Name: simultaneous measurements of intracellular calcium and membrane potential in freshly isolated and intact mouse cerebral endothelium
Uploaded: 2019-01-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium at JoVE.com

ونحن نشكر تشارلز هويت للمساعدة التقنية ممتازة حين وضع المعدات واللوازم الضرورية للبروتوكولات الحالية. ونحن نشكر الدكتور شون م. ويلسون وكريستوفر ويلسون، من مركز LLU "علم الأحياء في الفترة المحيطة بالولادة"، لتزويدنا بالمجهر المقلوب إضافية والكترومتر، على التوالي. دعمت هذه البحوث "المعاهد الوطنية للصحة" منحة R00-AG047198 (EJB) وأموال بدء التشغيل كلية جديدة "لوما ليندا مدرسة الطب في جامعة". المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية "المعاهد الوطنية للصحة".

قبل إجراء التجارب التالية، ضمان استخدام جميع أنواع الرعاية الحيوانية وبروتوكولات وافق "المؤسسية رعاية الحيوانات" واستخدام اللجنة (IACUC) والقيام بها في اتفاق مع "المجلس الوطني للبحوث" في ''دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية'' (8th الطبعة، 2011)، والمبادئ التوجيهية سيصلون. إ...

<ol>
	<li>Longden, T. A., Hill-Eubanks, D. C., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channel+networks+in+the+control+of+cerebral+blood+flow.">Ion channel networks in the control of cerebral blood flow.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 36 (3), 492-512 (2016).</li><li>Chen, B. R., Kozberg, M. G., Bouchard, M. B., Shaik, M. A., Hillman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+role+for+the+vascular+endothelium+in+functional+neurovascular+coupling+in+the+brain.">A critical role for the vascular endothelium in functional neurovascular coupling in the brain.</a> Journal of the American Heart Association. 3 (3), e000787 (2014).</li><li>Iadecola, C., Yang, G., Ebner, T. J., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+and+propagated+vascular+responses+evoked+by+focal+synaptic+activity+in+cerebellar+cortex.">Local and propagated vascular responses evoked by focal synaptic activity in cerebellar cortex.</a> Journal of Neurophysiology. 78 (2), 651-659 (1997).</li><li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+blood+flow+in+the+microcirculation:+role+of+conducted+vasodilation.">Regulation of blood flow in the microcirculation: role of conducted vasodilation.</a> Acta Physiologica (Oxford, England). 202 (3), 271-284 (2011).</li><li>Garland, C. J., Dora, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EDH:+endothelium-dependent+hyperpolarization+and+microvascular+signalling.">EDH: endothelium-dependent hyperpolarization and microvascular signalling.</a> Acta Physiologica (Oxford, England). 219 (1), 152-161 (2017).</li><li>Hakim, M. A., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+dynamics+of+isolated+cerebral+and+skeletal+muscle+endothelial+tubes:+Differential+roles+of+G-protein-coupled+receptors+and+K++channels.">Electrical dynamics of isolated cerebral and skeletal muscle endothelial tubes: Differential roles of G-protein-coupled receptors and K+ channels.</a> Pharmacology Research &amp; Perspectives. 6 (2), e00391 (2018).</li><li>Marrelli, S. P., Eckmann, M. S., Hunte, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+endothelial+intermediate+conductance+KCa+channels+in+cerebral+EDHF-mediated+dilations.">Role of endothelial intermediate conductance KCa channels in cerebral EDHF-mediated dilations.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (4), H1590-H1599 (2003).</li><li>Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+electrical+signaling+in+arterial+endothelial+tubes:+New+insights+into+cellular+physiology+and+cardiovascular+function.">Calcium and electrical signaling in arterial endothelial tubes: New insights into cellular physiology and cardiovascular function.</a> Microcirculation. 24 (3), (2017).</li><li>Endemann, D. H., Schiffrin, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+dysfunction.">Endothelial dysfunction.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 15 (8), 1983-1992 (2004).</li><li>Rajendran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vascular+endothelium+and+human+diseases.">The vascular endothelium and human diseases.</a> International Journal of Biological Sciences. 9 (10), 1057-1069 (2013).</li><li>Socha, M. J., Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+effects+on+morphological+integrity+and+Ca2++signaling+in+freshly+isolated+murine+feed+artery+endothelial+cell+tubes.">Temperature effects on morphological integrity and Ca2+ signaling in freshly isolated murine feed artery endothelial cell tubes.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (3), H773-H783 (2011).</li><li>Socha, M. