Name: detection of endotoxin in nano-formulations using limulus amoebocyte lysate (lal) assays
Uploaded: 2019-01-30T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays at JoVE.com

Çalışma federal fonların Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından desteklenen Ulusal Sağlık Enstitüleri, sözleşmeli HHSN261200800001E. Bu yayın içeriğini sayısı veya ilkeleri, bölümü sağlık ve insan Hizmetleri yansıtmayabilir ne ticari adlarını, ticari ürünler, söz etmez veya kuruluşların ABD hükümeti tarafından onaylandığı anlamına.

1. hazırlanması nanopartikül örnekleri
<ol><li>LAL çalışma örnek sınıf su hazırlamak.</li>
	<li>Örnek pH 6-8 aralığının dışında ise, pH pyrogen ücretsiz sodyum hidroksit veya hidroklorik asit kullanarak ayarlayın.</li>
	<li>LAL kullanarak sınıf su çalışma örneği birkaç dilutions hazır olun. En yüksek seyreltme en fazla geçerli seyreltme (MVD) fazla olamaz emin olun. MVD tahmini hakkında ayrıntılı bilgi için tartışma bölümüne bakın.</li>
</ol>2. LAL format...

<ol>
	<li>Perkins, D. J., Patel, M. C., Blanco, J. C., Vogel, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+Mechanisms+Governing+Innate+Inflammatory+Responses.">Epigenetic Mechanisms Governing Innate Inflammatory Responses.</a> Journal of Interferon &amp; Cytokine Research. 36 (7), 454-461 (2016).</li><li>Vogel, S. N., Awomoyi, A. A., Rallabhandi, P., Medvedev, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+TLR4+signaling+that+lead+to+increased+susceptibility+to+infection+in+humans:+an+overview.">Mutations in TLR4 signaling that lead to increased susceptibility to infection in humans: an overview.</a> Journal of Endotoxin Research. 11 (6), 333-339 (2005).</li><li>Dobrovolskaia, M. A., Vogel, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll+receptors,+CD14,+and+macrophage+activation+and+deactivation+by+LPS.">Toll receptors, CD14, and macrophage activation and deactivation by LPS.</a> Microbes and Infection. 4 (9), 903-914 (2002).</li><li>US Pharmacopeia. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacterial Endotoxins Test. , (2011).</li><li>FDA, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidance for Industry: Pyrogen and Endotoxins Testing: Questions and Answers. , (2012).</li><li>FDA, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Endotoxin Testing Recommendations for Single-Use Intraocular Ophthalmic Devices. , (2015).</li><li>Fennrich, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+than+70+years+of+pyrogen+detection:+Current+state+and+future+perspectives.">More than 70 years of pyrogen detection: Current state and future perspectives.</a> Alternatives to Laboratory Animals. 44 (3), 239-253 (2016).</li><li>Kumar, M. S., Ghosh, S., Nayak, S., Das, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+biosensor+based+diagnosis+of+urinary+tract+infection.">Recent advances in biosensor based diagnosis of urinary tract infection.</a> Biosensors and Bioelectronics. 80, 497-510 (2016).</li><li>Solano, G., Gomez, A., Leon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+endotoxins+in+equine-derived+snake+antivenoms:+Comparison+of+the+USP+pyrogen+test+and+the+Limulus+Amoebocyte+Lysate+assay+(LAL).">Assessing endotoxins in equine-derived snake antivenoms: Comparison of the USP pyrogen test and the Limulus Amoebocyte Lysate assay (LAL).</a> Toxicon. , 13-18 (2015).</li><li>Akbar John, B., Kamaruzzaman, B. Y., Jalal, K. C. A., Zaleha, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAL+-+a+source+of+bacterial+endotoxin+detector+in+liquid+biological+samples.">TAL - a source of bacterial endotoxin detector in liquid biological samples.</a> International Food Research Journal. 19 (2), 423-425 (2012).</li><li>Fujita, Y., Tokunaga, T., Kataoka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saline+and+buffers+minimize+the+action+of+interfering+factors+in+the+bacterial+endotoxins+test.">Saline and buffers minimize the action of interfering factors in the bacterial endotoxins test.</a> Analytical Biochemistry. 409 (1), 46-53 (2011).</li><li>Dobrovolskaia, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-clinical+immunotoxicity+studies+of+nanotechnology-formulated+drugs:+Challenges,+considerations+and+strategy.">Pre-clinical immunotoxicity studies of nanotechnology-formulated drugs: Challenges, considerations and strategy.</a> Journal of Controlled Release. 220 (Pt B), 571-583 (2015).</li><li>Dobrovolskaia, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ambiguities+in+applying+traditional+Limulus+amebocyte+lysate+tests+to+quantify+endotoxin+in+nanoparticle+formulations.">Ambiguities in applying traditional Limulus amebocyte lysate tests to quantify endotoxin in nanoparticle formulations.</a> Nanomedicine (London). 5 (4), 555-562 (2010).</li><li>Dobrovolskaia, M. A., Neun, B. W., Clogston, J. D., Grossman, J. H., McNeil, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice+of+method+for+endotoxin+detection+depends+on+nanoformulation.">Choice of method for endotoxin detection depends on nanoformulation.</a> Nanomedicine (London). 9 (12), 1847-1856 (2014).</li><li>Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+and+Some+Practical+Solutions+to+Overcome+Nanoparticle+Interference+with+LAL+Assays+and+to+Avoid+Endotoxin+Contamination+in+Nanoformulations.">Considerations and Some Practical Solutions to Overcome Nanoparticle Interference with LAL Assays and to Avoid Endotoxin Contamination in Nanoformulations.