Name: simultaneous measurements of intracellular calcium and membrane potential in freshly isolated and intact mouse cerebral endothelium
Uploaded: 2019-01-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium at JoVE.com

Wij danken Charles Hewitt voor uitstekende technische hulp nodig hebt bij het opzetten van apparatuur en benodigdheden die nodig zijn voor de huidige protocollen. Wij danken Drs. Sean M. Wilson en Christopher G. Wilson, vanuit het midden van de LLU voor perinatale biologie, voor het verstrekken van ons met een extra omgekeerde Microscoop en elektrometer, respectievelijk. Dit onderzoek is gesteund door de National Institutes of Health grant R00-AG047198 (EJB) en de Loma Linda University School of Medicine nieuw faculteit start-up middelen. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de National Institutes of Health.

Voordat de volgende experimenten uitvoeren, ervoor zorgen dat alle dierenverzorgers gebruiken en protocollen zijn goedgekeurd door de institutionele dier zorg en gebruiken Comité (IACUC) en uitgevoerd in overeenstemming met de National Research Council de " "gids voor de zorg en het gebruik van Proefdieren '' (8th Edition, 2011) en de richtsnoeren voor het aankomen. De IACUC van de Loma Linda University heeft ingestemd met alle protocollen die worden gebruikt voor dit manuscript voor manneli...

