL format, beslutet görs på gel-clot analysen5 .
Många vanliga laboratoriekemikalier (t.ex., EDTA) och känd drog produkter (t ex penicillin) störa LAL analyser11. Störningen är vanligtvis identifieras genom att bedöma återhämtningen av endotoxin standard spetsade på en känd koncentration till en lösning som innehåller testmaterialet. Om den PIK-återhämtningen är mindre än 50% eller mer än 200%, då resultatet av LAL assay för är givet testmaterialet ogiltiga på grund av hämning eller förbättring, respektive4. Nanoteknik-baserade formuleringar är ofta komplexa och störa LAL genom olika mekanismer12,13,14. Många metoder har beskrivits för att övervinna störningen: prov beredning i specifika buffertar och tensider, protein inaktivering av värme, förstörelse av lipid-baserade ihåliga material värme och komplettera provet med överskott divalenta katjoner5,12,13,14,15. Alternativa metoder för situationer när LAL störningar inte kan övervinnas har också beskrivits: ELISA, en HEK-TLR4 reporter cell linje assay och masspektrometri16,17,18, 19.
Häri, beskrivs experimentella rutiner för att bedriva gel-propp, grumlighet och kromogen LAL analyser. Dessa analyser finns också tillgängliga på nanoteknik karakterisering Lab (NCL) webbplats20 i protokoll STE1.2 (grumlighet LAL), STE1.3 (gel-clot LAL) och STE1.4 (kromogen LAL). Det rekommenderas att utföra minst två olika format för att karakterisera samma nano-formulering. När resultaten av grumlighet och kromogen LAL oense, anses gel-clot resultaten5. När resultaten av två LAL format oense, genomfört ytterligare studier med hjälp av antingen monocyt aktiveringen test (MAT) eller kanin pyrogenfri test (RPT) för att verifiera LAL fynd är21. Det är viktigt att notera att varje metod som används för identifiering av endotoxin och oskadlig bedömning har fördelar och begränsningar21,22,23,24. Erkänner begränsningar av det förfarande som används för att karakterisera en given nanoteknik formulering är viktig att få vetenskaplig motivering för användning av förfarandet som är optimal för att nano-formulering.
I denna studie användes pegylerat liposomalt doxorubicin som en modell nanopartiklar formulering. Denna formulering har godkänts av FDA 1995 och används för att behandla cancer patienter världen över25.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Turbidity LAL Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2770</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9892</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL Reagent</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>T0051</td>
			<td>This reagent can be used with turbidity assay only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control Endotoxin Standard</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>E0005</td>
			<td>This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL grade water</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>WP0501</td>
			<td>This reagent can be used with any LAL format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucashield Buffer</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>GB051-25</td>
			<td>Used to prevent false-positive response from beta-glucans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TB240</td>
			<td>These tubes can be used with all three assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TK100</td>
			<td>These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 mL</td>
			<td>RAININ</td>
			<td>PPT25, PPT10</td>
			<td>Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22600044</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-fee combitips, 5mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30089669</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000020</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcetrifuge</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator, 2-8 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer, -20 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>PKF96</td>
			<td>Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromogenic LAL Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrochrome LAL Reagent</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>CG1500-5</td>
			<td>This reagent is specific to the Chromogenic Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control Endotoxin Standard</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>EC010</td>
			<td>This standard is different than that used for turbidity and gel-clot LALs; it is optimized for optimal performance in the chromogenic assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2770</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9892</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL grade water</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>WP0501</td>
			<td>This reagent can be used with any LAL format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucashield Buffer</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>GB051-25</td>
			<td>Used to prevent false-positive response from beta-glucans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TB240</td>
			<td>These tubes can be used with all three assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TK100</td>
			<td>These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 ml</td>
			<td>RAININ</td>
			<td>PPT25, PPT10</td>
			<td>Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22600044</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-fee combitips, 5mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30089669</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000020</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcetrifuge</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator, 2-8 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer, -20 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>PKF96</td>
			<td>Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel-Clot LAL Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL Reagent</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>G5003</td>
			<td>This reagent is specific to the gel-clot assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control Endotoxin Standard</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>E0005</td>
			<td>This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2770</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9892</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL grade water</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>WP0501</td>
			<td>This reagent can be used with any LAL format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucashield Buffer</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>GB051-25</td>
			<td>Used to prevent false-positive response from beta-glucans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TB240</td>
			<td>These tubes can be used with all three assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 10 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TS050</td>
			<td>These tubes are for use with the gel-clot assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1 mL</td>
			<td>RAININ</td>
			<td>PPT25, PPT10</td>
			<td>Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22600044</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-fee combitips, 5mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30089669</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000020</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcetrifuge</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator, 2-8 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer, -20 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath, 37 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used, however, it is important either to switch off water circulation or use non-circualting water bath because water flow will affect clot formation and lead to false-negative results</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of endotoxin in nano-formulations using limulus amoebocyte lysate (lal) assays