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+microvascular+endothelial+tubes+from+mouse+resistance+arteries.">Isolation of microvascular endothelial tubes from mouse resistance arteries.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), (2013).</li><li>Ye, X., Beckett, T., Bagher, P., Garland, C. J., Dora, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-A+inhibits+agonist-mediated+Ca2++responses+and+activation+of+IKCa+channels+in+mouse+resistance+artery+endothelial+cells.">VEGF-A inhibits agonist-mediated Ca2+ responses and activation of IKCa channels in mouse resistance artery endothelial cells.</a> The Journal of Physiology. , (2018).</li><li>Norton, C. E., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcitonin+gene-related+peptide+hyperpolarizes+mouse+pulmonary+artery+endothelial+tubes+through+KATP+channel+activation.">Calcitonin gene-related peptide hyperpolarizes mouse pulmonary artery endothelial tubes through KATP channel activation.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular. , (2018).</li><li>Behringer, E. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potential+governs+calcium+influx+into+microvascular+endothelium:+integral+role+for+muscarinic+receptor+activation.">Membrane potential governs calcium influx into microvascular endothelium: integral role for muscarinic receptor activation.</a> The Journal of Physiology. 593 (20), 4531-4548 (2015).</li><li>Behringer, E. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Aging+on+Calcium+Signaling+and+Membrane+Potential+in+Endothelium+of+Resistance+Arteries:+A+Role+for+Mitochondria.">Impact of Aging on Calcium Signaling and Membrane Potential in Endothelium of Resistance Arteries: A Role for Mitochondria.</a> The Journal of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 72 (12), 1627-1637 (2017).</li><li>Behringer, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+electrical+dynamics+in+lymphatic+endothelium.">Calcium and electrical dynamics in lymphatic endothelium.</a> The Journal of Physiology. 595 (24), 7347-7368 (2017).</li><li>Simmers, M. B., Pryor, A. W., Blackman, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arterial+shear+stress+regulates+endothelial+cell-directed+migration,+polarity,+and+morphology+in+confluent+monolayers.">Arterial shear stress regulates endothelial cell-directed migration, polarity, and morphology in confluent monolayers.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiolog. 293 (3), H1937-H1946 (2007).</li><li>Sandow, S. L., Grayson, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limits+of+isolation+and+culture:+intact+vascular+endothelium+and+BKCa.">Limits of isolation and culture: intact vascular endothelium and BKCa.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 297 (1), H1-H7 (2009).</li><li>Diaz-Otero, J. M., Garver, H., Fink, G. D., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+is+associated+with+changes+to+the+biomechanical+properties+of+the+posterior+cerebral+artery+and+parenchymal+arterioles.">Aging is associated with changes to the biomechanical properties of the posterior cerebral artery and parenchymal arterioles.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (3), H365-H375 (2016).</li><li>Kochukov, M. Y., Balasubramanian, A., Abramowitz, J., Birnbaumer, L., Marrelli, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+endothelial+transient+receptor+potential+C3+channel+is+required+for+small+conductance+calcium-activated+potassium+channel+activation+and+sustained+endothelial+hyperpolarization+and+vasodilation+of+cerebral+artery.">Activation of endothelial transient receptor potential C3 channel is required for small conductance calcium-activated potassium channel activation and sustained endothelial hyperpolarization and vasodilation of cerebral artery.</a> Journal of the American Heart Association. 3 (4), (2014).</li><li>Zhang, L., Papadopoulos, P., Hamel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+TRPV4+channels+mediate+dilation+of+cerebral+arteries:+impairment+and+recovery+in+cerebrovascular+pathologies+related+to+Alzheimer's+disease.">Endothelial TRPV4 channels mediate dilation of cerebral arteries: impairment and recovery in cerebrovascular pathologies related to Alzheimer's disease.</a> British Journal of Pharmacology. 170 (3), 661-670 (2013).</li><li>Socha, M. J., Domeier, T. L., Behringer, E. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+intercellular+Ca2++signaling+in+endothelial+cell+tubes+of+mouse+resistance+arteries.">Coordination of intercellular Ca2+ signaling in endothelial cell tubes of mouse resistance arteries.</a> Microcirculation. 19 (8), 757-770 (2012).</li></ol>