</a> Methods in Molecular Biology. 1682, 23-33 (2018).</li><li>Boratynski, J., Szermer-Olearnik, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin+Removal+from+Escherichia+coli+Bacterial+Lysate+Using+a+Biphasic+Liquid+System.">Endotoxin Removal from Escherichia coli Bacterial Lysate Using a Biphasic Liquid System.</a> Methods in Molecular Biology. 1600, 107-112 (2017).</li><li>Li, H., Hitchins, V. M., Wickramasekara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+bacterial+endotoxins+in+ophthalmic+viscosurgical+device+materials+by+direct+analysis+in+real+time+mass+spectrometry.">Rapid detection of bacterial endotoxins in ophthalmic viscosurgical device materials by direct analysis in real time mass spectrometry.</a> Analytica Chimica Acta. 943, 98-105 (2016).</li><li>Uhlig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+3-hydroxy+fatty+acids+as+environmental+markers+of+endotoxin+using+liquid+chromatography+coupled+to+tandem+mass+spectrometry.">Profiling of 3-hydroxy fatty acids as environmental markers of endotoxin using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography A. 1434, 119-126 (2016).</li><li>Smulders, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contamination+of+nanoparticles+by+endotoxin:+evaluation+of+different+test+methods.">Contamination of nanoparticles by endotoxin: evaluation of different test methods.</a> Particle and Fibre Toxicology. 9, 41 (2012).</li><li>. NCL assay cascade Available from: <a target="_blank" href="https://ncl.cancer.gov/resources/assay-cascade-protocols">https://ncl.cancer.gov/resources/assay-cascade-protocols</a> (2015)</li><li>Dobrovolskaia, M. A., Germolec, D. R., Weaver, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+nanoparticle+immunotoxicity.">Evaluation of nanoparticle immunotoxicity.</a> Nature Nanotechnology. 4 (7), 411-414 (2009).</li><li>Borton, L. K., Coleman, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Material-mediated+pyrogens+in+medical+devices:+Applicability+of+the+in+vitro+Monocyte+Activation+Test.">Material-mediated pyrogens in medical devices: Applicability of the in vitro Monocyte Activation Test.</a> Altex. , (2018).</li><li>Stoppelkamp, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speeding+up+pyrogenicity+testing:+Identification+of+suitable+cell+components+and+readout+parameters+for+an+accelerated+monocyte+activation+test+(MAT).">Speeding up pyrogenicity testing: Identification of suitable cell components and readout parameters for an accelerated monocyte activation test (MAT).</a> Drug Testing and Analysis. 9 (2), 260-273 (2017).</li><li>Vipond, C., Findlay, L., Feavers, I., Care, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+the+rabbit+pyrogen+test+for+assessing+meningococcal+OMV+based+vaccines.">Limitations of the rabbit pyrogen test for assessing meningococcal OMV based vaccines.</a> Altex. 33 (1), 47-53 (2016).</li><li>Barenholz, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxil(R)--the+first+FDA-approved+nano-drug:+lessons+learned.">Doxil(R)--the first FDA-approved nano-drug: lessons learned.</a> Journal of Controlled Release. 160 (2), 117-134 (2012).</li><li>Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantitative+evaluation+of+endotoxin+contamination+in+nanoparticle+formulations+by+LAL-based+assays.">Detection and quantitative evaluation of endotoxin contamination in nanoparticle formulations by LAL-based assays.</a> Methods in Molecular Biology. 697, 121-130 (2011).</li><li>FDA, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidance for Industry: Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers. , (2005).</li><li>Mohan, P., Rapoport, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin+as+a+molecular+nanotheranostic+agent:+effect+of+doxorubicin+encapsulation+in+micelles+or+nanoemulsions+on+the+ultrasound-mediated+intracellular+delivery+and+nuclear+trafficking.">Doxorubicin as a molecular nanotheranostic agent: effect of doxorubicin encapsulation in micelles or nanoemulsions on the ultrasound-mediated intracellular delivery and nuclear trafficking.</a> Molecular Pharmaceutics. 7 (6), 1959-1973 (2010).</li><li>Dabbagh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-melting-point+polymeric+nanoshells+for+thermal-triggered+drug+release+under+hyperthermia+condition.">Low-melting-point polymeric nanoshells for thermal-triggered drug release under hyperthermia condition.</a> International Journal of Hyperthermia. 31 (8), 920-929 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimising+the+use+of+commercial+LAL+assays+for+the+analysis+of+endotoxin+contamination+in+metal+colloids+and+metal+oxide+nanoparticles.">Optimising the use of commercial LAL assays for the analysis of endotoxin contamination in metal colloids and metal oxide nanoparticles.</a> Nanotoxicology. 9 (4), 462-473 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+endotoxin+(lipopolysaccharide)+binds+to+the+surface+of+gold+nanoparticles,+interferes+with+biocorona+formation+and+induces+human+monocyte+inflammatory+activation.">Bacterial endotoxin (lipopolysaccharide) binds to the surface of gold nanoparticles, interferes with biocorona formation and induces human monocyte inflammatory activation.</a> Nanotoxicology. 11 (9-10), 1157-1175 (2017).</li></ol>

