Name: simultaneous measurements of intracellular calcium and membrane potential in freshly isolated and intact mouse cerebral endothelium
Uploaded: 2019-01-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium at JoVE.com

אנו מודים צ'ארלס יואיט לסיוע טכני מעולה בזמן הקמת ציוד ואספקה הדרושים עבור הפרוטוקולים הנוכחי. אנו מודים ד"ר שון וילסון ו כריסטופר וילסון, מהמרכז LLU על ביולוגיה הלידה, על מתן אותנו עם מיקרוסקופ הפוכה נוספים ו אלקטרומטר, בהתאמה. מחקר זה היא נתמכה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים גרנט R00-AG047198 (EJB), לומה לינדה הספר לרפואה של אוניברסיטת סגל חדש ראשונית. התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את הנופים הרשמי של מכוני הבריאות הלאומיים.

לפני ביצוע הניסויים הבאים, להבטיח כי כל טיפול בבעלי חיים להשתמש, פרוטוקולים אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים הוועדה להשתמש (IACUC) וביצע בהסכמה עם המועצה הלאומית למחקר של "מדריך טיפול ושימוש חיות מעבדה" (8th מהדורה, 2011) ואת ההנחיות יגיעו. IACUC של לומה לינדה האוניברסיטה אישר כל ?...