<ol>
	<li>Longden, T. A., Hill-Eubanks, D. C., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channel+networks+in+the+control+of+cerebral+blood+flow.">Ion channel networks in the control of cerebral blood flow.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 36 (3), 492-512 (2016).</li><li>Chen, B. R., Kozberg, M. G., Bouchard, M. B., Shaik, M. A., Hillman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+role+for+the+vascular+endothelium+in+functional+neurovascular+coupling+in+the+brain.">A critical role for the vascular endothelium in functional neurovascular coupling in the brain.</a> Journal of the American Heart Association. 3 (3), e000787 (2014).</li><li>Iadecola, C., Yang, G., Ebner, T. J., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+and+propagated+vascular+responses+evoked+by+focal+synaptic+activity+in+cerebellar+cortex.">Local and propagated vascular responses evoked by focal synaptic activity in cerebellar cortex.</a> Journal of Neurophysiology. 78 (2), 651-659 (1997).</li><li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+blood+flow+in+the+microcirculation:+role+of+conducted+vasodilation.">Regulation of blood flow in the microcirculation: role of conducted vasodilation.</a> Acta Physiologica (Oxford, England). 202 (3), 271-284 (2011).</li><li>Garland, C. J., Dora, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EDH:+endothelium-dependent+hyperpolarization+and+microvascular+signalling.">EDH: endothelium-dependent hyperpolarization and microvascular signalling.</a> Acta Physiologica (Oxford, England). 219 (1), 152-161 (2017).</li><li>Hakim, M. A., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+dynamics+of+isolated+cerebral+and+skeletal+muscle+endothelial+tubes:+Differential+roles+of+G-protein-coupled+receptors+and+K++channels.">Electrical dynamics of isolated cerebral and skeletal muscle endothelial tubes: Differential roles of G-protein-coupled receptors and K+ channels.</a> Pharmacology Research &amp; Perspectives. 6 (2), e00391 (2018).</li><li>Marrelli, S. P., Eckmann, M. S., Hunte, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+endothelial+intermediate+conductance+KCa+channels+in+cerebral+EDHF-mediated+dilations.">Role of endothelial intermediate conductance KCa channels in cerebral EDHF-mediated dilations.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (4), H1590-H1599 (2003).</li><li>Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+electrical+signaling+in+arterial+endothelial+tubes:+New+insights+into+cellular+physiology+and+cardiovascular+function.">Calcium and electrical signaling in arterial endothelial tubes: New insights into cellular physiology and cardiovascular function.</a> Microcirculation. 24 (3), (2017).</li><li>Endemann, D. H., Schiffrin, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+dysfunction.">Endothelial dysfunction.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 15 (8), 1983-1992 (2004).</li><li>Rajendran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vascular+endothelium+and+human+diseases.">The vascular endothelium and human diseases.</a> International Journal of Biological Sciences. 9 (10), 1057-1069 (2013).</li><li>Socha, M. J., Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+effects+on+morphological+integrity+and+Ca2++signaling+in+freshly+isolated+murine+feed+artery+endothelial+cell+tubes.">Temperature effects on morphological integrity and Ca2+ signaling in freshly isolated murine feed artery endothelial cell tubes.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (3), H773-H783 (2011).</li><li>Socha, M. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+microvascular+endothelial+tubes+from+mouse+resistance+arteries.">Isolation of microvascular endothelial tubes from mouse resistance arteries.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), (2013).</li><li>Ye, X., Beckett, T., Bagher, P., Garland, C. J., Dora, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-A+inhibits+agonist-mediated+Ca2++responses+and+activation+of+IKCa+channels+in+mouse+resistance+artery+endothelial+cells.">VEGF-A inhibits agonist-mediated Ca2+ responses and activation of IKCa channels in mouse resistance artery endothelial cells.</a> The Journal of Physiology. , (2018).</li><li>Norton, C. E., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcitonin+gene-related+peptide+hyperpolarizes+mouse+pulmonary+artery+endothelial+tubes+through+KATP+channel+activation.">Calcitonin gene-related peptide hyperpolarizes mouse pulmonary artery endothelial tubes through KATP channel activation.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular. , (2018).</li><li>Behringer, E. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potential+governs+calcium+influx+into+microvascular+endothelium:+integral+role+for+muscarinic+receptor+activation.">Membrane potential governs calcium influx into microvascular endothelium: integral role for muscarinic receptor activation.</a> The Journal of Physiology. 593 (20), 4531-4548 (2015).</li><li>Behringer, E. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Aging+on+Calcium+Signaling+and+Membrane+Potential+in+Endothelium+of+Resistance+Arteries:+A+Role+for+Mitochondria.">Impact of Aging on Calcium Signaling and Membrane Potential in Endothelium of Resistance Arteries: A Role for Mitochondria.</a> The Journal of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 72 (12), 1627-1637 (2017).</li><li>Behringer, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+electrical+dynamics+in+lymphatic+endothelium.">Calcium and electrical dynamics in lymphatic endothelium.</a> The Journal of Physiology. 595 (24), 7347-7368 (2017).</li><li>Simmers, M. B., Pryor, A. W., Blackman, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arterial+shear+stress+regulates+endothelial+cell-directed+migration,+polarity,+and+morphology+in+confluent+monolayers.">Arterial shear stress regulates endothelial cell-directed migration, polarity, and morphology in confluent monolayers.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiolog. 293 (3), H1937-H1946 (2007).</li><li>Sandow, S. L., Grayson, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limits+of+isolation+and+culture:+intact+vascular+endothelium+and+BKCa.">Limits of isolation and culture: intact vascular endothelium and BKCa.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 297 (1), H1-H7 (2009).</li><li>Diaz-Otero, J. M., Garver, H., Fink, G. D., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+is+associated+with+changes+to+the+biomechanical+properties+of+the+posterior+cerebral+artery+and+parenchymal+arterioles.">Aging is associated with changes to the biomechanical properties of the posterior cerebral artery and parenchymal arterioles.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (3), H365-H375 (2016).</li><li>Kochukov, M. Y., Balasubramanian, A., Abramowitz, J., Birnbaumer, L., Marrelli, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+endothelial+transient+receptor+potential+C3+channel+is+required+for+small+conductance+calcium-activated+potassium+channel+activation+and+sustained+endothelial+hyperpolarization+and+vasodilation+of+cerebral+artery.">Activation of endothelial transient receptor potential C3 channel is required for small conductance calcium-activated potassium channel activation and sustained endothelial hyperpolarization and vasodilation of cerebral artery.</a> Journal of the American Heart Association. 3 (4), (2014).</li><li>Zhang, L., Papadopoulos, P., Hamel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+TRPV4+channels+mediate+dilation+of+cerebral+arteries:+impairment+and+recovery+in+cerebrovascular+pathologies+related+to+Alzheimer's+disease.">Endothelial TRPV4 channels mediate dilation of cerebral arteries: impairment and recovery in cerebrovascular pathologies related to Alzheimer's disease.</a> British Journal of Pharmacology. 170 (3), 661-670 (2013).</li><li>Socha, M. J., Domeier, T. L., Behringer, E. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+intercellular+Ca2++signaling+in+endothelial+cell+tubes+of+mouse+resistance+arteries.">Coordination of intercellular Ca2+ signaling in endothelial cell tubes of mouse resistance arteries.</a> Microcirculation. 19 (8), 757-770 (2012).</li></ol>

In het licht van recente ontwikkelingen6,15,16,17tonen we nu de methode om te isoleren muis cerebrale arteriële endotheel in voorbereiding voor gelijktijdige meting van [Ca2 +] Ik en Vm onderliggende EDH consequent over ~ 2 h bij 37 ° C. Hoewel het technisch moeilijk, kunnen we meten aan-cel koppeling ook (zie referentie6, figuur 1). Op...