ضوء الأخيرة تطورات6،15،،من1617، نظهر الآن طريقة لعزل الماوس البطانة الشريانية الدماغية تحضيرا لقياس متزامنة من [Ca2 +] الأول والخامسم الكامنة إده استمرار ح ~ 2 عند 37 درجة مئوية. على الرغم من صعوبة من الناحية...

وينظم تدفق الدم في جميع أنحاء الدماغ تنسيق توسع الأوعية بين شرايين المخ والشرايين في شبكات الأوعية الدموية1. خلايا بطانية بطانة الشرايين المقاومة الدماغية الأمر التغييرات في قطر الأوعية الدموية حسب الحاجة لتلبية الطلب الأيضية للخلايا العصبية1،،من23. خلال فرط الاستقطاب المستمدة من البطانة (المعروفة عموما باسم إده)، على وجه الخصوص، كاليفورنيا داخل الخلية2 + ([Ca2 +]أنا) والإشارات الكهربائية في خلايا بطانية توسع الأوعية تنسيق بين خلايا بطانية وبهم خلايا العضلات الملساء المحيطة بها من خلال تقاطعات الفجوة للاسترخاء الشرايين4. الفسيولوجية بدء إده تسلسلياً يستلزم تنشيط ز-إلى جانب المستقبلات (جبكرس)، زيادة في [Ca2 +]أنا، وتفعيل البطانية الصغيرة والمتوسطة Ca2 +-تنشيط ك+ (/IK كوروناالمرجع المصدقCa) القنوات هايبربولاريزي غشاء بطانة الأوعية الدموية الدماغية المحتملة (تم)5،،من67. وهكذا، العلاقة الحميمة غشائي [Ca2 +]أنا والخامسم جزء لا يتجزأ من تنظيم تدفق الدم ولا غنى عنه للقلب-والأوعية الدماغية وظيفة6،8. في جميع أنحاء الأدب أوسع نطاقا، والعديد من الدراسات أفادت رابطة خلل الأوعية الدموية غشائي مع تطور الأمراض المزمنة (مثل ارتفاع ضغط الدم، والسكري، قصور القلب، مرض الشريان التاجي، الفشل الكلوي المزمن، أمراض الشرايين الطرفية)9،10، مما يشير إلى أهمية دراسة الدالة غشائي في الظروف الفسيولوجية وكذلك المرضية.
البطانة الوعائية جزء لا يتجزأ من الإنتاج من فرط الاستقطاب، وتوسع الأوعية، ونضح الأنسجة وهكذا، دراسة خصائصه الخلوية الأصلية الحاسمة. كنموذج دراسة عامة، تم نشر إعداد نموذج أنبوب غشائي الشرياني الماوس قبل للهيكل العظمى والعضلات11،12،13من القناة الهضمية،14من الرئة، ومؤخرا ل الدماغ6. خاصة نشرت دراسات متزامنة [Ca2 +]أنا وقياساتm V للهيكل العظمى والعضلات البطانة الشريانية15،16 ، فضلا عن سفينة اللمفاوية البطانة17. وبالإضافة إلى الدراسات الأولية استخدام النهج أنبوب غشائي، يمكن الاطلاع على استعراض شامل لمزايا وعيوب8 تحديد ما إذا كانت هذه الأداة التجريبية المناسبة لدراسة محددة. باختصار، هي ميزة الاحتفاظ بالعناصر الفسيولوجية الرئيسية لوظيفة الخلايا البطانية (مثل، Ca2 + تدفق وإطلاق سراح داخل الخلايا، فرط الاستقطاب Vم تصل إلى الإمكانات] [نرنست] ك+ عن طريق كورونا/IKCaCa التنشيط، واقتران بين الخلايا البطانية عن طريق تقاطعات الفجوة) دون التباس عوامل مثل ارتشاح الأعصاب الإدخال ووظيفة القناة عن طريق بوابة الجهد العضلات الملساء وكونتراكتيليتي، دوران الدم، والتأثيرات الهرمونية8. وفي المقابل، نهج ثقافة الخلية المستخدمة عادة إدخال تعديلات هامة في مورفولوجيا18 وأيون قناة التعبير19 في طريقة إلى حد كبير يمكن أن تعتم مقارنات للملاحظات الفسيولوجية التي تحدد السابقين فيفو أو في فيفو. وتشمل القيود الافتقار إلى التكامل مع المكونات الأخرى الضرورية لتنظيم تدفق الدم، مثل العضلات الملساء والمرونة مقيدة في وضع جدول زمني تجريبية، كما يتم اختبار هذا النموذج الأمثل ضمن ح 4 من عزلة الجزء الأوعية الدموية سليمة من هذا الحيوان.
بناء من بروتوكول فيديو سابق من تأليف سوتشا وسيجال12 ومستجدات التجريبية المؤقتة6،،من1516، نثبت هنا عزلة البطانة جديدة من شرايين المخ الخلفي وقياسات متزامنة غشائي [Ca2 +]أنا والخامسم استخدام Fura-2 قياس الضوء واقطاب حادة داخل الخلية، على التوالي. بالإضافة إلى ذلك، تستلزم هذه التجربة سوبيرفوسيون المستمر لحلول الملح ووكلاء الدوائية خلال الظروف الفسيولوجية (درجة الحموضة 7.4، 37 درجة مئوية). لقد اخترنا الشريان الدماغي الخلفي، كما غلة البطانة معزولة مع السلامة الهيكلية (الخلايا إلى جانب من خلال تقاطعات الفجوة) ويكفي الأبعاد (العرض إيه فايف زيرو ميكرومتر، طول إيه ثري زيرو زيرو ميكرومتر) قابلة لداخل وبين الخلايا مما يشير إلى طول وبين خلايا بطانية. وبالإضافة إلى ذلك، تمثل إلى حد كبير في الأدب دراسات الشريان الدماغي الخلفي القوارض وتشمل دراسة آليات إرسال الإشارات غشائي الأساسية والأوعية الدموية التنمية/الشيخوخة، وعلم الأمراض20، 21 , 22-ومن المتوقع أن تسفر عن إجراء تحليل الفائق للدالة غشائي الدماغي (والخلل) هذا التطبيق التجريبي وسيسمح ذلك لأوجه التقدم الكبير في الفهم لتنظيم تدفق الدم في جميع أنحاء الشيخوخة وتطور المرض الأعصاب.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)</td>
			<td>A466250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase (Type H Blend)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithioerythritol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2 AM dye</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>F14185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recirculating chiller (Isotemp 500LCU)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>13874647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglas superfusion chamber&#160;</td>
			<td>Warner Instruments, Camden, CT, USA</td>
			<td>RC-27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip bottom (2.4&#160;&#215;&#160;5.0&#160;cm)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12-548-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anodized aluminum platform (diameter: 7.8&#160;cm)&#160;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PM6 or PH6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact aluminum stage&#160;</td>