Bu protokol için sağlanan bilgi15,26 daha önce açıklanan ve ABD Gıda ve İlaç İdaresi (FDA bize veya FDA) ve Amerika Birleşik Devletleri Pharmacopoeia (USP)4 tarafından yayımlanan farklı düzenleyici belgelere dayanan , 5 , 6 , 27ve kullanılabilir protokolleri STE1.2 (bulanıklık LAL), STE1.3 (jel-pıhtı LAL) NCL Web site...

Bir endotoksin Ayagin Gram-negatif bakteri hücre duvarı1,2bir yapı taşıdır. Daha çok, bağışıklık hücreleri etkinleştirebilirsiniz düşük (picogram) konsantrasyonları1,2. Yanıt olarak bir endotoksin hücreleri tarafından üretilen proinflamatuar aracıların (sitokinler, lökotrienler, eikozanoidler, vb) ateş, hipotansiyon, hipertansiyon ve birden fazla organ yetmezliği gibi daha ciddi sağlık sorunları sorumlu 1 , 2 , 3. immün aracılı yan etkileri-endotoksin tarafından tetiklenen önem endotoksin kompozisyon ve yapısına göre belirlenen ve uluslararası endotoksin birimleri (IUS veya EUs)3' te ölçülen onun etki gücüne bağlıdır. Bu birim vücut ağırlığının kilogram başına endotoksin eşik pyrogenic doz ayarlamak için kullanılır. Bu doz intratekal rota ama tüm yolları üzerinden 5 EU/kg ilaç ürünleri için yönetilen değil. Vücut yüzeyi, göz içi sıvı, Radyofarmasötikler ve ürünleri yönetilen yolu ile intratekal rota metrekare doz uyuşturucu var 100 EU/m2, 0.2 EU/mL, 175 EU/V bir farklı eşik pyrogenic doz (V nerede birim yönetimi için tasarlanmış ürün) ve 0,2 EU/kg, sırasıyla4. Eşik pyrogenic doz için çeşitli ilaç ürünleri ve aygıtlar hakkında daha fazla bilgi sağlanır ve başka bir yerde ele4,5,6.
Hayvanlar onların duyarlılık reaksiyonları endotoksin-aracılı değişkenlik. İnsan, insan dışı primatlar ve tavşan endotoxins3' e en son derece hassas türler arasındadır. Hastalarda endotoksin-aracılı yan etkilerinden kaçınmak ve yanlış sonuçlara preklinik toksisite ve etkinlik çalışmaları engellemek için doğru algılamak ve her iki klinik ve önceden klinik sınıf formülasyonları endotoxins ölçmek için önemlidir. Birkaç mevcut Yöntem bu görevi elde edebilirsiniz. Yaygın olarak tüm dünyada ekran Biyomedikal ürünler bakteriyel enfeksiyonlar7,8,9algılamak için potansiyel endotoksin kirlenme de için için kullanılır Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) tahlil onlardan biri. Lysate amoebocytes hazırlanır, at nalı yengeç Limulus polyphemus kan hücreleri mevcut Kuzey Amerika7kıta Doğu kıyısında bulunan. İlginçtir, at nalı yengeçler birkaç farklı türleri vardır (Tachypleus gigas ve Tachypleus tridentatus) Asya10. Tachypleus Amoebocyte Lysate (TAL) birçok Asya ülkesinde endotoksin nasıl LAL diğer cuntries10dakika sonra kullanılır benzer tespiti için kullanılır. Lysates (LAL ve TAL) etkinleştirme üzerine proteaz aktivitesi görüşmek proteinleri bir grup içerir. Bu proteinler, sözde faktör C birini endotoksin ile temas üzerine devreye girer. Aktif faktör C faktörü B, hangi sırayla da bir proteaz olur ve pıhtılaşma enzim üretmek için bir pro-pıhtılaşma enzim cleaves cleaves. Bu zincir reaksiyonların bir jel, artış örnek bulanıklık içinde ve chromogenic substrat, jel-pıhtı, bulanıklık ve chromogenic deneyleri için bir temel olarak hizmet bir renkli ürün görünümünü huzurunda oluşumu sonucudur, anılan sıraya göre. ABD Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) açıklar için sağlanan bilgilerde açıklanan hiçbir zorunlu LAL biçimi ise sanayi belgesi, test sonuçlarını farklı LAL formatları arasında tutarsızlık durumunda karar verdi jel-pıhtı tahlil5 temel .
Çok yaygın olarak kullanılan laboratuvar kimyasalları (Örn., EDTA) ve ürünleri (Örneğin, penisilin) müdahale LAL ile bilinen ilaç deneyleri11. Girişim genellikle standart endotoksin kurtarılması, bilinen bir konsantrasyon test materyalini içeren bir çözüm içine çivili değerlendirmek tarafından tanımlanır. Spike kurtarma % 50 daha az veya fazla %200, ise o zaman LAL sonucu tahlil için verilen test materyalini inhibisyon veya geliştirme, sırasıyla4nedeniyle geçersiz. Nanoteknoloji tabanlı formülasyonları genellikle karmaşık ve LAL mekanizmaları12,13,14çeşitli engel. Girişim üstesinden gelmek için pek çok yaklaşım tarif var: örnek rekonstitüsyon özel arabellekleri ve yüzey, protein inactivation Isıtma, Isıtma ve aşırı örnekle ilave lipid tabanlı içi boş malzemeler imha tarafından divalent katyonlar5,12,13,14,15. Ne zaman LAL girişim üstesinden olamaz durumlar için alternatif yöntemler Ayrıca tarif edilmiştir: ELISA, HEK-TLR4 muhabiri hücre satır tahlil ve kütle spektrometresi16,17,18, 19.
Burada, jel-pıhtı, bulanıklık ve chromogenic LAL deneyleri yürütmek için deneysel yordamlar açıklanmıştır. Bu deneyleri de protokolleri STE1.2 (bulanıklık LAL), STE1.3 (jel-pıhtı LAL) Nanoteknoloji karakterizasyon Laboratuvarı (NCL) Web sitesi20 mevcuttur ve STE1.4 (chromogenic LAL). Bu aynı nano-formülasyonu karakterize etmek için en az iki farklı biçimleri yapmak için tavsiye edilir. Bulanıklık ve chromogenic LAL sonuçlarını katılmıyorum, jel-pıhtı sonuçları5kabul edilir. Ne zaman sonuçları iki LAL biçimlerinin katılmıyorum, ek çalışmalar LAL doğrulamak için monosit harekete geçirmek testi (MAT) veya tavşan pyrogen testi (RPT) kullanarak bulgulardir21yaptı. Her yöntemin endotoksin algılama için kullanılan ve pyrogenicity değerlendirme21,22,23,24avantajları ve sınırlamalar vardır unutmamak gerekir. Verilen nanoteknoloji formülasyonu karakterize etmek için kullanılan yordam sınırlamaları kabul ederek bu nano-formülasyon için en uygun yordamı kullanmak için bilimsel gerekçesi elde etmek için esastır.
Bu çalışmada, pegile liposomal doksorubisin modeli nanopartikül formülasyonu kullanıldı. Bu formülasyon 1995'te bize FDA tarafından onaylanmış ve kanser hastaları dünya çapında25tedavi etmek için kullanılır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Turbidity LAL Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2770</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9892</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL Reagent</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>T0051</td>