När de förekommer i farmaceutiska produkter, en gramnegativa bakteriella cellväggen komponent endotoxin (kallas ofta även lipopolysackarid) kan orsaka inflammation, feber, hypo- eller hypertoni, och, i extrema fall kan leda till vävnader och organ skada som kan bli dödlig. Beloppen för endotoxin i farmaceutiska produkter, därför är strängt reglerade. Bland metoderna som är tillgängliga för endotoxin detektering och kvantifiering används Limulus immobiliserat Lysate (LAL) analysen över hela världen. Medan ett läkemedel kan interferera med LAL analysen, utgör nano-formuleringar en särskild utmaning på grund av deras komplexitet. Syftet med denna uppsats är att tillhandahålla en praktisk guide till forskare oerfarna uppskatta endotoxiner i nanomaterial och nanopartiklar formulerat droger. Häri, diskuteras praktiska rekommendationer för att utföra tre LAL format inklusive grumlighet, kromogen och gel-clot analyser. Dessa analyser kan användas för att fastställa endotoxin angreppet i nanoteknikbaserade läkemedel, vacciner och tillsatsmedel.

Exemplet av data som genereras efter att ha testat denna formulering i LAL analyser visas i tabell 1. Pegylerat liposomalt doxorubicin störde kromogen LAL på utspädning 5. Dock var denna inblandning övervinnas genom större utspädningar. PIK-återhämtningen var mellan 50 och 200% när denna formulering testades på spädningar 50 och 500 i grumlighet och kromogen LAL, liksom på utspädning 5 i grumlighet LAL. Justerat av utspädningsfaktorn, överensstämde resulta...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays at JoVE.com

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Påvisande av endotoxiner i nanomaterial utgör en av de stora utmaningarna inom nanomedicin. Här presenterar vi en fallstudie som beskriver ramen består av tre olika LAL format att uppskatta potentiella endotoxin kontaminering i nanopartiklar.

Påvisande av Endotoxin i Nano-formuleringar använder Limulus immobiliserat Lysate (LAL) analyser