Doorbloeding in de hersenen wordt geregeld door de coördinatie van vasodilatatie onder cerebrale bloedvaten en arteriolen in vasculaire netwerken1. Endotheliale cellen voering cerebrale weerstand slagaders commando veranderingen in vasculaire diameter als nodig is om de metabole vraag van neuronen1,2,3te voldoen. In het bijzonder tijdens endotheel afkomstige hyperpolarisatie (algemeen bekend als EDH), intracellulaire Ca2 + ([Ca2 +]ik) en elektrische signalering in de coördinaat vasodilatatie endotheliale cellen onder endotheliale cellen en hun omliggende zachte spiercellen via gap kruispunten voor arteriële ontspanning4. Fysiologische inleiding van EDH inhoudt achtereenvolgens stimulatie van de Gq-receptoren (GPCRs), een toename van [Ca2 +]iken activering van endothelial kleine - en intermediair-Ca2 +combinatie-geactiveerd K+ (SKCa/IKCa) kanalen aan cerebrale endothelial membraan potentiële (V,m)5,6,7hyperpolarize. Dus is de intieme relatie van endothelial [Ca2 +]ik en Vm integraal aan de bloed stroom verordening en onontbeerlijk voor cardio- en cerebrovasculaire functie6,8. In de bredere literatuur, tal van studies hebben melding gemaakt van de associatie van vasculaire endothelial dysfunctie met de ontwikkeling van chronische ziekten (bijvoorbeeld hypertensie, diabetes, hartfalen, coronaire hartziekten, chronisch nierfalen, ziekte van de perifere slagader)9,10, waarin het belang van het bestuderen van endothelial functie in fysiologische en pathologische omstandigheden.
Vasculaire endotheel is onlosmakelijk verbonden met de productie van hyperpolarisatie, vasodilatatie en perfusie van het weefsel en dus, onderzoek van de inheemse cellulaire eigenschappen is van cruciaal belang. Als een algemene studie-model, is voorbereiding van de arteriële endothelial buis muismodel gepubliceerd vóór voor skeletspieren11,12, gut13, Long14, en onlangs de hersenen6. Studies van gelijktijdige [Ca2 +]ik en Vm metingen zijn in het bijzonder gepubliceerd voor skeletspieren arteriële endotheel15,16 , alsmede lymfatische vaartuig endotheel17. Naast primaire studies gebruik te maken van de aanpak van het endotheel buis, kan een algehele herziening van de voor- en nadelen8 worden geraadpleegd om te bepalen of deze experimentele rol geschikt voor een specifieke studie is. Kortom, een voordeel is dat de fysiologische kerncomponenten van endothelial cel functie worden bewaard (bv., Ca2 + toestroom en intracellulaire release, hyperpolarisatie van Vm tot de Nernst potentieel voor K+ via SKCa/IKCa activering en endotheel intercellulaire koppeling via de kruispunten van de kloof) zonder verstorende factoren zoals gerelateerde zenuw input, gladde spieren spanning-gated kanaal functie en contractility, omloop van het bloed en hormonale invloeden8. Daarentegen gebruikte cel cultuur benaderingen introduceren aanzienlijke veranderingen in de morfologie18 en ion kanaal expressie19 op een wijze die sterk vergelijkingen op fysiologische opmerkingen bepaald ex vivo kan verduisteren of in vivo. Beperkingen omvatten een gebrek aan integratie met andere essentiële onderdelen voor de regulering van de doorbloeding, zoals de gladde spieren en beperkte flexibiliteit in een experimentele planning, als dit model optimaal binnen de 4 uur van intact vasculaire segment isolatie getest is van het dier.
Gebouw uit een vorige video protocol geschreven door Socha en Segal12 en recente experimentele ontwikkelingen in de tussentijdse6,15,16, wij hierbij laten zien dat de isolatie van verse endotheel van posterieure cerebrale bloedvaten en gelijktijdige metingen van endothelial [Ca2 +]ik en Vm met Fura-2 fotometrie en intracellulaire scherpe elektroden, respectievelijk. Dit experiment houdt bovendien continu superfusion van zoutoplossingen en farmacologische agenten tijdens de fysiologische omstandigheden (pH 7.4, 37 ° C). We kozen de posterieure cerebrale slagader, zoals het levert geïsoleerde endotheel met de structurele integriteit (cellen gekoppeld via gap kruispunten) en voldoende afmetingen (breedte ≥50 µm, lengte ≥300 µm) vatbaar voor intra- en intercellulaire signalering langs en onder endotheliale cellen. Bovendien, studies van de knaagdier posterieure cerebrale slagader zijn sterk vertegenwoordigd in de literatuur en omvatten onderzoek van fundamentele endothelial signalering mechanismen, vasculaire ontwikkeling/veroudering en pathologie20, 21 , 22. deze experimentele toepassing wordt verwacht rendement van een analyse van de high-throughput of cerebrale endothelial functie (dysfunctie) en zal daardoor zorgen voor aanzienlijke vooruitgang in het begrip van bloed stroom verordening gedurende veroudering en de ontwikkeling van neurodegeneratieve ziekte.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)</td>
			<td>A466250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase (Type H Blend)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithioerythritol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2 AM dye</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>F14185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recirculating chiller (Isotemp 500LCU)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>13874647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglas superfusion chamber&#160;</td>
			<td>Warner Instruments, Camden, CT, USA</td>
			<td>RC-27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip bottom (2.4&#160;&#215;&#160;5.0&#160;cm)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12-548-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anodized aluminum platform (diameter: 7.8&#160;cm)&#160;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PM6 or PH6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact aluminum stage&#160;</td>
			<td>Siskiyou, Grants Pass, OR, USA</td>
			<td>8090P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>&#160;MX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscopes&#160;</td>
			<td>Zeiss, NY, USA</td>
			<td>Stemi 2000 &#38; 2000-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber optic light sources</td>
			<td>&#160;Schott, Mainz, Germany &#38; KL200, Zeiss</td>
			<td>Fostec 8375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon inverted microscope</td>
			<td>Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA</td>
			<td>Ts2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast objectives&#160;</td>
			<td>Nikon Instruments Inc</td>
			<td>&#160;(Ph1 DL; 10X &#38; 20X)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent objectives&#160;</td>
			<td>Nikon Instruments Inc</td>
			<td>20X (S-Fluor), and 40X (Plan Fluor)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon inverted microscope</td>
			<td>Nikon Instruments Inc</td>
			<td>Eclipse TS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsyringe pump controller (Micro4 )&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA</td>
			<td>SYS-MICRO4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration isolation table</td>
			<td>Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA</td>
			<td>&#160;Micro-g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifiers</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td>
			<td>Axoclamp 2B &#38; Axoclamp 900A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headstages&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>HS-2A &#38; HS-9A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function generator&#160;</td>
			<td>EZ Digital, Seoul, South Korea</td>
			<td>FG-8002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Acquision System</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td>
			<td>Digidata 1550A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Audible Baseline Monitors</td>
			<td>Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA</td>
			<td>&#160;BM-A-TM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Storage Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix, Beaverton, Oregon, USA</td>
			<td>&#160;TDS 2024B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence System Interface, ARC Lamp + Power Supply, Hyperswitch, PMT</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td>
			<td>IonOptix Systems</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Controller&#160;&#160;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-344B or C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline Heater&#160;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SH- 27B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valve Controller&#160;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>VC-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline Flow Control Valve</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>&#160;FR-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic Puller&#160;</td>
			<td>Sutter Instruments, Novato, CA, USA</td>
			<td>P-97 or P-1000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige, East Meadow, NY, USA</td>
			<td>&#160;MF-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Tubes (Trituration)</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA</td>
			<td>1B100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Tubes (Pinning)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>G150T-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Tubes (Sharp Electrodes)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>GC100F-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter (0.22 &#181;m)&#160;&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>722-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri Dish + Charcoal Sylgard</td>
			<td>Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA</td>
			<td>DD-90-S-BLK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Style Scissors (3 mm &#38; 9.5&#160;mm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>555640S, 14364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors 3 &#38; 7 mm blades</td>
			<td>Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA</td>
			<td>Moria MC52 &#38; 15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharpened fine-tipped forceps&#160;</td>
			<td>FST</td>
			<td>Dumont #5 &#38; Dumont #55</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous measurements of intracellular calcium and membrane potential in freshly isolated and intact mouse cerebral endothelium