<ol>
	<li>Longden, T. A., Hill-Eubanks, D. C., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channel+networks+in+the+control+of+cerebral+blood+flow.">Ion channel networks in the control of cerebral blood flow.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 36 (3), 492-512 (2016).</li><li>Chen, B. R., Kozberg, M. G., Bouchard, M. B., Shaik, M. A., Hillman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+role+for+the+vascular+endothelium+in+functional+neurovascular+coupling+in+the+brain.">A critical role for the vascular endothelium in functional neurovascular coupling in the brain.</a> Journal of the American Heart Association. 3 (3), e000787 (2014).</li><li>Iadecola, C., Yang, G., Ebner, T. J., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+and+propagated+vascular+responses+evoked+by+focal+synaptic+activity+in+cerebellar+cortex.">Local and propagated vascular responses evoked by focal synaptic activity in cerebellar cortex.</a> Journal of Neurophysiology. 78 (2), 651-659 (1997).</li><li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+blood+flow+in+the+microcirculation:+role+of+conducted+vasodilation.">Regulation of blood flow in the microcirculation: role of conducted vasodilation.</a> Acta Physiologica (Oxford, England). 202 (3), 271-284 (2011).</li><li>Garland, C. J., Dora, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EDH:+endothelium-dependent+hyperpolarization+and+microvascular+signalling.">EDH: endothelium-dependent hyperpolarization and microvascular signalling.</a> Acta Physiologica (Oxford, England). 219 (1), 152-161 (2017).</li><li>Hakim, M. A., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+dynamics+of+isolated+cerebral+and+skeletal+muscle+endothelial+tubes:+Differential+roles+of+G-protein-coupled+receptors+and+K++channels.">Electrical dynamics of isolated cerebral and skeletal muscle endothelial tubes: Differential roles of G-protein-coupled receptors and K+ channels.</a> Pharmacology Research &amp; Perspectives. 6 (2), e00391 (2018).</li><li>Marrelli, S. P., Eckmann, M. S., Hunte, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+endothelial+intermediate+conductance+KCa+channels+in+cerebral+EDHF-mediated+dilations.">Role of endothelial intermediate conductance KCa channels in cerebral EDHF-mediated dilations.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (4), H1590-H1599 (2003).</li><li>Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+electrical+signaling+in+arterial+endothelial+tubes:+New+insights+into+cellular+physiology+and+cardiovascular+function.">Calcium and electrical signaling in arterial endothelial tubes: New insights into cellular physiology and cardiovascular function.</a> Microcirculation. 24 (3), (2017).</li><li>Endemann, D. H., Schiffrin, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+dysfunction.">Endothelial dysfunction.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 15 (8), 1983-1992 (2004).</li><li>Rajendran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vascular+endothelium+and+human+diseases.">The vascular endothelium and human diseases.</a> International Journal of Biological Sciences. 9 (10), 1057-1069 (2013).</li><li>Socha, M. J., Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+effects+on+morphological+integrity+and+Ca2++signaling+in+freshly+isolated+murine+feed+artery+endothelial+cell+tubes.">Temperature effects on morphological integrity and Ca2+ signaling in freshly isolated murine feed artery endothelial cell tubes.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (3), H773-H783 (2011).</li><li>Socha, M. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+microvascular+endothelial+tubes+from+mouse+resistance+arteries.">Isolation of microvascular endothelial tubes from mouse resistance arteries.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), (2013).</li><li>Ye, X., Beckett, T., Bagher, P., Garland, C. J., Dora, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-A+inhibits+agonist-mediated+Ca2++responses+and+activation+of+IKCa+channels+in+mouse+resistance+artery+endothelial+cells.">VEGF-A inhibits agonist-mediated Ca2+ responses and activation of IKCa channels in mouse resistance artery endothelial cells.</a> The Journal of Physiology. , (2018).</li><li>Norton, C. E., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcitonin+gene-related+peptide+hyperpolarizes+mouse+pulmonary+artery+endothelial+tubes+through+KATP+channel+activation.">Calcitonin gene-related peptide hyperpolarizes mouse pulmonary artery endothelial tubes through KATP channel activation.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular. , (2018).</li><li>Behringer, E. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potential+governs+calcium+influx+into+microvascular+endothelium:+integral+role+for+muscarinic+receptor+activation.">Membrane potential governs calcium influx into microvascular endothelium: integral role for muscarinic receptor activation.</a> The Journal of Physiology. 593 (20), 4531-4548 (2015).</li><li>Behringer, E. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Aging+on+Calcium+Signaling+and+Membrane+Potential+in+Endothelium+of+Resistance+Arteries:+A+Role+for+Mitochondria.">Impact of Aging on Calcium Signaling and Membrane Potential in Endothelium of Resistance Arteries: A Role for Mitochondria.</a> The Journal of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 72 (12), 1627-1637 (2017).</li><li>Behringer, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+electrical+dynamics+in+lymphatic+endothelium.">Calcium and electrical dynamics in lymphatic endothelium.</a> The Journal of Physiology. 595 (24), 7347-7368 (2017).</li><li>Simmers, M. B., Pryor, A. W., Blackman, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arterial+shear+stress+regulates+endothelial+cell-directed+migration,+polarity,+and+morphology+in+confluent+monolayers.">Arterial shear stress regulates endothelial cell-directed migration, polarity, and morphology in confluent monolayers.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiolog. 293 (3), H1937-H1946 (2007).</li><li>Sandow, S. L., Grayson, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limits+of+isolation+and+culture:+intact+vascular+endothelium+and+BKCa.">Limits of isolation and culture: intact vascular endothelium and BKCa.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 297 (1), H1-H7 (2009).</li><li>Diaz-Otero, J. M., Garver, H., Fink, G. D., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+is+associated+with+changes+to+the+biomechanical+properties+of+the+posterior+cerebral+artery+and+parenchymal+arterioles.">Aging is associated with changes to the biomechanical properties of the posterior cerebral artery and parenchymal arterioles.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (3), H365-H375 (2016).</li><li>Kochukov, M. Y., Balasubramanian, A., Abramowitz, J., Birnbaumer, L., Marrelli, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+endothelial+transient+receptor+potential+C3+channel+is+required+for+small+conductance+calcium-activated+potassium+channel+activation+and+sustained+endothelial+hyperpolarization+and+vasodilation+of+cerebral+artery.">Activation of endothelial transient receptor potential C3 channel is required for small conductance calcium-activated potassium channel activation and sustained endothelial hyperpolarization and vasodilation of cerebral artery.</a> Journal of the American Heart Association. 3 (4), (2014).</li><li>Zhang, L., Papadopoulos, P., Hamel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+TRPV4+channels+mediate+dilation+of+cerebral+arteries:+impairment+and+recovery+in+cerebrovascular+pathologies+related+to+Alzheimer's+disease.">Endothelial TRPV4 channels mediate dilation of cerebral arteries: impairment and recovery in cerebrovascular pathologies related to Alzheimer's disease.</a> British Journal of Pharmacology. 170 (3), 661-670 (2013).</li><li>Socha, M. J., Domeier, T. L., Behringer, E. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+intercellular+Ca2++signaling+in+endothelial+cell+tubes+of+mouse+resistance+arteries.">Coordination of intercellular Ca2+ signaling in endothelial cell tubes of mouse resistance arteries.</a> Microcirculation. 19 (8), 757-770 (2012).</li></ol>