			<td>Siskiyou, Grants Pass, OR, USA</td>
			<td>8090P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>&#160;MX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscopes&#160;</td>
			<td>Zeiss, NY, USA</td>
			<td>Stemi 2000 &#38; 2000-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber optic light sources</td>
			<td>&#160;Schott, Mainz, Germany &#38; KL200, Zeiss</td>
			<td>Fostec 8375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon inverted microscope</td>
			<td>Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA</td>
			<td>Ts2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast objectives&#160;</td>
			<td>Nikon Instruments Inc</td>
			<td>&#160;(Ph1 DL; 10X &#38; 20X)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent objectives&#160;</td>
			<td>Nikon Instruments Inc</td>
			<td>20X (S-Fluor), and 40X (Plan Fluor)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon inverted microscope</td>
			<td>Nikon Instruments Inc</td>
			<td>Eclipse TS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsyringe pump controller (Micro4 )&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA</td>
			<td>SYS-MICRO4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration isolation table</td>
			<td>Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA</td>
			<td>&#160;Micro-g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifiers</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td>
			<td>Axoclamp 2B &#38; Axoclamp 900A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headstages&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>HS-2A &#38; HS-9A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function generator&#160;</td>
			<td>EZ Digital, Seoul, South Korea</td>
			<td>FG-8002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Acquision System</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td>
			<td>Digidata 1550A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Audible Baseline Monitors</td>
			<td>Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA</td>
			<td>&#160;BM-A-TM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Storage Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix, Beaverton, Oregon, USA</td>
			<td>&#160;TDS 2024B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence System Interface, ARC Lamp + Power Supply, Hyperswitch, PMT</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td>
			<td>IonOptix Systems</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Controller&#160;&#160;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-344B or C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline Heater&#160;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SH- 27B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valve Controller&#160;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>VC-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline Flow Control Valve</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>&#160;FR-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic Puller&#160;</td>
			<td>Sutter Instruments, Novato, CA, USA</td>
			<td>P-97 or P-1000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige, East Meadow, NY, USA</td>
			<td>&#160;MF-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Tubes (Trituration)</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA</td>
			<td>1B100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Tubes (Pinning)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>G150T-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Tubes (Sharp Electrodes)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>GC100F-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter (0.22 &#181;m)&#160;&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>722-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri Dish + Charcoal Sylgard</td>
			<td>Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA</td>
			<td>DD-90-S-BLK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Style Scissors (3 mm &#38; 9.5&#160;mm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>555640S, 14364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors 3 &#38; 7 mm blades</td>
			<td>Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA</td>
			<td>Moria MC52 &#38; 15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharpened fine-tipped forceps&#160;</td>
			<td>FST</td>
			<td>Dumont #5 &#38; Dumont #55</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous measurements of intracellular calcium and membrane potential in freshly isolated and intact mouse cerebral endothelium