			<td>This reagent can be used with turbidity assay only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control Endotoxin Standard</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>E0005</td>
			<td>This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL grade water</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>WP0501</td>
			<td>This reagent can be used with any LAL format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucashield Buffer</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>GB051-25</td>
			<td>Used to prevent false-positive response from beta-glucans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TB240</td>
			<td>These tubes can be used with all three assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TK100</td>
			<td>These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 mL</td>
			<td>RAININ</td>
			<td>PPT25, PPT10</td>
			<td>Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22600044</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-fee combitips, 5mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30089669</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000020</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcetrifuge</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator, 2-8 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer, -20 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>PKF96</td>
			<td>Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromogenic LAL Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrochrome LAL Reagent</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>CG1500-5</td>
			<td>This reagent is specific to the Chromogenic Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control Endotoxin Standard</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>EC010</td>
			<td>This standard is different than that used for turbidity and gel-clot LALs; it is optimized for optimal performance in the chromogenic assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2770</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9892</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL grade water</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>WP0501</td>
			<td>This reagent can be used with any LAL format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucashield Buffer</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>GB051-25</td>
			<td>Used to prevent false-positive response from beta-glucans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TB240</td>
			<td>These tubes can be used with all three assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TK100</td>
			<td>These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 ml</td>
			<td>RAININ</td>
			<td>PPT25, PPT10</td>
			<td>Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22600044</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-fee combitips, 5mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30089669</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000020</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcetrifuge</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator, 2-8 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer, -20 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>PKF96</td>
			<td>Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel-Clot LAL Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL Reagent</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>G5003</td>
			<td>This reagent is specific to the gel-clot assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control Endotoxin Standard</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>E0005</td>
			<td>This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2770</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9892</td>
			<td>When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAL grade water</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>WP0501</td>
			<td>This reagent can be used with any LAL format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucashield Buffer</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>GB051-25</td>
			<td>Used to prevent false-positive response from beta-glucans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TB240</td>
			<td>These tubes can be used with all three assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 10 x 75 mm</td>
			<td>Associates of Cape Cod</td>
			<td>TS050</td>
			<td>These tubes are for use with the gel-clot assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1 mL</td>
			<td>RAININ</td>
			<td>PPT25, PPT10</td>
			<td>Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22600044</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen-fee combitips, 5mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30089669</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat pipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000020</td>
			<td>Other equivalent supplies can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcetrifuge</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator, 2-8 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer, -20 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath, 37 C</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used, however, it is important either to switch off water circulation or use non-circualting water bath because water flow will affect clot formation and lead to false-negative results</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of endotoxin in nano-formulations using limulus amoebocyte lysate (lal) assays