לאור האחרונות התפתחויות6,15,16,17, נדגים כעת את השיטה כדי לבודד את העכבר אנדותל עורקי מוחין לקראת מדידה סימולטני של [Ca2 +] אני ו- Vm שבבסיס EDH בעקביות על ~ 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס. למרות שטכנית קשה, אנו יכולים למדוד-?...

זרימת הדם ברחבי המוח מוסדר על ידי התיאום של vasodilation בין העורקים המוחיים רבים רשתות כלי דם1. תאי אנדותל רירית מוחי התנגדות העורקים פקודה משתנה קוטר כלי הדם לפי הצורך לפגוש את הדרישה המטבולית של נוירונים1,2,3. בפרט, במהלך hyperpolarization נגזר אנדותל (הידוע בכינויו EDH), Ca תאיים2 + ([Ca2 +]אני) ההספק ואת האותות חשמליים, תאי אנדותל vasodilation לתאם בין תאי אנדותל שלהם תאי שריר חלק שמסביב דרך צמתים הפער עבור הרפיה עורקים4. חניכה פיזיולוגיים של EDH כרוכה ברצף גירוי של Gq-בשילוב קולטנים (GPCRs), עלייה [Ca2 +]אני, והפעלה של אנדותל קטן - ו ביניים-קה2 +-מופעל K+ (SKCaגבירותייCa) ערוצים hyperpolarize מוחי ממברנה אנדותל פוטנציאליים (Vm)5,6,7. לכן, הקשר האינטימי של אנדותל [Ca2 +]אני ו- Vm הוא חלק בלתי נפרד ויסות זרימת דם והכרחי cardio -, פונקציה כשאבדן6,8. בכל הספרות רחבה יותר, מחקרים רבים דיווחו על איגוד בתפקוד אנדותל כלי הדם עם התפתחותן של מחלות כרוניות (כגון: יתר לחץ דם, סוכרת, אי ספיקת לב, מחלת עורקים כללית, אי ספיקת כליות כרונית, מחלת עורקים היקפיים)9,10, המציין את המשמעות של הלומדים פונקציה אנדותל בתנאים פיזיולוגיים, כמו גם פתולוגי.
אנדותל כלי הדם הינו חיוני להצלחת תהליך הייצור של hyperpolarization, vasodilation רקמות זלוף, לפיכך, בחינת תכונותיו הסלולר מקורית היא קריטית. כמודל כללי מחקר, הכנת דגם צינור אנדותל עורקי העכבר שפורסם לפני על שרירי השלד11,12, הבטן13, ריאות14, ועל לאחרונה את המוח6. מחקרים של סימולטני [Ca2 +]אני ומדידות Vm בפרט פורסמו שרירי השלד אנדותל עורקי15,16 , כמו גם כלי הלימפה אנדותל17. בנוסף ראשי לימודי ניצול הגישה צינור אנדותל, סקירה מקיפה של יתרונות וחסרונות8 ניתן להתייעץ עם כדי לקבוע אם כלי ניסיוני זה מתאים למחקר ספציפי. בקצרה, יתרון זה רכיבי מפתח פיזיולוגיים של תפקוד תאי אנדותל נשמרות (למשל, Ca2 + זרם ושחרור תאיים, hyperpolarization של Vm עד פוטנציאל נרנסט עבור K+ ויה SKCaגבירותייCa הפעלה, והצמתים אנדותל צימוד המערכת באמצעות הפער) ללא בלבול גורמים כגון קלט עצבי perivascular, הפונקציה ערוץ ממותגת מתח שריר חלק contractility, מחזור הדם ואת השפעות הורמונליות8. לעומת זאת, גישות התרבות התא נפוץ להציג שינויים משמעותיים מורפולוגיה18 ויון ערוץ ביטוי19 בצורה מאוד יכול המאפילים על השוואות אל תצפיות פיזיולוגיים נקבע ex-vivo או אין ויוו. מגבלות לכלול חוסר אינטגרציה עם רכיבים חיוניים אחרים כדי לווסת את זרימת הדם, כגון שריר חלק וגמישות מוגבלת, לוח זמנים ניסיוני של מודל זה נבדק בצורה אופטימלית תוך 4 שעות של בידוד קטע כלי הדם ללא פגע מהחיה.
בניין פרוטוקול וידאו קודמים שנכתבו על ידי Socha, סגל12 התפתחויות ניסיוני ב ביניים6,15,16, נדגים בזאת את ניתוקה של אנדותל צח מ העורקים המוחיים האחורי ומדידות סימולטני של אנדותל [Ca2 +]אני ו Vm באמצעות Fura-2 photometry ואלקטרודות חד תאיים, בהתאמה. בנוסף, ניסוי זה כרוך superfusion רציפה של פתרונות מלח וסוכני תרופתי במהלך בתנאים פיזיולוגיים (pH 7.4, 37 ° C). בחרנו את עורק המוח האחורי, כפי שהיא נושאת אנדותל מבודד עם שלמות מבנית (תאים מצמידים דרך צמתים הפער), מספיק מידות (רוחב ≥50 מיקרומטר, אורך ≥300 מיקרומטר) לשכנוע אינטרה - והאיתות המערכת לאורך ובקרב תאי אנדותל. בנוסף, מחקרים של עורק המוח האחורי מכרסם מיוצגים באופן משמעותי בספרות ולהכיל בתוכו בחינת יסוד מנגנוני איתות אנדותל, פיתוח כלי דם/הזדקנות, פתולוגיה20, 21 , 22. יישום ניסיוני זה צפוי להניב ניתוח תפוקה גבוהה של מוחי אנדותל (ותפקוד לקוי), ובכך יאפשר התקדמות משמעותית ההבנה של תקנה זרימת דם בכל רחבי הזדקנות, התפתחות מחלות ניווניות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)</td>
			<td>A466250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase (Type H Blend)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithioerythritol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2 AM dye</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>F14185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recirculating chiller (Isotemp 500LCU)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>13874647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglas superfusion chamber&#160;</td>
			<td>Warner Instruments, Camden, CT, USA</td>
			<td>RC-27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip bottom (2.4&#160;&#215;&#160;5.0&#160;cm)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12-548-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anodized aluminum platform (diameter: 7.8&#160;cm)&#160;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PM6 or PH6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact aluminum stage&#160;</td>
			<td>Siskiyou, Grants Pass, OR, USA</td>