شرايين المخ وعلى دوران الأوعية الدقيقة الخاصة بكل منها تسليم الأوكسجين والمواد المغذية إلى الدماغ عن طريق تنظيم تدفق الدم. خلايا بطانية خط التجويف الأوعية الدموية والتغييرات الأمر في قطر الأوعية الدموية اللازمة لتلبية الطلب على التمثيل الغذائي للخلايا العصبية. عادة ما تعمل الابتدائي غشائي تعتمد على مسارات إشارات من فرط الاستقطاب غشاء المحتملة (تم) وأكسيد النيتريك في نفس الوقت التوسط من أجل توسع الأوعية ومن ثم زيادة تدفق الدم. على الرغم من أن جزءا لا يتجزأ من تنسيق توسع الأوعية عبر عدة ملليمترات من طول الأوعية الدموية، كان من الصعب تاريخيا لقياس مكونات المستمدة من البطانة فرط الاستقطاب (إده). هذه المكونات من إده تنطوي داخل الخلية Ca2 + [Ca2 +]أنا يزيد والتنشيط اللاحقة للصغيرة-والمتوسط الموصلية Ca2 +-تنشيط ك+ (كورونا/IKCaCa) القنوات.
وهنا، نقدم مثالاً مبسطة لعزله البطانة الطازجة من الماوس الشرايين الدماغية؛ قياسات متزامنة غشائي [Ca2 +]أنا والخامسم استخدام Fura-2 قياس الضوء واقطاب حادة داخل الخلية، على التوالي؛ ومن سوبيرفوسيون مستمر لحلول الملح ووكلاء الدوائية في ظل الظروف الفسيولوجية (درجة الحموضة 7.4، 37 درجة مئوية). تتم إزالة الشرايين الدماغية الخلفية من "دائرة ويليس" مجاناً للاتصال اللاحق والشرايين باسيلار. ويسهل الهضم الأنزيمي لتنظيف القطع الشرياني الدماغي الخلفي واللاحقة تريتوريشن إزالة والبرانية وارتشاح الأعصاب وخلايا العضلات الملساء. الناتج الخلفي الدماغي الشرياني بطانية "أنابيب" ثم يتم تأمينها تحت مجهر ودرست باستخدام كاميرا، وأنبوب ضوئي، اليكتروميتيرس واحدة واثنين في حين ظل سوبيرفوسيون المستمر. جماعياً، في نفس الوقت يمكن قياس هذا الأسلوب التغييرات في غشائي [Ca2 +]أنا و الخامسم في مواقع الخلوية منفصلة، بالإضافة إلى انتشار إده عن طريق تقاطعات الفجوة حتى مسافات ملليمتر على طول حالها البطانة. هذا الأسلوب من المتوقع أن تسفر عن إجراء تحليل الفائق لمهام غشائي الدماغية الكامنة وراء آليات لتنظيم تدفق الدم في المخ العادي والمريضة.