Varsa ilaç ürünlerinde (sık sık da lipopolysaccharide denir) gram-negatif bakteri hücre duvarı bileşeni endotoksin inflamasyon, ateş, hipo - veya hipertansiyon neden olabilir ve, aşırı durumlarda olabilir doku ve organ hasarı için neden olabilir ölümcül olur. Bu nedenle, eczacılık ürünleri, endotoksin miktarda kesinlikle düzenlenmektedir. Arasında için kullanılabilen yöntemleri endotoksin algılama ve miktar, Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) tahlil dünya çapında yaygın olarak kullanılır. Herhangi bir ilaç ürün LAL tahlil ile müdahale ederken, nano-formülasyonları kendi karmaşıklığı nedeniyle belirli bir meydan okuma temsil eder. Bu yazının amacı araştırmacılar endotoxins mühendislik Nanomalzemeler ve uyuşturucu nanopartikül formüle tahmininde deneyimsiz için pratik bir rehber sağlamaktır. Burada, bulanıklık, chromogenic dahil olmak üzere üç LAL biçimleri ve jel-pıhtı testleri gerçekleştirmek için pratik öneriler ele alınmıştır. Bu deneyleri endotoksin kirlenme nanoteknoloji tabanlı ilaç ürünleri, aşılar ve adjuvan belirlemek için kullanılabilir.