			<td>8090P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>&#160;MX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscopes&#160;</td>
			<td>Zeiss, NY, USA</td>
			<td>Stemi 2000 &#38; 2000-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber optic light sources</td>
			<td>&#160;Schott, Mainz, Germany &#38; KL200, Zeiss</td>
			<td>Fostec 8375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon inverted microscope</td>
			<td>Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA</td>
			<td>Ts2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast objectives&#160;</td>
			<td>Nikon Instruments Inc</td>
			<td>&#160;(Ph1 DL; 10X &#38; 20X)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent objectives&#160;</td>
			<td>Nikon Instruments Inc</td>
			<td>20X (S-Fluor), and 40X (Plan Fluor)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon inverted microscope</td>
			<td>Nikon Instruments Inc</td>
			<td>Eclipse TS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsyringe pump controller (Micro4 )&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA</td>
			<td>SYS-MICRO4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration isolation table</td>
			<td>Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA</td>
			<td>&#160;Micro-g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifiers</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td>
			<td>Axoclamp 2B &#38; Axoclamp 900A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headstages&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>HS-2A &#38; HS-9A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function generator&#160;</td>
			<td>EZ Digital, Seoul, South Korea</td>
			<td>FG-8002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Acquision System</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td>
			<td>Digidata 1550A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Audible Baseline Monitors</td>
			<td>Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA</td>
			<td>&#160;BM-A-TM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Storage Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix, Beaverton, Oregon, USA</td>
			<td>&#160;TDS 2024B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence System Interface, ARC Lamp + Power Supply, Hyperswitch, PMT</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td>
			<td>IonOptix Systems</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Controller&#160;&#160;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-344B or C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline Heater&#160;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SH- 27B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valve Controller&#160;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>VC-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline Flow Control Valve</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>&#160;FR-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic Puller&#160;</td>
			<td>Sutter Instruments, Novato, CA, USA</td>
			<td>P-97 or P-1000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige, East Meadow, NY, USA</td>
			<td>&#160;MF-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Tubes (Trituration)</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA</td>
			<td>1B100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Tubes (Pinning)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>G150T-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Tubes (Sharp Electrodes)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>GC100F-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter (0.22 &#181;m)&#160;&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>722-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri Dish + Charcoal Sylgard</td>
			<td>Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA</td>
			<td>DD-90-S-BLK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Style Scissors (3 mm &#38; 9.5&#160;mm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>555640S, 14364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors 3 &#38; 7 mm blades</td>
			<td>Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA</td>
			<td>Moria MC52 &#38; 15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharpened fine-tipped forceps&#160;</td>
			<td>FST</td>
			<td>Dumont #5 &#38; Dumont #55</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous measurements of intracellular calcium and membrane potential in freshly isolated and intact mouse cerebral endothelium