ويبين الأرقام المرفقة المظاهرة التخطيطي للبروتوكول، المذكورة أعلاه. ويبين الشكل 1Aدماغ معزولة عن ماوس C57BL/6N ذكور شباب البالغين (5 أشهر). شرايين المخ الخلفي معزولون بعناية من "دائرة ويليس"، إزالتها دون النسيج الضام، ومقطعة شرائح (الشكل 1B...

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium at JoVE.com

Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium

تظاهر هنا بروتوكولات لعزل (1) طازجة غشائي الدماغية سليمة "أنابيب" والقياسات (2) المتزامنة من الكالسيوم بطانية وغشاء المحتملة خلال المستمدة من البطانة فرط الاستقطاب. علاوة على ذلك، تسمح هذه الأساليب لضبط الدوائي الكالسيوم غشائي الخلايا والإشارات الكهربائية كمتغيرات تجريبية فردية أو التفاعلية.

قياسات متزامنة من الكالسيوم داخل الخلايا وإمكانات غشاء في البطانة الدماغي الماوس معزولة طازجة وسليمة

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the ...

هذه الطريقة يمكن أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم وظائف الأعضاء الدموية الدماغية من حيث صلتها بتنظيم تدفق الدم الدماغي أثناء الشيخوخة وتطور الأمراض المزمنة. الميزة الأساسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بقياس متزامن للكالسيوم داخل الخلايا وإمكانية الغشاء من البطاني الشرياني الدماغي في شكل أصلي في ظل الظروف الفسيولوجية. لعزل دماغ الفأر، تحت المجهر إزالة الجلد والشعر على الجمجمة.وإزالة الدم المفرط مع بوصه الباردة خالية من الكالسيوم. المقبل، وجعل شق باستخدام فقط نصائح من مقص التشريح القياسية. بدءا من عظم القذالي وتمتد من خلال العظام الأنفية للجمجمة.ثم افتح الجمجمة بعناية على طول الشق ، وذلك باستخدام ملقط خشنة الرؤوس وفصل النسيج الضام لفضح الدماغ. غسل بلطف الدماغ المعزول مع بزة بنز خالية من الكالسيوم الباردة في منقار لإزالة الدم. ضع الجانب البطني للدماغ في غرفة تحتوي على محلول تشريح بارد لعزل الشرايين الدماغية.لعزل الشرايين الدماغية، وتأمين الدماغ المعزول في محلول تشريح الباردة عن طريق إدراج اثنين من دبابيس الفولاذ المقاوم للصدأ من خلال ذلك، في طلاء بوليمر السيليكون المشبع بالفحم في الجزء السفلي من طبق بيتري الزجاج. في وقت لاحق، عزل جراحيا الشرايين الدماغية الخلفية حوالي 0.3 إلى 0.5 شرائح سنتيمتر من الاتصال الخلفي والشرايين basilar. استخدام دبابيس الفولاذ المقاوم للصدأ لتأمين كل من الشرايين الدماغية الخلفية المعزولة في حل تشريح في طبق بيتري.ثم تنظيف الشرايين الدماغية الخلفية المعزولة بعناية عن طريق إزالة النسيج الضام باستخدام ملقط ناعم شحذ. قطع الشرايين سليمة إلى واحد إلى اثنين من شرائح ملليمتر لعملية الهضم الأنزيمية. في هذا الإجراء، وإعداد جهاز التثايب باستخدام المجهر، وكاميرا، ومرحلة الألومنيوم عقد غرفة وmicromanipulators.تأمين microsyringe مع وحدة تحكم مضخة المجاورة للمرحلة والعينة. المقبل الردم تماما ماصة المعايرة مع الزيوت المعدنية وتأمينه على المكبس microsyringe. ثم استخدام microsyringe مع وحدة تحكم مضخة سحب حوالي 130 نانولترات من حل الانفصام في ماصة مع ضمان عدم وجود فقاعات الهواء.في وقت لاحق، ووضع شرائح الشرايين سليمة في ملليلتر واحد من محلول الانفصام مع التركيزات المطلوبة من الإنزيمات في أنبوب زجاجي 10 ملليلتر. احتضان في 34 درجة مئوية لمدة 10 إلى 12 دقيقة للهضم الجزئي. بعد الهضم، استبدال محلول الإنزيم بخمسة ملليلترات من محلول الانفصام الطازج.باستخدام ماصة ملليلتر واحدة، نقل قطعة واحدة إلى غرفة تحتوي على حل تفكك في درجة حرارة الغرفة. التالي مكان ماصة في حل الانفصام في الغرفة ووضعها على مقربة من نهاية واحدة من وعاء هضم. حدد معدلًا في نطاق 2 إلى 5 نانولترات في الثانية على وحدة تحكم المضخة للحصول على تريثوريشن لطيف.أثناء عرض من خلال 100 مرة إلى 200 مرة التكبير سحب وإخراج الجزء الشرياني لتفكك خلايا العضلات الملساء في حين تنتج أنبوب البطانية. إذا لزم الأمر، استخدم بعناية ملقط ذات رؤوس دقيقة لفصل المدفنية المنفصلة واللمينا المرنة الداخلية من أنبوب البطانية. تأكد من أن جميع خلايا العضلات الملساء منفصلة وأن الخلايا البطانية فقط تبقى كما أنبوب سليمة.