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Denna metod kan hjälpa till att svara på det medicinska området om säkerhet för nanoläkemedel. Fördelarna med denna teknik är att det är standard, och används över hela världen för utvärdering av produkter, Till nano läkemedel. Demonstration av förfarandet, kommer att Vara Barry Neun, på Nano Technology Characterization Lab.För kalibrering standard beredning, använd 900 mikroliter av limulus amebocyte lysate, eller LAL grade vatten. Och 100 mikroliter av kontroll standard endotoxin, att förbereda så många mellanliggande utspädningar som behövs, för att möjliggöra utarbetandet av en kalibrering standard med en koncentration av en endotoxin enhet per milliliter. Sedan med hjälp av 900 mikroliter av LAL-kvalitet vatten, och 100 mikroliter av en endotoxin enhet per milliliter kalibrering standard, förbereda en andra kalibrering standard, vid en koncentration av 0,1 endotoxin enhet per milliliter.Upprepa sedan den seriella tiofaldig utspädning för att förbereda två lägre kalibreringsstandarder. Att få totalt fyra kalibreringsstandarder, alltifrån 0001 till en endotoxinenhet per milliliter. För att förbereda en 05 endotoxin enhet per milliliter kvalitetskontroll, kombinerar 50 mikroliter av en endotoxin enhet per milliliter av kontroll standard endotoxin lösning, med 950 mikroliter av LAL-kvalitet vatten.Nästa i programvaran väljer instrumentinställningarna, och skapa mallen. Välj samla in data, och ange test-ID och datagrupp i den allmänna fliken. Under fliken maskinvara väljer du instrumenttyp, och LAL-metoden, och kontrollerar att ett serienummer, system-ID och den seriella portinformationen visas på skärmen.Klicka på okej två gånger för att bekräfta instrumentvalet, och kommunikationen med instrumentet, och ange prov-ID:t i samma ordning att proverna ska testas. Använd sedan standardknapparna för att ange den negativa kontrollstandardkurvan, och testa prov. Lägg till lämplig volym av standarder för kalibrering av negativ kontroll, och kvalitetskontroll i dubbla förmärkta glasrör.Och lägg till lämplig volym LAL till det första testet vidriga. Vortexa den avskyvärda kort, och placera injektionsflaskan i lämpliga tester slitsar i instrumentet karusellen. Innan du laddar proverna, utför flera spädningar av testnana-materialet inom den maximala giltiga utspädningen som påvisas.För att förbereda en 05 endotoxinenhet per milliliter av inhibitionsförstärkningskontroll, kombinera 25 mikroliter av den ena endotoxinenheten per milliliter av kontrollstandard endotoxinlösning, med 475 mikroliter av testnannasmaterialet vid en given utspädning. Efter virvelning, ladda lämpliga innovationsförstärkningskontroller, och de unspiked studieproverna i instrumentet. Sedan alikvot unspiked och spetsade nano material vid en specifik utspädning i pre märkta rör.Innan virvelning, och lastning i instrumentet karusellen. För att utföra en Gel-Clot LAL, förbereda kontroll standard endotoxin till en slutlig koncentration av fyra lambda, och kombinera 100 mikroliter av standard, med 100 mikroliter vatten, eller testprov för att uppnå en slutlig koncentration av kontroll standard endotoxin två lambda. Tillsätt 100 mikroliter Lysin till varje lambdautspädning.Vortexa rören kort, och placera rack av rör i en 37 graders Celsius vattenbad i en timme. I slutet av inkubationen, invertera rören med en smidig rörelse, och manuellt registrera resultaten med plus för en fast propp, och minus för ingen propp, eller en lös propp. I denna representativa analys, PEGylated liposomal doxorubicin stört kromogena LAL vid utspädning fem, var dock denna inblandning övervinnas vid högre utspädningar.Spike återhämtning var mellan 50 och 200%när formuleringen testades vid spädningar 50 och 500 i grumlighet och kromogena LAL, samt vid spädning fem, i grumlighet LAL. När justeras av utspädningsfaktorn var resultaten konsekventa mellan vanföreställningar i båda uppsatserna. Dessutom var resultaten konsekventa mellan de tre uppsatsformaten.Kom ihåg att varje prov har sitt eget utbud av utspädningar, varje LAL-format använder sin kontrollstandard i doxin och lysate, och att de rör som används för att förbereda utspädningarna, och att utföra en reaktion på olika för varje LAL uppsats. För detta förfarande andra metoder som Kan utföras för att svara på ytterligare frågor om material Efter dess utveckling, banade denna teknik vägen för suturer och området nano medicin, att utforska de medicinska tillämpningarna av nano-teknik formulerade läkemedel hos människor, och kliniska modeller inklusive men inte begränsat till icke mänskliga primater, kaniner, hundar, och råttor. Glöm inte att arbeta med doxin kan vara extremt farligt och försiktighetsåtgärder såsom att bära personlig skyddsutrustning, bör alltid vidtas när du utför denna procedur.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Utveckla anpassade kinesisk hamster-host cellprotein analyser med hjälp av akustisk teknik Membran mikropartikelenzymimmunoassay

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

Tillverkning av elektrokemiska-DNA biosensorer för att Reagentless Upptäckt av nukleinsyror, proteiner och små molekyler

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Detection and Isolation of Circulating Melanoma Cells using Photoacoustic Flowmetry

Upptäckt och isolering av cirkulerande melanomceller med photoacoustic Flowmetry

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed ...

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

Bakteriell Detection &amp; identifiering med elektrokemiska sensorer

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Böjstyvhet Mätningar av Biopolymerer Använda Gliding Analyser

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

Anatomical Reconstructions of the Human Cardiac Venous System using Contrast-computed Tomography of Perfusion-fixed Specimens

Anatomiska Rekonstruktioner av Human Cardiac vensystemet med Contrast-datortomografi av Perfusion-fasta prover

A detailed  understanding of the complexity and relative variability within the human  cardiac venous system is crucial for the development of cardiac ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Bead aggregeringsanalyser för karakterisering av Förmodade celladhesionsmolekyler

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Ögonirritationstest (EIT) för Hazard Identifiering av Eye irriterande kemikalier med hjälp av rekonstruerad Human Cornea liknande Epithelial (RHCE) Tissue Modell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Label-fri enda molekyl Detection Använda Microtoroid optiska resonatorer

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Multifluorescensdetektion för dropp Mikrofluidik Använda optiska fibrer

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...