העורקים המוחיים ו microcirculation בהתאמה שלהם לספק חמצן וחומרים מזינים המוח דרך הדם לזרום ברגולציה. תאי אנדותל קו לומן של כלי דם ושינויים הפקודה קוטר כלי הדם לפי הצורך כדי בדרישה המטבולית של נוירונים. תלויי-אנדותל העיקרי איתות המסלולים של hyperpolarization של תחמוצת החנקן ו קרומית אפשרית (Vm) בדרך כלל פועלים במקביל כדי לתווך vasodilation ובכך להגביר את זרימת הדם. אמנם חלק בלתי נפרד תיאום vasodilation מעל מספר מ מ אורך כלי הדם, רכיבים של אנדותל, נגזר hyperpolarization (EDH) היה מבחינה היסטורית קשה למדוד. רכיבים אלה של EDH כרוכה תאיים Ca2 + [Ca2 +]אני מגדילה והפעלה עוקבות של קטן - ו ביניים מוליכות Ca2 +-מופעל K+ (SKCaגבירותייCa) ערוצים.
כאן, אנו מציגים דוגמה מפושטת של הבידוד של אנדותל טריים מן העורקים המוחיים העכבר; מדידות סימולטני של אנדותל [Ca2 +]אני ו- Vm באמצעות Fura-2 photometry ואלקטרודות חד תאיים, בהתאמה; של superfusion רציפה של פתרונות מלח וסוכני תרופתי בתנאים פיזיולוגיים (pH 7.4, 37 ° C). העורקים המוחיים האחורי של המעגל של וויליס יוסרו חינם של תקשורת האחורי, העורקים למפרצת. עיכול אנזימטי של נקי האחורי מקטעי עורקי המוח, trituration הבאים מקלה על הסרת adventitia, perivascular העצבים ותאי שריר חלק. וכתוצאה מכך האחורי מוחית עורקית אנדותל "צינורות" ואז מאובטחים תחת מיקרוסקופ ובחן באמצעות מצלמה, האופטיקה צינור, 1 ו- 2 electrometers תחת superfusion מתמשך. באופן קולקטיבי, בשיטה זו ניתן למדוד בו זמנית לשינויים אנדותל [Ca2 +]אני ו- Vm במיקומים הסלולר דיסקרטית, בנוסף הפצת EDH דרך הפער צמתי עד מילימטר במרחקים לאורך ללא פגע אנדותל. שיטה זו צפוי להניב ניתוח תפוקה גבוהה של הפונקציות אנדותל מוחי שבבסיס מנגנוני ויסות זרימת דם במוח רגיל וחולים.