باستخدام micromanipulators، وتأمين كل نهاية من أنبوب البطانية على زلة الغطاء الزجاجي لغرفة الضخ الفائق باستخدام البورسلليكات الزجاج تثبيت ماصات. غسل من adventitia مفككة وخلايا العضلات الملساء من الغرفة. واستبدال محلول الانفصام مع اثنين من الزهد أكثر كلوريد الكالسيوم PSS.نقل منصة متحركة مع أنبوب البطانية المضمونة على مجهر القذف الفائق والتلاعب التجريبي. ثم استخدام ستة خزانات نظيفة 50 ملليلتر للتسليم المستمر لPSS والحلول المخدرات المعنية خلال التجربة. استخدم صمام التحكم في التدفق في الخط لتعيين معدل التدفق يدويًا على أنه ثابت كتدفق مرق أثناء مطابقة تدفق التغذية إلى شفط الفراغ.تسليم PSS إلى الغرفة للضخ الفائق للأنبوب البطانية لمدة خمس دقائق على الأقل قبل تسجيل بيانات الخلفية وتحميل الصبغة. لقياس إمكانات الغشاء في وقت واحد مع تركيز الكالسيوم داخل الخلايا، وسحب قطب حاد والردم عليه مع اثنين من كلوريد البوتاسيوم الضرس لتسجيل من الخلايا المحملة صبغة الفورا-2. لدراسة اقتران داخل الخلايا عن طريق نقل صبغ، ردم microelectrode مع 0.1٪ بروبديسيوم يوديد الذائبة في اثنين من كلوريد البوتاسيوم المولر.التالي في مكان القطب على سلك الفضة المغلفة مع كلوريد في حامل ماصة تعلق على مرحلة رئيس الكهربائي المضمونة مع ميكرومانيبولاتور. استخدام micromanipulator لوضع لفترة وجيزة غيض من القطب في تدفق PSS في الغرفة، في حين عرض من خلال الهدف أربع مرات. في وقت لاحق, تعيين احتمال غشاء يستريح إلى الصفر كما يتفق مع إمكانية حمام على أساس.إذا رغبت في ذلك، استخدم شاشات خط أساس مسموعة مرتبطة بمقاييس كهربائية لربط الصوت مع التسجيلات المحتملة. بعد ذلك، زيادة التكبير إلى 400 مرة باستخدام 40 مرة الهدف ووضع غيض من القطب قليلا على الخلية من أنبوب البطانية. ضبط نافذة photometric باستخدام برنامج القياس الضوئي للتركيز على حوالي 50 إلى 80 خلايا البطانية.ثم ضع القطب برفق في واحدة من خلايا الأنبوب البطانية باستخدام ميكرومانبولاتور وانتظر دقيقتين على الأقل لإمكانية استقرار الغشاء المستريح. مرة واحدة يستريح غشاء المحتملة مستقرة في قيمتها المتوقعة، بدوره على أنبوب الممول الضوئي على واجهة الفلوريسنس في غياب الضوء والبدء في الحصول على تركيز الكالسيوم داخل الخلايا من قبل فورا-2 مثيرة بالتناوب في 340 و 380 نانومتر في حين جمع انبعاثات الفلوريسكين في 510 نانومتر. مرة واحدة يتم إنشاء قياسات المتزامنة من إمكانات الغشاء وتركيز الكالسيوم داخل الخلايا, السماح حوالي خمس دقائق للضخ الفائق للأنبوب البطانية مع PSS بمعدل تدفق لارينار ثابت قبل تطبيق المخدرات.تطبيق الدواء المعدة في PSS إلى غرفة الضخ الفائق بمعدل تدفق ثابت. خلال العلاج من المخدرات قياس الغشاء المحتملة في نسب F340/F380 في وقت واحد. بمجرد الانتهاء من التجربة، اسحب القطب الكهربائي من الخلية.ثم وقف التسجيلات المعنية من إمكانات الغشاء وتركيز الكالسيوم داخل الخلايا وحفظ الملفات لتحليل البيانات. هذه صورة تباينية للتداخل على تباين أنبوب البطايلي الشرياني الدماغي للماوس، يتم تعديله من أجل التجربة في نافذة القياس الضوئي باستخدام هدف 40 مرة. يتم وضع قطب كهربائي حاد في خلية، كما هو موضح في الجزء العلوي من الصورة.وفيما يلي أمثلة من آثار الخام لقياس في وقت واحد من F340/F380 نسبة وإمكانية غشاء استجابة ل100 ATP ميكرومولار. بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل المجهر الفلورسنت confocal، من أجل الإجابة على أسئلة إضافية بشأن إشارات ميكرودومين من الكالسيوم البطانية، وأنواع الأكسجين التفاعلية، كأمثلة. بشكل عام سوف تستمر هذه التقنية في تمهيد الطريق للأبحاث في علم وظائف الأعضاء الخلوية لاستكشاف وظيفة الأوعية الدموية والشيخوخة في الدورة الدموية والدورة الدموية اللمفاوية.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