Cerebrale bloedvaten en hun respectieve microcirculatie leveren zuurstof en voedingsstoffen naar de hersenen via bloed stroom verordening. Endotheliale cellen lijn het lumen van de bloedvaten en de opdracht wijzigingen in vasculaire diameter desgewenst de metabole vraag van neuronen te voldoen. Primaire endotheel-afhankelijke signaalroutes voor hyperpolarisatie van de membraanpotentiaal (V,m) en stikstofmonoxide werken meestal parallel aan bemiddelen vaatverwijding en daardoor de bloedtoevoer. Hoewel integraal te coördineren vasodilatatie over enkele millimeters van vasculaire lengte, onderdelen van endotheel afkomstige hyperpolarisatie (EDH) historisch moeilijk geweest te meten. Deze onderdelen van EDH inhouden intracellulaire Ca2 + [Ca2 +]ik verhoogt en verdere activering van kleine - en middenniveau huidgeleiding Ca2 +-geactiveerd K+ (SKCa/IKCa) kanalen.
Hier presenteren we een vereenvoudigde afbeelding van het isolement van verse endotheel van muis cerebrale bloedvaten; gelijktijdige metingen van endothelial [Ca2 +]ik en Vm met Fura-2 fotometrie en intracellulaire scherpe elektroden, respectievelijk; en een continue superfusion van zoutoplossingen en farmacologische agenten onder fysiologische omstandigheden (pH 7.4, 37 ° C). Posterieure cerebrale bloedvaten uit de cirkel van Willis worden verwijderd vrij van de posterieure communiceren en de arteria slagaders. Enzymatische spijsvertering van schoongemaakte posterieure cerebrale arteriële segmenten en latere verpulvering vergemakkelijkt verwijdering van adventitia, gerelateerde zenuwen en zachte spiercellen. Resulterende posterieure cerebrale arteriële endothelial "buizen" vervolgens onder een Microscoop zijn beveiligd en onderzocht met behulp van een camera, fotomultiplicator, en één of twee elektrometers terwijl onder continue superfusion. Collectief, kan deze methode gelijktijdig wijzigingen in endotheel [Ca2 +]ik en Vm in discrete cellulaire locaties, naast de verspreiding van EDH via gap kruispunten tot millimeter afstanden langs de intact meten endotheel. Deze methode wordt verwacht dat het rendement van een high-throughput analyse van de onderliggende mechanismen van bloed stroom verordening in de hersenen van normale en zieke endothelial hersenfunctie.