ההפגנה סכמטי של הפרוטוקול המתואר לעיל מוצג הדמויות המצורפת. מוח מבודד צעירים למבוגרים זכר C57BL/6N עכבר (5 חודשים) מוצג איור 1A. העורקים המוחיים האחורי מבודדים היטב מן מעגל ויליס, להסיר אותן ללא רקמת חיבור, ולחתוך לחלקים (איור 1B-D). מ מקט?...

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium at JoVE.com

Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium

המודגמות כאן הם פרוטוקולים לבידוד (1) טרי שלם מוחי אנדותל "צינורות" ומדידות (2) בו זמנית הסידן אנדותל של קרומית אפשרית במהלך אנדותל, נגזר hyperpolarization. עוד, שיטות אלה מאפשרים כוונון תרופתי של תאי אנדותל סידן, איתות חשמלי כמשתנים ניסיוני בודדים או אינטראקטיביות.

מדידות סימולטני של סידן תאיים, פוטנציאל ממברנה אנדותל מוחי העכבר טרי מבודדת ללא פגע

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הפיזיולוגיה של כלי הדם המוחיים בכל הנוגע לוויסות זרימת הדם המוחי במהלך ההזדקנות וההתפתחות של מחלות כרוניות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת מדידה בו זמנית של סידן תאי ופוטנציאל קרום של אנדותל עורקי מוחי בצורתו המקורית בתנאים פיזיולוגיים. כדי לבודד את מוח העכבר, מתחת למיקרוסקופ להסיר את העור והשיער מעל הגולגולת.ולהסיר דם מוגזם עם PSS ללא סידן קר. לאחר מכן, בצע חתך באמצעות רק את קצות מספריים ניתוח סטנדרטי. החל מעצם העורף ונרחב דרך עצם האף של הגולגולת.ואז לפתוח את הגולגולת בזהירות לאורך החתך, באמצעות מדפים גסים ולהפריד את רקמת החיבור כדי לחשוף את המוח. לשטוף בעדינות את המוח המבודד עם PSS ללא סידן קר במקו כדי להסיר את הדם. מניחים את הצד הגחוני במוח בתא המכיל פתרון ניתוח קר לבידוד של עורקים מוחיים.כדי לבודד את העורקים המוחיים, לאבטח את המוח המבודד בתתבר ניתוח קר על ידי החדרת שני סיכות נירוסטה דרכו, לתוך ציפוי פולימר סיליקון חדורים בפחם בתחתית צלחת פטרי זכוכית. לאחר מכן, לבודד בניתוח את העורקים המוחיים האחוריים על 0.3 כדי 0.5 ס"מ קטעים מן העורקים האחוריים תקשורת בזילאר. השתמש סיכות נירוסטה כדי לאבטח את שני העורקים המוחיים האחוריים מבודדים בתת פתרון הניתוח בצלחת פטרי.לאחר מכן נקו את העורקים המוחיים האחוריים המבודדים בזהירות על ידי הסרת רקמת חיבור באמצעות מדפים מחודדים בעלי קצה דק. חותכים את העורקים שלמים למקטע אחד עד שני מילימטרים לעיכול אנזימטי. בהליך זה, הכינו את מנגנון הטריטורציה באמצעות מיקרוסקופ, מצלמה ושלב אלומיניום המחזיק תא ומיקרומניפולטורים.אבטחו מיקרו-רינג עם בקר משאבה צמוד לבמה ולדגימה. לאחר מכן מלאו מחדש פיפטה עם שמן מינרלי ואבטחו אותה מעל בוכנה מיקרו-סירינג. לאחר מכן באמצעות microsyringe עם בקר המשאבה למשוך כ 130 nanoliters של פתרון דיסוציאציה לתוך פיפטה תוך הבטחת היעדר בועות אוויר.לאחר מכן, מניחים מקטעי עורקים שלמים לתוך מיליליטר אחד של פתרון דיסוציאציה עם ריכוזים נדרשים של אנזימים בצינור זכוכית 10 מיליליטר. דגירה ב 34 מעלות צלזיוס במשך 10 עד 12 דקות לעיכול חלקי. לאחר העיכול, החלף את פתרון האנזים בחמישה מיליליטר של פתרון דיסוציאציה טרי.באמצעות פיפיאט מיליליטר אחד, להעביר קטע אחד לתוך התא המכיל פתרון דיסוציאציה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן מניחים את הפיפסה בתת פתרון הדיסוציאציה בתא וממקם אותה קרוב לקצה אחד של הכלי המתעכל. הגדר קצב בטווח של שניים עד חמישה nanoliters לשנייה על בקר המשאבה עבור טריטורציה עדינה.