Name: simultaneous measurements of intracellular calcium and membrane potential in freshly isolated and intact mouse cerebral endothelium
Uploaded: 2019-01-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium at JoVE.com

Wir danken Charles Hewitt für ausgezeichnete technische Unterstützung beim Aufbau, Ausrüstung und Zubehör für die aktuellen Protokolle erforderlich. Wir danken Dr. Sean M. Wilson und Christopher G. Wilson aus dem ETA-Zentrum für perinatale Biologie, für die uns mit einer zusätzlichen inversen Mikroskop und Elektrometer, bzw.. Diese Forschung wurde durch die National Institutes of Health Grant R00-AG047198 (EJB) und Loma Linda University School of Medicine neue Fakultät für Start-up-Fonds unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health.

Bevor Sie die folgenden Experimente durchführen, sicherzustellen, dass alle Tierpflege verwenden und Protokolle sind vom Tier Heimen und verwenden Committee (IACUC) genehmigt und durchgeführt in Übereinstimmung mit der National Research Council " "Guide für die Pflege und Nutzung der Versuchstieren" " (8th Edition, 2011) und die ARRIVE-Richtlinien. Die IACUC der Loma Linda Universität genehmigt alle Protokolle für diese Handschrift für männliche und weibliche C57BL/6 Mäusen (Altersgr...