De schematische demonstratie van het protocol die hierboven beschreven wordt in de bijgevoegde cijfers weergegeven. Een hersenen van een jonge volwassen mannelijke C57BL/6N muis (5 maanden) geïsoleerd wordt weergegeven in figuur 1A. Posterieure cerebrale bloedvaten zijn zorgvuldig gescheiden van de cirkel van Willis, verwijderd zonder bindweefsel, en snijd in segmenten (figuur 1B-D). Van gedeeltelijk verteerd ar...

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium at JoVE.com

Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium

Hier gedemonstreerd zijn protocollen voor het isoleren van (1) vers intact cerebrale endothelial "buizen" en (2) gelijktijdige metingen van endothelial calcium en membraanpotentiaal tijdens endotheel afkomstige hyperpolarisatie. Verder, deze methoden toestaan voor farmacologische tuning van endothelial cel calcium en elektrische signalering als individuele of interactieve experimentele variabelen.

Gelijktijdige metingen van intracellulair Calcium en membraanpotentiaal in vers geïsoleerd en Intact muis cerebrale endotheel

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van cerebrale vasculaire fysiologie als het gaat om cerebrale bloedstroom verordening tijdens veroudering en ontwikkeling van chronische ziekten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het gelijktijdige meting van intracellulair calcium- en membraanpotentieel van cerebrale arteriële endotheel in zijn oorspronkelijke vorm onder fysiologische omstandigheden mogelijk maakt. Om de muishersenen te isoleren, verwijder onder de microscoop de huid en het haar over de schedel.En verwijder overmatig bloed met koude calciumvrije PSS. Maak vervolgens een incisie met alleen de uiteinden van de standaard dissectie schaar. Vanaf het occipitale bot en zich uitstrekt door het neusbeen van de schedel.Dan open ze schedel zorgvuldig langs de incisie, met behulp van grof-getipt tangen en scheiden het bindweefsel om de hersenen bloot. Was de geïsoleerde hersenen voorzichtig met koude calciumvrije PSS in een beker om het bloed te verwijderen. Plaats de hersenventilatiezijde omhoog in een kamer met koude dissectieoplossing voor de isolatie van hersenslagaders.Om de cerebrale slagaders te isoleren, zet u de geïsoleerde hersenen in koude dissectieoplossing door er twee roestvrijstalen pinnen doorheen te plaatsen, in een met houtskool doordrenkte siliciumpolymeerlaag aan de onderkant van een glazen petrischaal. Vervolgens isoleer je chirurgisch de achterste cerebrale slagaders van ongeveer 0,3 tot 0,5 centimeter segmenten van de achterste communiceren en basilaire slagaders. Gebruik roestvrijstalen pinnen om beide geïsoleerde achterste hersenslagaders in de dissectieoplossing in de petrischaal te beveiligen.Reinig vervolgens de geïsoleerde achterste cerebrale slagaders zorgvuldig door het verwijderen van bindweefsel met behulp van geslepen fijngepuntige tangen. Snijd de intacte slagaders in een tot twee millimeter segmenten voor enzymatische spijsvertering. Bereid in deze procedure het trituratieapparaat voor met behulp van een microscoop, een camera en een aluminiumfase met een kamer en micromanipulatoren.Zet een microsysuit met een pompcontroller naast het podium en het monster. Volgende volledig backfill een titratie pipet met minerale olie en zet het over de microsyreren zuiger. Dan met behulp van de microsyringe met de pomp controller trekken ongeveer 130 nanoliter van dissociatie oplossing in de pipet, terwijl de afwezigheid van luchtbellen.Plaats vervolgens intacte arteriële segmenten in één milliliter dissociatieoplossing met de vereiste concentraties enzymen in een glazen buis van 10 milliliter. Incubeer bij 34 graden Celsius gedurende 10 tot 12 minuten voor gedeeltelijke spijsvertering. Vervang na de spijsvertering de enzymoplossing door vijf milliliter verse dissociatieoplossing.Breng met behulp van een pipet van één milliliter één segment over in de kamer met dissociatieoplossing bij kamertemperatuur. Plaats vervolgens de pipet in de dissociatieoplossing in de kamer en plaats deze dicht bij het ene uiteinde van het verteerde vat. Stel een snelheid in binnen het bereik van twee tot vijf nanoliters per seconde op de pompcontroller voor zachte trituratie.Tijdens het bekijken door 100 keer tot 200 keer vergroting in te trekken en uitwerpen van de arteriële segment te scheiden gladde spiercellen, terwijl de productie van een endotheel buis. Gebruik indien nodig zorgvuldig fijngepunte tangen om