Bu formülasyon LAL deneyleri içinde test ettikten sonra oluşturulan veri örneği Tablo 1' de gösterilen. Pegile liposomal doksorubisin chromogenic LAL seyreltme 5, müdahale. Ancak, bu girişim büyük dilutions tarafından üstesinden oldu. Spike kurtarma 50 ile % 200 arasında bu formülasyon dilutions 50 ve 500 bulanıklık ve chromogenic LAL yanı sıra, seyreltme 5 bulanıklık LAL olarak test edildi zamandı. Seyreltme faktörü ayarlandığında sonuçları he...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays at JoVE.com

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Endotoxins mühendislik Nanomalzemeler içinde tespiti nanomedicine alanında büyük zorluklardan biri temsil eder. Burada, nano tanecikleri potansiyel endotoksin kirlenme tahmin etmek için üç farklı biçimlerinin LAL oluşan çerçeve açıklar bir örnek çalışma mevcut.

Nano-formülasyonları endotoksin tespiti Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) deneyleri kullanarak

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Bu yöntem nano ilaçların güvenliği hakkında tıbbi alanda cevap yardımcı olabilir. Bu tekniğin avantajları standart olmasıdır, ve ürünlerin değerlendirilmesi için dünya çapında kullanılan, nano ilaçlar için. Prosedürün tanıtımı, Barry Neun, Nano Teknoloji Karakterizasyon Laboratuvarı'nda olacak.Kalibrasyon standardı nahazırlık için 900 mikrolitre limulus amebocyte lysate veya LAL sınıfı su kullanın. Ve kontrol standart endotoksin 100 mikrolitre, gerektiği kadar ara seyreltme hazırlamak için, mililitre başına bir endotoksin birimi konsantrasyonu ile bir kalibrasyon standardı hazırlanmasını sağlamak için. Sonra 900 lal sınıf su mikrolitre kullanarak, ve mililitre kalibrasyon standardı başına bir endotoksin birim 100 mikrolitre, mililitre başına 0.1 endotoksin birimi konsantrasyonu ile ikinci bir kalibrasyon standardı hazırlamak.Daha sonra iki daha düşük kalibrasyon standardı hazırlamak için seri on kat seyreltme tekrarlayın. Mililitre başına 0001 ile bir endotoksin ünitesi arasında değişen toplam dört kalibrasyon standardı elde etmek için. Mililitre kalite kontrolü başına 05 endotoksin birimi hazırlamak için, kontrol standart endotoksin çözeltisinin mililitre başına bir endotoksin ünitesinin 50 mikrolitresini, 950 mikrolitre LAL sınıfı su ile birleştirir.Yazılımda sonraki araç ayarlarını seçin ve şablonu oluşturun. Veri topla'yı seçin ve genel sekmeye test kimliği ve veri grubunu girin. Donanım sekmesinin altında, enstrüman türünü ve LAL yöntemini seçin ve ekranda bir seri numarası, sistem kimliği ve seri bağlantı noktası bilgilerinin göründüğünü doğrulayın.Cihaz seçimini ve cihazla iletişimi onaylamak için iki kez tamam'ı tıklatın ve örnek kimliği örneklerin test edeceği sırayla girin. Ardından negatif denetim standart eğrisini girmek ve örnekleri test etmek için varsayılan düğmeleri kullanın. Yinelenen önceden etiketlenmiş cam tüplere uygun negatif kontrol kalibrasyon standartlarını ve kalite kontrolünü ekleyin.Ve ilk test aşağılık IÇIN LAL uygun hacmi ekleyin. Kısa bir süre aşağılık girdap ve alet atlıkarınca uygun test yuvaları içine şişe yerleştirin. Numuneleri yüklemeden önce, test nano malzemenin gösterildiği gibi maksimum geçerli seyreltme içinde birkaç seyreltme gerçekleştirin.İnhibisyon geliştirme kontrolü mililitre başına 05 endotoksin birimi hazırlamak için, kontrol standart endotoksin çözeltisinin mililitre başına bir endotoksin biriminin 25 mikrolitrebirleştirmek, belirli bir seyreltme test nano malzemenin 475 mikrolitre ile. Girdap tan sonra, uygun yenilik geliştirme kontrollerini ve çivilenmemiş çalışma örneklerini cihaza yükleyin. Sonra aliquot unspiked ve önceden etiketli tüpler içine belirli bir seyreltme çivili nano malzemeler.Girdap önce, ve alet atlıkarınca içine yükleme. Bir Jel-Pıhtı LAL gerçekleştirmek için, dört lambda son konsantrasyoniçin kontrol standart endotoksin hazırlamak, ve standart 100 mikrolitre birleştirmek, su 100 mikrolitre ile, ya da test örneği kontrol standart endotoksin iki lambda nihai konsantrasyon elde etmek için. Her lambda seyreltme için Lizin 100 mikrolitre ekleyin.Girdap tüpler kısaca, ve bir saat için 37 derece santigrat su banyosu içine tüplerin raf yerleştirin. Kuluçka sonunda, tüpleri düzgün bir hareketle ters çevirin ve sonuçları sıkı bir pıhtı için artı kullanarak elle kaydedin ve pıhtı veya gevşek pıhtı için eksi. Bu temsili analizde, PEGylated lipozomal doksorubisin seyreltme beş kromojenik LAL ile müdahale, ancak bu girişim yüksek seyreltme üstesinden gelindi.Formülasyon bulanıklık ve kromojenik LAL'de 50 ve 500 seyreltmelerde test edildiğinde ve seyreltme beşinde, bulanıklalalırken %50 ile %200 arasındaydı. Seyreltme faktörüne göre ayarlandığında, sonuçlar her iki denemede de sanrılar arasında tutarlıydı. Ayrıca, sonuçlar üç kompozisyon biçimleri arasında tutarlı idi.Her numunenin kendi seyreltme aralığına sahip olduğunu, her LAL biçiminin doksin ve lysate'de kendi kontrol standardını kullandığını ve seyreltmeleri hazırlamak için kullanılan tüplerin her LAL denemesi için farklı bir reaksiyon gerçekleştirdiğini unutmayın. Bu işlem için malzeme ile ilgili ek soruları cevaplamak için can gibi diğer yöntemler geliştirildikten sonra, bu teknik dikişler ve nano tıp alanında, nano teknoloji insanlarda formüle edilen ilaçların tıbbi uygulamaları keşfetmek için önünü açtı ve dahil ancak insan olmayan primatlar, tavşanlar, köpekler ve sıçanlar ile sınırlı olmamak üzere klinik modeller. Doksin ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve kişisel koruyucu ekipman takmak gibi önlemlerin bu işlemi gerçekleştirirken her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Akustik Membran mikropartikül Teknoloji Geliştirme Özel Çin Hamsteri Yumurtalık-host Hücre Proteini Tahliller