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	<li>Longden, T. A., Hill-Eubanks, D. C., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channel+networks+in+the+control+of+cerebral+blood+flow.">Ion channel networks in the control of cerebral blood flow.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 36 (3), 492-512 (2016).</li><li>Chen, B. R., Kozberg, M. G., Bouchard, M. B., Shaik, M. A., Hillman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+role+for+the+vascular+endothelium+in+functional+neurovascular+coupling+in+the+brain.">A critical role for the vascular endothelium in functional neurovascular coupling in the brain.</a> Journal of the American Heart Association. 3 (3), e000787 (2014).</li><li>Iadecola, C., Yang, G., Ebner, T. J., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+and+propagated+vascular+responses+evoked+by+focal+synaptic+activity+in+cerebellar+cortex.">Local and propagated vascular responses evoked by focal synaptic activity in cerebellar cortex.</a> Journal of Neurophysiology. 78 (2), 651-659 (1997).</li><li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+blood+flow+in+the+microcirculation:+role+of+conducted+vasodilation.">Regulation of blood flow in the microcirculation: role of conducted vasodilation.</a> Acta Physiologica (Oxford, England). 202 (3), 271-284 (2011).</li><li>Garland, C. J., Dora, K. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+endothelial+intermediate+conductance+KCa+channels+in+cerebral+EDHF-mediated+dilations.">Role of endothelial intermediate conductance KCa channels in cerebral EDHF-mediated dilations.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (4), H1590-H1599 (2003).</li><li>Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+electrical+signaling+in+arterial+endothelial+tubes:+New+insights+into+cellular+physiology+and+cardiovascular+function.">Calcium and electrical signaling in arterial endothelial tubes: New insights into cellular physiology and cardiovascular function.</a> Microcirculation. 24 (3), (2017).</li><li>Endemann, D. H., Schiffrin, E. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+effects+on+morphological+integrity+and+Ca2++signaling+in+freshly+isolated+murine+feed+artery+endothelial+cell+tubes.">Temperature effects on morphological integrity and Ca2+ signaling in freshly isolated murine feed artery endothelial cell tubes.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (3), H773-H783 (2011).</li><li>Socha, M. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+microvascular+endothelial+tubes+from+mouse+resistance+arteries.">Isolation of microvascular endothelial tubes from mouse resistance arteries.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), (2013).</li><li>Ye, X., Beckett, T., Bagher, P., Garland, C. J., Dora, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-A+inhibits+agonist-mediated+Ca2++responses+and+activation+of+IKCa+channels+in+mouse+resistance+artery+endothelial+cells.">VEGF-A inhibits agonist-mediated Ca2+ responses and activation of IKCa channels in mouse resistance artery endothelial cells.</a> The Journal of Physiology. , (2018).</li><li>Norton, C. E., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcitonin+gene-related+peptide+hyperpolarizes+mouse+pulmonary+artery+endothelial+tubes+through+KATP+channel+activation.">Calcitonin gene-related peptide hyperpolarizes mouse pulmonary artery endothelial tubes through KATP channel activation.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular. , (2018).</li><li>Behringer, E. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potential+governs+calcium+influx+into+microvascular+endothelium:+integral+role+for+muscarinic+receptor+activation.">Membrane potential governs calcium influx into microvascular endothelium: integral role for muscarinic receptor activation.</a> The Journal of Physiology. 593 (20), 4531-4548 (2015).</li><li>Behringer, E. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Aging+on+Calcium+Signaling+and+Membrane+Potential+in+Endothelium+of+Resistance+Arteries:+A+Role+for+Mitochondria.">Impact of Aging on Calcium Signaling and Membrane Potential in Endothelium of Resistance Arteries: A Role for Mitochondria.</a> The Journal of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 72 (12), 1627-1637 (2017).</li><li>Behringer, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+electrical+dynamics+in+lymphatic+endothelium.">Calcium and electrical dynamics in lymphatic endothelium.</a> The Journal of Physiology. 595 (24), 7347-7368 (2017).</li><li>Simmers, M. B., Pryor, A. W., Blackman, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arterial+shear+stress+regulates+endothelial+cell-directed+migration,+polarity,+and+morphology+in+confluent+monolayers.">Arterial shear stress regulates endothelial cell-directed migration, polarity, and morphology in confluent monolayers.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiolog. 293 (3), H1937-H1946 (2007).</li><li>Sandow, S. L., Grayson, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limits+of+isolation+and+culture:+intact+vascular+endothelium+and+BKCa.">Limits of isolation and culture: intact vascular endothelium and BKCa.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 297 (1), H1-H7 (2009).</li><li>Diaz-Otero, J. M., Garver, H., Fink, G. D., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+is+associated+with+changes+to+the+biomechanical+properties+of+the+posterior+cerebral+artery+and+parenchymal+arterioles.">Aging is associated with changes to the biomechanical properties of the posterior cerebral artery and parenchymal arterioles.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (3), H365-H375 (2016).</li><li>Kochukov, M. Y., Balasubramanian, A., Abramowitz, J., Birnbaumer, L., Marrelli, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+endothelial+transient+receptor+potential+C3+channel+is+required+for+small+conductance+calcium-activated+potassium+channel+activation+and+sustained+endothelial+hyperpolarization+and+vasodilation+of+cerebral+artery.">Activation of endothelial transient receptor potential C3 channel is required for small conductance calcium-activated potassium channel activation and sustained endothelial hyperpolarization and vasodilation of cerebral artery.</a> Journal of the American Heart Association. 3 (4), (2014).</li><li>Zhang, L., Papadopoulos, P., Hamel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+TRPV4+channels+mediate+dilation+of+cerebral+arteries:+impairment+and+recovery+in+cerebrovascular+pathologies+related+to+Alzheimer's+disease.">Endothelial TRPV4 channels mediate dilation of cerebral arteries: impairment and recovery in cerebrovascular pathologies related to Alzheimer's disease.</a> British Journal of Pharmacology. 170 (3), 661-670 (2013).</li><li>Socha, M. J., Domeier, T. L., Behringer, E. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+intercellular+Ca2++signaling+in+endothelial+cell+tubes+of+mouse+resistance+arteries.">Coordination of intercellular Ca2+ signaling in endothelial cell tubes of mouse resistance arteries.</a> Microcirculation. 19 (8), 757-770 (2012).</li></ol>

Angesichts der jüngsten Entwicklungen6,15,16,17zeigen wir nun die Methode zur Isolierung Maus zerebralen arteriellen Endothel in Vorbereitung für die gleichzeitige Messung von [Ca2 +] i und Vm zugrunde liegenden EDH konsequent für ~ 2 h bei 37 ° C. Obwohl es technisch schwierig ist, messen wir Zell-zu-Zell-Kupplung sowie (siehe Referenz6</s...