قياس الأدنى غشاء البلازما والعالمية حيوية الكالسيوم بين الخلايا في الخلايا النجمية

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

عزل Myocytes الأذيني الإنسان للقياسات في وقت واحد من الكالسيوم<sup&gt; 2 +</sup&gt; العابرون والتيارات غشاء

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

حيوي داخلي المجهري للهياكل التصوير التحت خلوية في الفئران لايف تعرب عن البروتينات الفلورية

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

تقييم الكالسيوم سباركس السليمة في ألياف العضلات الهيكلية

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

قياس الكالسيوم عصاري خلوي في الخلايا الظهارية الكلوية بواسطة التدفق الخلوي

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli

على قناة واحدة وتحليل الكالسيوم التصوير في Podocytes من الكبيبات المعزولة حديثا

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

الماوس معزولة تقنية الكلى Perfused

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

قياس وقت واحد من الميتوكوندريا الكالسيوم والميتوكوندريا غشاء المحتملة في الخلايا الحية التي كتبها نيون الميكروسكوب

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

عزل الخلايا العضلية الأذينية والبطينية عالية الجودة للقياسات المتزامنة لتيار الكالسيوم2+ العابر وتيار الكالسيوم من النوع L

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Isolating and Imaging Live, Intact Pacemaker Regions of Mouse Renal Pelvis by Vibratome Sectioning

عزل والتصوير لايف، سليمة مناطق منظم ضربات القلب من الحوض الكلوي الماوس عن طريق تقسيم الهزاز

The renal pelvis (RP) is a funnel-shaped, smooth muscle structure that facilitates normal urine transport from the kidney to the ureter by regular, ...