תוך כדי צפייה דרך 100 פעמים עד 200 פעמים הגדלה לסגת ולפלט את קטע העורקים כדי לנטרל תאי שריר חלקים תוך הפקת צינור אנדותל. במידת הצורך, השתמשו בזהירות במקלות עדינות כדי להפריד בין הרפתקנות ניתוקת לבין למינה אלסטית פנימית מהצינור ה אנדותל. אשר כי כל תאי השריר החלקים נותק, כי רק תאים אנדותל להישאר כמו צינור שלם.באמצעות מיקרומניפולטורים, לאבטח כל קצה של הצינור אנדותל על החלקת כיסוי הזכוכית של תא עירוי באמצעות פיפטים הצמדת זכוכית borosilicate. לשטוף את ההרפתקה ניתוק ותאי שריר חלקים מהתא. ולהחליף את פתרון דיסוציאציה עם שני טוחנות יותר סידן כלורי PSS.העבר את הפלטפורמה הניידת עם צינור אנדותל מאובטח למיקרוסקופ של סופרפוזיה ומתקן ניסיוני. לאחר מכן השתמש שישה מאגרים נקיים 50 מיליליטר עבור אספקה רציפה של PSS ופתרונות סמים בהתאמה במהלך הניסוי. השתמש שסתום בקרת זרימה בשורה כדי להגדיר באופן ידני את קצב הזרימה עקבי כמו זרימת למינר תוך התאמת הזנת זרימה יניקה ואקום.ספק PSS לתא עבור עירוי העל של הצינור ה אנדותל לפחות חמש דקות לפני הקלטת נתוני הרקע וטעינת צבע. כדי למדוד את פוטנציאל הממברנה בו זמנית עם ריכוז סידן תאי, משוך אלקטרודה חדה ומילוי אחורי שלה עם שני אשלגן כלורי טוחן כדי להקליט מתאים עמוסים צבע fura-2. כדי לחקור את הצימוד תאי באמצעות העברת צבע, backfill את microelectrode עם 0.1% פרופידיום יודיד מומס בשני אשלגן כלורי טוחן.במקום הבא האלקטרודה מעל חוט כסף מצופה כלוריד במחזיק פיפטה מחובר לשלב ראש אלקטרומטר מאובטח עם מיקרומניפולטור. השתמש micromanipulator כדי למקם בקצרה את קצה האלקטרודה לתוך PSS זורם בתא, תוך צפייה דרך המטרה ארבע פעמים. לאחר מכן, להגדיר את פוטנציאל קרום מנוחה לאפס עולה בקנה אחד עם פוטנציאל אמבטיה מקורקע.אם תרצה, השתמש בצגים בסיסיים נשמעים המקושרים לאלקטרומטרים כדי לשייך צליל עם הקלטות פוטנציאליות. לאחר מכן, להגדיל את ההגדלה ל 400 פעמים באמצעות מטרה 40 פעמים ולמקם את קצה האלקטרודה רק מעל התא של הצינור אנדותל. התאם את החלון הפוטומטרי באמצעות תוכנת הפוטומטריה כדי להתמקד בכ- 50 עד 80 תאים אנדותל.ואז בעדינות למקם את האלקטרודה לתוך אחד התאים של הצינור אנדותל באמצעות micromanipulator ולחכות לפחות שתי דקות עבור פוטנציאל קרום מנוחה להתייצב. לאחר מנוחת פוטנציאל הממברנה יציבה בערך הצפוי שלה, להפעיל את הצינור photomultiplier על ממשק פלואורסצנטי בהיעדר אור ולהתחיל רכישת ריכוז סידן תאיים על ידי מרגש Fura-2 לסירוגין ב 340 ו 380 ננומטר תוך איסוף פליטת פלורציה ב 510 ננומטר. לאחר מדידות בו זמנית של פוטנציאל קרום וריכוז סידן תאיים הוקמו, לאפשר כחמש דקות עבור עירוי העל של צינור אנדותל עם PSS בקצב זרימה למינארית קבוע לפני היישום של תרופות.החל את התרופה מוכנה PSS לתא עירוי על בקצב זרימה קבוע. במהלך הטיפול התרופתי למדוד את פוטנציאל הממברנה ביחסי F340/F380 בו זמנית. ברגע שהניסוי נעשה, למשוך את האלקטרודה מהתא.ואז להפסיק הקלטות בהתאמה של פוטנציאל קרום ריכוז סידן תאי ולשמור את הקבצים לניתוח נתונים. זוהי תמונת ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית של צינור אנדותל עורקי מוחי של העכבר, מותאם לניסוי בחלון פוטומטרי באמצעות מטרה 40 פעמים. אלקטרודה חדה ממוקמת בתא, כפי שמוצג בחלק העליון של התמונה.להלן הדוגמאות של עקבות גולמיים למדידה בו זמנית של יחס F340/F380 ופוטנציאל קרום בתגובה ל- ATP של 100 מיקרומולרים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקאלית, על מנת לענות על שאלות נוספות לגבי איתות מיקרו-דומיין של סידן אנדותל, ו מיני חמצן תגובתי, כדוגמאות. באופן כללי טכניקה זו תמשיך לסלול את הדרך למחקרים בפיזיולוגיה התאית כדי לחקור את תפקוד כלי הדם והזדקנות במחזור הדם והלימפה.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