Blutfluss im Gehirn wird durch die Koordination der Vasodilatation bei zerebralen Arterien und Arteriolen in vaskulären Netzwerken1geregelt. Endothelzellen Futter zerebralen Arterien Befehl Widerstandsänderungen vaskulären Durchmesser je nach Bedarf für die metabolische Nachfrage von Neuronen1,2,3. Insbesondere während der Endothel-derived Hyperpolarisation (allgemein bekannt als EDH) intrazelluläre Ca2 + ([Ca2 +]ich) und elektrische Signalisierung in Endothelzellen koordinieren Vasodilatation unter den Endothelzellen und ihre umgebenden glatten Muskelzellen durch Gap Junctions für arterielle Entspannung4. Physiologische Einleitung des EDH beinhaltet nacheinander Stimulierung des G-Q-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs), eine Zunahme [Ca2 +]ichund Aktivierung von Endothelzellen kleine und Intermediate-Ca2 +-aktiviert K+ (SKCa/IKCa) Kanäle zu zerebralen Endothelzellen Membran potenzielle (Vm)5,6,7hyperpolarize. So ist das innige Verhältnis von Endothelzellen [Ca2 +]ich und Vm Blut Durchflussregulierung integraler Bestandteil und unverzichtbar für Kardio- und zerebrovaskuläre Funktion6,8. In der breiteren Literatur haben zahlreiche Studien die Assoziation von vaskulären endothelialen Dysfunktion mit der Entwicklung von chronischen Krankheiten (z.B. Bluthochdruck, Diabetes, Herzinsuffizienz, koronare Herzkrankheit, chronische Niereninsuffizienz, berichtet. periphere Herzkrankheit)9,10, was die Bedeutung des Studiums Endothelfunktion in physiologischen und pathologischen Bedingungen.
Vaskulären Endothel ist ein wesentlicher Bestandteil für die Produktion von Hyperpolarisation, Vasodilatation und Gewebedurchblutung und somit Prüfung seiner nativen zellulären Eigenschaften entscheidend. Als eine allgemeine Studienmodell Vorbereitung des arteriellen endothelial Rohr Mausmodells vor Skelettmuskulatur11,12, Darm13, Lunge14, und vor kurzem für das Gehirn6erschienen. Studien zur gleichzeitigen [Ca2 +]ich und Vm Messungen sind insbesondere für skelettartigen Muskel arteriellen Endothel15,16 , sowie Lymphgefäßsystem Endothel17erschienen. Neben Primärstudien unter Verwendung des endothelialen Rohr Ansatzes kann ein umfassender Überblick über die vor- und Nachteile8 konsultiert werden, um festzustellen, ob diese experimentelle Werkzeug für eine spezifische Studie geeignet ist. Kurz gesagt, ein Vorteil ist, dass die physiologische Schlüsselkomponenten der endothelial Zelle Funktion beibehalten werden (z. B., Ca2 + Zustrom und intrazellulären freilassen, Hyperpolarisation der Vm bis das Nernst-Potenzial für K+ über SKCa/IKCa Aktivierung und endotheliale interzellulären Kopplung über Lücke Kreuzungen) ohne Störfaktoren wie perivaskuläre Nerven Input, glatte Muskulatur Voltage-gated Kanal Funktion und Kontraktilität, Zirkulation von Blut und hormonelle Einflüsse8. Im Gegensatz dazu häufig verwendete Zelle Kultur Ansätze einzuführen erhebliche Veränderungen in der Morphologie18 und Ionen-Kanal Ausdruck19 in einer Weise, die Vergleiche auf physiologische Beobachtungen bestimmt ex Vivo stark verschleiern kann oder in Vivo. Einschränkungen umfassen eine mangelnde Integration mit anderen wesentlichen Komponenten für die Regulierung der Durchblutung, wie glatte Muskulatur und eingeschränkte Flexibilität in einem experimentellen Zeitplan, wie dieses Modell optimal innerhalb von 4 h der intakten Kreislauf Segment isoliert getestet wird vom Tier.
Gebäude aus einem vorherigen video Protokoll verfasst von Socha und Segal12 und experimentellen Entwicklungen in der interim6,15,16, zeigen wir Ihnen hiermit die Isolation der frischen Endothel von hinteren Hirnarterien und gleichzeitige Messungen von Endothelzellen [Ca2 +]ich und Vm mit Fura-2 Photometrie und intrazellulären scharfe Elektroden bzw.. Darüber hinaus beinhaltet dieses Experiment kontinuierliche Superfusion von Salzlösungen und pharmakologische Wirkstoffe unter physiologischen Bedingungen (pH 7.4, 37 ° C). Wir entschieden uns für die hinteren zerebralen Arterie wie es isolierte Endothel mit der strukturellen Integrität (Zellen über Gap Junctions verbunden) und ausreichend Abmessungen (Breite ≥50 µm, Länge ≥300 µm) für Intra- und interzellulären Signal entlang und unter ergibt Endothelzellen. Darüber hinaus Studien der Nager hinteren zerebralen Arterie werden im Wesentlichen in der Literatur dargestellt und umfassen die Prüfung der grundlegenden endotheliale Signalisierung Mechanismen, vaskuläre Entwicklung/Altern und Pathologie20, 21 , 22. Diese experimentelle Anwendung wird voraussichtlich eine Hochdurchsatz-Analyse der zerebralen Endothelfunktion (und Dysfunktion) führen und ermöglicht dadurch erhebliche Fortschritte im Verständnis der Blut-Durchfluss-Verordnung in der gesamten Altern und die Entwicklung der Neurodegenerative Erkrankung.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)</td>
			<td>A466250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase (Type H Blend)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithioerythritol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2 AM dye</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>F14185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recirculating chiller (Isotemp 500LCU)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>13874647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglas superfusion chamber&#160;</td>