gescheiden adventitia en interne elastische lamina van de endotheelbuis te scheiden. Bevestig dat alle gladde spiercellen zijn gescheiden en dat alleen endotheelcellen blijven als intacte buis.Met behulp van micromanipulatoren, zet elk uiteinde van de endotheelbuis op de glazen deksel slip van de superfusie kamer met borosilicaat glas pinning pipetten. Was de gescheiden adventitia en gladde spiercellen uit de kamer. En vervang de dissociatieoplossing door twee molaire meer calciumchloride PSS.Breng het mobiele platform met beveiligde endotheelbuis over op de microscoop van superfusie en experimentele installatie. Gebruik vervolgens zes schone reservoirs van 50 milliliter voor continue levering van PSS en de respectieve geneesmiddelenoplossingen tijdens het experiment. Gebruik de in-line flow control valve om handmatig de stroomsnelheid zo consistent als laminer stroom, terwijl bijpassende stroom feed vacuüm zuigkracht.Breng PSS ten minste vijf minuten naar de kamer voor de superfusie van de endotheelbuis voordat u de achtergrondgegevens opneemt en de kleurstof laadt. Om het membraanpotentieel gelijktijdig te meten met intracellulaire calciumconcentratie, trekt u een scherpe elektrode en vult deze met twee molaire kaliumchloride om cellen met fura-2 kleurstof op te nemen. Om de intracellulaire koppeling via kleurstofoverdracht te bestuderen, vult u de micro-elektrodrode op met 0,1%propidiumjodide opgelost in twee molaire kaliumchloride.Plaats vervolgens de elektrode over een zilverdraad bekleed met chloride in de pipethouder bevestigd aan een elektrometer hoofdtrap beveiligd met een micromanipulator. Gebruik de micromanipulator om de punt van de elektrode kort in de stromende PSS in de kamer te plaatsen, terwijl u door de viervoudige doelstelling kijkt. Vervolgens, stel het rustende membraan potentieel op nul als consistent met geaard bad potentieel.Gebruik indien gewenst hoorbare basislijnmonitoren die zijn gekoppeld aan elektrometers om geluidspitch te associëren met mogelijke opnames. Verhoog daarna de vergroting tot 400 keer met behulp van een 40-keers objectieve en plaats de punt van de elektrode net over de cel van de endotheelbuis. Pas het fotometrische venster aan met behulp van de fotometriesoftware om zich te concentreren op ongeveer 50 tot 80 endotheelcellen.Plaats vervolgens voorzichtig de elektrode in een van de cellen van de endotheelbuis met behulp van de micromanipulator en wacht minstens twee minuten tot het rustende membraanpotentieel is gestabiliseerd. Zodra het rustmembraanpotentieel stabiel is bij de verwachte waarde, schakelt u de fotomultiplierbuis op de fluorescentie-interface in bij afwezigheid van licht en begin met de verwerving van de intracellulaire calciumconcentratie door fura-2 afwisselend op 340 en 380 nanometer te opwekken terwijl ze de bloeiemissie op 510 nanometer verzamelt. Zodra gelijktijdige metingen van membraanpotentieel en intracellulaire calciumconcentratie zijn vastgesteld, moet de superfusie van endotheelbuis met PSS bij een constante laminaire stroomsnelheid vóór de toepassing van geneesmiddelen ongeveer vijf minuten toestaan.Breng het geneesmiddel bereid in PSS aan op de superfusiekamer met een constante stroomsnelheid. Tijdens de behandeling van geneesmiddelen meet het membraanpotentieel in de F340/F380-verhoudingen tegelijkertijd. Zodra het experiment is gedaan, trek de elektrode uit de cel.Stop vervolgens de respectievelijke opnames van membraanpotentieel en intracellulaire calciumconcentratie en sla de bestanden op voor gegevensanalyse. Dit is een differentiële interferentie contrast beeld van een muis cerebrale arteriële endotheel buis, aangepast voor experiment in fotometrische venster met behulp van een 40 keer doelstelling. Een scherpe elektrode wordt in een cel geplaatst, zoals bovenaan het beeld wordt weergegeven.Hier zijn de voorbeelden van ruwe sporen voor gelijktijdige meting van F340/F380 ratio en membraan potentieel in reactie op 100 micromolar ATP. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals confocale fluorescerende microscopie worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden met betrekking tot microdomeinsignalering van endotheelcalcium en reactieve zuurstofsoorten, als voorbeelden. In het algemeen zal deze techniek de weg blijven effenen voor onderzoeken in cellulaire fysiologie om vasculaire functie en veroudering in de bloed- en lymfecirculatie te onderzoeken.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