מדידת הקרוב ממברנה פלזמה ו Global Dynamics סידן תאיים בתוך האסטרוציטים

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

בידוד של myocytes פרוזדורי אדם למדידות בו זמנית של Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; ארעי וזרמים הממברנה

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

מיקרוסקופית Intravital למבני ההדמיה subcellular בעכברים חיים לבטא חלבוני פלורסנט

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

הערכה של סידן ניצוצות בסיבי שריר שלד שלמים

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

מדידות סידן cytosolic בתאי האפיתל כליות על ידי cytometry הזרימה

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli

ערוץ יחיד הדמיה ניתוח וסידן בPodocytes של glomeruli מבודדת טרי

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

טכניקת כלית עכבר המבודדת perfused

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

מדידה בו זמנית של סידן מיטוכונדריאלי מיטוכונדריאלי ממברנה פוטנציאלית בתאים חיים באמצעות פלורסנט מיקרוסקופית

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

בידוד מיוציטים פרוזדוריים וחדריים באיכות גבוהה למדידות בו זמנית של Ca2+ Transients וזרם סידן מסוג L

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Isolating and Imaging Live, Intact Pacemaker Regions of Mouse Renal Pelvis by Vibratome Sectioning

בידוד והדמיה חיה, אזורי קוצב לב שלמים של אגן כליות העכבר על ידי חלוקת ויברטום

The renal pelvis (RP) is a funnel-shaped, smooth muscle structure that facilitates normal urine transport from the kidney to the ureter by regular, ...