			<td>Warner Instruments, Camden, CT, USA</td>
			<td>RC-27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip bottom (2.4&#160;&#215;&#160;5.0&#160;cm)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12-548-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anodized aluminum platform (diameter: 7.8&#160;cm)&#160;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PM6 or PH6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact aluminum stage&#160;</td>
			<td>Siskiyou, Grants Pass, OR, USA</td>
			<td>8090P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>&#160;MX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscopes&#160;</td>
			<td>Zeiss, NY, USA</td>
			<td>Stemi 2000 &#38; 2000-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber optic light sources</td>
			<td>&#160;Schott, Mainz, Germany &#38; KL200, Zeiss</td>
			<td>Fostec 8375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon inverted microscope</td>
			<td>Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA</td>
			<td>Ts2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast objectives&#160;</td>
			<td>Nikon Instruments Inc</td>
			<td>&#160;(Ph1 DL; 10X &#38; 20X)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent objectives&#160;</td>
			<td>Nikon Instruments Inc</td>
			<td>20X (S-Fluor), and 40X (Plan Fluor)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon inverted microscope</td>
			<td>Nikon Instruments Inc</td>
			<td>Eclipse TS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsyringe pump controller (Micro4 )&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA</td>
			<td>SYS-MICRO4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration isolation table</td>
			<td>Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA</td>
			<td>&#160;Micro-g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifiers</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td>
			<td>Axoclamp 2B &#38; Axoclamp 900A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headstages&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>HS-2A &#38; HS-9A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function generator&#160;</td>
			<td>EZ Digital, Seoul, South Korea</td>
			<td>FG-8002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Acquision System</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td>
			<td>Digidata 1550A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Audible Baseline Monitors</td>
			<td>Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA</td>
			<td>&#160;BM-A-TM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Storage Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix, Beaverton, Oregon, USA</td>
			<td>&#160;TDS 2024B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence System Interface, ARC Lamp + Power Supply, Hyperswitch, PMT</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td>
			<td>IonOptix Systems</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Controller&#160;&#160;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-344B or C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline Heater&#160;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SH- 27B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valve Controller&#160;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>VC-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline Flow Control Valve</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>&#160;FR-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic Puller&#160;</td>
			<td>Sutter Instruments, Novato, CA, USA</td>
			<td>P-97 or P-1000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige, East Meadow, NY, USA</td>
			<td>&#160;MF-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Tubes (Trituration)</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA</td>
			<td>1B100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Tubes (Pinning)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>G150T-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Tubes (Sharp Electrodes)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>GC100F-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter (0.22 &#181;m)&#160;&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>722-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri Dish + Charcoal Sylgard</td>
			<td>Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA</td>
			<td>DD-90-S-BLK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Style Scissors (3 mm &#38; 9.5&#160;mm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>555640S, 14364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors 3 &#38; 7 mm blades</td>
			<td>Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA</td>
			<td>Moria MC52 &#38; 15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharpened fine-tipped forceps&#160;</td>
			<td>FST</td>
			<td>Dumont #5 &#38; Dumont #55</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous measurements of intracellular calcium and membrane potential in freshly isolated and intact mouse cerebral endothelium