Het meten van de buurt plasmamembraan en Global intracellulair calcium Dynamics in Astrocyten

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

Isolatie van Human atriale Myocyten voor gelijktijdige metingen van Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Transients en Membraan Currents

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Intravitale Microscopy for Imaging Subcellulaire Structuren in Levende muizen die fluorescerende eiwitten

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Beoordeling van Calcium Sparks in Intact Skeletal spiervezels

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

Cytosole Calcium Metingen in Renal epitheelcellen door flowcytometrie

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli

Single-channel Analyse en Calcium Imaging in de podocytes van de Vers geisoleerde glomeruli

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

De geïsoleerde Mouse perfusie Kidney Techniek

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Gelijktijdige meting van mitochondriale calcium en mitochondriale membraan potentieel in levende cellen door fluorescentie microscopie

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolatie van hoogwaardige murine atriale en ventriculaire myocyten voor gelijktijdige metingen van Ca2+ transiënten en L-type calciumstroom

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Isolating and Imaging Live, Intact Pacemaker Regions of Mouse Renal Pelvis by Vibratome Sectioning

Isoleren en beeldvorming Live, intact pacemakergebieden van het nierbekken van de muis door vibratoomsecties

The renal pelvis (RP) is a funnel-shaped, smooth muscle structure that facilitates normal urine transport from the kidney to the ureter by regular, ...