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

Nükleik Asitler, Proteinler ve Küçük Moleküller Reagentless Algılama Elektrokimyasal DNA Biyosensörler Fabrikasyon

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Detection and Isolation of Circulating Melanoma Cells using Photoacoustic Flowmetry

Sirkülasyon Melanom Hücreler foto akustik flowmetre kullanarak Algılama ve İzolasyonu

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed ...

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

Elektrokimyasal Sensörler kullanarak Bakteriyel Algılama ve Tanıma

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Kayma Tahliller kullanma Biyopolimerler eğilme Katılığı Ölçümleri

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

Anatomical Reconstructions of the Human Cardiac Venous System using Contrast-computed Tomography of Perfusion-fixed Specimens

Kontrast-bilgisayarlı Perfüzyon-sabit Örneklerinin Tomografi kullanarak İnsan Kardiyak Venöz Sistemi anatomik yeniden düzenlemesi

A detailed  understanding of the complexity and relative variability within the human  cardiac venous system is crucial for the development of cardiac ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Putatif Hücre yapışma molekülleri Karakterizasyonu için Boncuk Toplama Tahliller

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Yeniden İnşa İnsan Kornea gibi Epitelyal (RHCE) Doku Modeli kullanılarak Göz tahriş Kimyasalların Tehlike Tanımlaması Göz tahrişi Testi (EIT)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Microtoroid Optik Rezonatörler Kullanarak Etiket serbest Tek Molekül Algılama

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Damlacık Mikroakiskan için renkli Floresan Algılama Optik Elyaf kullanma

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...