Zerebralen Arterien und ihre jeweiligen Mikrozirkulation liefern Sauerstoff und Nährstoffe an das Gehirn über Blut Durchflussregulierung. Endothelzellen säumen das Lumen der Blutgefäße und Befehl Änderungen im vaskulären Durchmesser je nach Bedarf für die metabolische Nachfrage von Neuronen. Primäre Endothel-abhängige Signalwege der Hyperpolarisation des Membranpotentials (Vm) und Stickoxid-arbeiten in der Regel parallel zur Vermittlung Vasodilatation und steigern somit die Durchblutung. Obwohl integrale zur Koordinierung der Vasodilatation über mehrere Millimeter der vaskulären Länge wurden Bestandteile der Endothel-derived Hyperpolarisation (EDH) historisch schwierig zu messen. Diese Komponenten des EDH beinhalten intrazellulären Ca2 + [Ca2 +]ich erhöht und anschließende Aktivierung von klein - und Mittelstufe Leitwert Ca2 +-aktiviert K+ (SKCa/IKCa) Kanäle.
Hier präsentieren wir Ihnen eine vereinfachte Darstellung der Isolation des frischen Endothel von Maus zerebralen Arterien; gleichzeitige Messung von Endothelzellen [Ca2 +]ich und Vm mit Fura-2 Photometrie und intrazellulären scharfe Elektroden bzw.; und eine kontinuierliche Superfusion von Salzlösungen und pharmakologische Wirkstoffe unter physiologischen Bedingungen (pH 7.4, 37 ° C). Hintere Hirnarterien aus dem Kreis von Willis entfernt die hinteren kommunizieren und die Kameraausrüstung Arterien frei. Enzymatische Verdauung von gereinigten hinteren zerebralen arteriellen Segmente und anschließenden Verreibung erleichtert die Entfernung der Adventitia, perivaskuläre Nerven und glatten Muskelzellen. Resultierende hintere zerebrale arterielle Endothelzellen "Röhren" sind dann unter dem Mikroskop gesichert und mit einer Kamera, Photomultiplier Tube, und ein bis zwei Stromzähler unter kontinuierlicher Superfusion untersucht. Gemeinsam kann diese Methode gleichzeitig Änderungen in Endothelzellen [Ca2 +]ich und Vm in diskreten zellulären lagen, neben der Verbreitung des EDH durch Lücke Kreuzungen bis zu Millimeter Abstand entlang der intakten messen Endothel. Diese Methode wird voraussichtlich eine Hochdurchsatz-Analyse der zugrunde liegenden Blut fließen Regulationsmechanismen im normalen und kranken Gehirn endothelialen Gehirnfunktionen ergeben.

Die schematische Demonstration des oben beschriebenen Protokolls ist in den beigefügten Abbildungen gezeigt. Abbildung 1Azeigt eine Gehirn von einem jungen Erwachsenen männlichen C57BL/6N Maus (5 Monate) isoliert. Hintere Hirnarterien sind sorgfältig isoliert aus dem Kreis von Willis, ohne Bindegewebe entfernt, und schneiden Sie in Segmente (Abbildung 1 b-D). Aus teilweise verdaute arteriellen Segmente das int...

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Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium

Hier demonstriert werden Protokolle zur intakten zerebralen Endothelzellen "Röhren" und (2) die gleichzeitige Messung von endothelialen Kalzium und Membranpotential im Endothel-derived Hyperpolarisation (1) frisch zu isolieren. Des weiteren können diese Methoden für die pharmakologische Optimierung von Endothelzellen Kalzium und elektrische Signalisierung als Einzel- oder interaktive experimentellen Variablen.

Gleichzeitige Messung von intrazellulären Calcium und Membrane Potential in frisch isolierte und intakte Maus zerebralen Endothel

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the ...

Diese Methode kann helfen, schlüsselhafte Fragen auf dem Gebiet der zerebralen Gefäßphysiologie zu beantworten, da sie sich auf die Regulierung des zerebralen Durchblutungsflusses während des Alterns und der Entwicklung chronischer Krankheiten bezieht. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie die gleichzeitige Messung des intrazellulären Kalziums und des Membranpotentials des zerebralen arteriellen Endothels in seiner nativen Form unter physiologischen Bedingungen ermöglicht. Um das Maushirn zu isolieren, entfernen Sie unter dem Mikroskop die Haut und haare über dem Schädel.Und entfernen Sie übermäßiges Blut mit kaltem kalziumfreiem PSS. Als nächstes machen Sie einen Schnitt nur mit den Spitzen der Standard-Sezierschere. Ausgehend vom okzipitalen Knochen und sich durch den Nasenbein des Schädels.Öffnen Sie dann vorsichtig den Schädel entlang des Schnittes, indem Sie grobspitzen Zangen verwenden und das Bindegewebe trennen, um das Gehirn freizulegen. Waschen Sie das isolierte Gehirn vorsichtig mit kaltem kalziumfreiem PSS in einem Becher, um das Blut zu entfernen. Legen Sie die hirnventrale Seite in eine Kammer, die eine kalte Dissektionslösung zur Isolierung von Hirnarterien enthält.Um die Zerebralparese zu isolieren, sichern Sie das isolierte Gehirn in kalter Dissektionslösung, indem Sie zwei Edelstahlstifte durch sie in eine mit Kohle infundierte Siliziumpolymerbeschichtung an der Unterseite einer Glaspetrischale einfügen. Anschließend isolieren Sie die hinteren Hirnarterien operativ um 0,3 bis 0,5 Zentimeter von den hinteren Kommunikations- und Basilararterien. Verwenden Sie Edelstahlstifte, um beide isolierten hinteren Hirnarterien in der Dissektionslösung in der Petrischale zu sichern.Reinigen Sie dann die isolierten hinteren Hirnarterien sorgfältig, indem Sie Bindegewebe mit geschärften Feinspitzendrücken entfernen. Schneiden Sie die intakten Arterien zur enzymatischen Verdauung in ein bis zwei Millimeter Segmente. Bereiten Sie bei diesem Verfahren das Triturationsgerät mit einem Mikroskop, einer Kamera und einer Aluminiumbühne vor, die eine Kammer und Mikromanipulatoren hält.Sichern Sie eine Mikrospritze mit einem Pumpenregler neben der Bühne und der Probe. Als nächstes eine Titrationspipette komplett mit Mineralöl füllen und über den Mikrospritzkolben sichern. Dann mit der Mikrospritze mit dem Pumpenregler ziehen Sie etwa 130 Nanoliter Dissoziationslösung in die Pipette, während das Fehlen von Luftblasen zu gewährleisten.Anschließend intakte arterielle Segmente in einen Milliliter Dissoziationslösung mit erforderlichen Enzymkonzentrationen in einem 10 Milliliter Glasrohr platzieren. Bei 34 Grad Celsius für 10 bis 12 Minuten für die teilweise Verdauung inkubieren. Ersetzen Sie nach der Verdauung die Enzymlösung durch fünf Milliliter frischer Dissoziationslösung.Mit einer 1-Milliliter-Pipette ein Segment bei Raumtemperatur in die Kammer mit Dissoziationslösung übertragen. Als nächstes die Pipette in die Dissoziationslösung in der Kammer legen und nahe an einem Ende des verdauten Gefäßes positionieren. Stellen Sie eine Rate im Bereich von zwei bis fünf Nanoliterpro Sekunde auf dem Pumpenregler für sanfte Trituration ein.Beim Betrachten durch 100-mal bis 200-fache Vergrößerung ziehen Sie sich zurück und werfen sie das arterielle Segment aus, um glatte Muskelzellen zu dissoziieren, während sie ein Endothelrohr erzeugen. Verwenden Sie bei Bedarf sorgfältig feingekippte Zangen, um dissoziierte Adventitien und interne elastische Lamina vom Endothelrohr zu trennen. Bestätigen Sie, dass alle glatten Muskelzellen dissoziiert sind und dass nur Endothelzellen als intakte Röhre erhalten bleiben.Mit Mikromanipulatoren, sichern Sie jedes Ende des Endothelrohrs auf dem Glasdeckelschlupf der Superfusionskammer mit Borosilikatglas-Pinningpipetten. Waschen Sie die dissoziierte Adventitia und glatte Muskelzellen aus der Kammer. Und ersetzen Sie die Dissoziationslösung durch zwei Mol mehr Calciumchlorid PSS.Übertragen Sie die mobile Plattform mit gesichertem Endothelrohr auf das Mikroskop von Superfusion und Versuchsanlage. Verwenden Sie dann sechs saubere 50-Milliliter-Reservoirs für die kontinuierliche Lieferung von PSS und entsprechenden Medikamentenlösungen während des Experiments. Verwenden Sie das Inline-Durchflussregelventil, um den Durchfluss manuell so konsistent wie laminierter zu setzen und gleichzeitig die Durchflusszuführung mit der Vakuumabsaugung abzugleichen.Liefern Sie PSS für die Superfusion des Endothelrohrs für mindestens fünf Minuten in die Kammer, bevor Sie die Hintergrunddaten und die Farbbeladung aufzeichnen. Um das Membranpotential gleichzeitig mit der intrazellulären Kalziumkonzentration zu messen, ziehen Sie eine scharfe Elektrode und füllen Sie sie mit zwei mollaren Kaliumchlorid, um aus Zellen aufzuzeichnen, die mit Fura-2-Farbstoff belastet sind. Um die intrazelluläre Kopplung mittels Farbstofftransfer zu untersuchen, füllen Sie die Mikroelektrode mit 0,1% Propidiumjodid, das in zwei molarem Kaliumchlorid gelöst ist.Als nächstes legen Sie die Elektrode über einen mit Chlorid beschichteten Silberdraht in den Pipettenhalter, der an einer mit einem Mikromanipulator gesicherten Elektrometerkopfstufe befestigt ist. Verwenden Sie den Mikromanipulator, um die Spitze der Elektrode kurz in das fließende PSS in der Kammer zu positionieren, während Sie durch das vierfache Objektiv schauen. Anschließend stellen Sie das ruhende Membranpotential auf Null als konsistent mit dem geerdeten Badpotenzial.Verwenden Sie auf Wunsch hörbare Basismonitore, die mit Elektrometern verbunden sind, um Tonhöhen mit potenziellen Aufnahmen zu verknüpfen. Danach erhöhen Sie die Vergrößerung auf 400 Mal mit einem 40-fachen Objektiv und positionieren Sie die Elektrodenspitze knapp über der Zelle des Endothelrohrs. Passen Sie das fotometrische Fenster mit der Photometrie-Software an, um sich auf etwa 50 bis 80 Endothelzellen zu konzentrieren.Legen Sie dann die Elektrode vorsichtig mit dem Mikromanipulator in eine der Zellen des Endothelrohrs und warten Sie mindestens zwei Minuten, bis sich das ruhende Membranpotenzial stabilisiert. Sobald das ruhende Membranpotential bei seinem erwarteten Wert stabil ist, schalten Sie die Photomultiplierröhre auf der Fluoreszenzschnittstelle in Ermangelung von Licht ein und beginnen sie mit der Erfassung der intrazellulären Kalziumkonzentration durch spannende Fura-2 abwechselnd bei 340 und 380 Nanometern, während sie die Blütenstoffemission bei 510 Nanometern sammelt. Sobald gleichzeitige Messungen des Membranpotentials und der intrazellulären Kalziumkonzentration durchgeführt wurden, lassen Sie etwa fünf Minuten für die Superfusion von Endothelrohr mit PSS bei einer konstanten laminaren Durchflussrate vor der Anwendung von Medikamenten.Tragen Sie das in PSS zubereitete Medikament mit einer konstanten Durchflussrate auf die Superfusionskammer auf. Messen Sie während der medikamentösen Behandlung das Membranpotenzial in den F340/F380-Verhältnissen gleichzeitig. Sobald das Experiment abgeschlossen ist, ziehen Sie die Elektrode aus der Zelle.Dann stoppen Sie die jeweiligen Aufzeichnungen des Membranpotentials und der intrazellulären Kalziumkonzentration und speichern Sie die Dateien für die Datenanalyse. Dies ist ein Differentialinterferenzkontrastbild eines Maus-Zerebralen arteriellen Endothelrohrs, das für Experimente im photometrischen Fenster mit einem 40-fachen Objektiv angepasst wurde. Eine scharfe Elektrode wird in eine Zelle gelegt, wie oben im Bild gezeigt.Hier sind die Beispiele für Rohspuren zur gleichzeitigen Messung des F340/F380-Verhältnisses und des Membranpotenzials als Reaktion auf 100 Mikromolar ATP. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die konfokale Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Mikrodomänensignalisierung von endothelialer Kalzium und reaktiven Sauerstoffspezies als Beispiele zu beantworten. Im Allgemeinen wird diese Technik weiterhin den Weg für Forschungen in der zellulären Physiologie ebnen, um die Vaskuläre Funktion und Alterung im Blut und lymphatischen Kreislauf zu erforschen.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

Messen in der Nähe Plasmamembran und Global intrazellulären Calcium-Dynamics in Astrozyten

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

Forschung

Biologie

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

Isolierung humaner Vorhofmyozyten für gleichzeitige Messungen von Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Transienten und Membrane Currents

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Intravitalmikroskopie zur Imaging subzellulärer Strukturen in lebenden Mäusen Ausdruck Fluoreszierende Proteine

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Bewertung von Calcium in Sparks Intact Skelettmuskelfasern

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

Cytosolischen Calcium Messungen in Nierenepithelzellen mittels Durchflusszytometrie

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli

Einkanal-Analyse und Calcium Imaging in den Podozyten der frisch isolierten Glomeruli

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

Die Maus isoliert perfundierten Nieren-Technik

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Simultane Messung von Mitochondriale Calcium und mitochondrialen Membranpotentials in lebenden Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolierung von hochwertigen atrialen und ventrikulären Myozyten der Maus für die simultane Messung von Ca2+ Transienten und L-Typ Calciumstrom

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Isolating and Imaging Live, Intact Pacemaker Regions of Mouse Renal Pelvis by Vibratome Sectioning

Isolierung und Bildgebung von live, intakten Herzschrittmacherregionen des Nierenbeckens der Maus durch Vibratom-Schnitte

The renal pelvis (RP) is a funnel-shaped, smooth muscle structure that facilitates normal urine transport from the kidney to the ureter by regular, ...