Name: simultaneous measurements of intracellular calcium and membrane potential in freshly isolated and intact mouse cerebral endothelium
Uploaded: 2019-01-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium at JoVE.com

現在のプロトコルに必要な用品を確立している間優秀なテクニカル サポートありがとうチャールズ ・ ヒューイット。我々 はそれぞれ追加の倒立顕微鏡と電位計、私たちを提供するため夫妻ショーン ・ m ・ ウィルソンと LLU 周産期生物学センターからのクリストファー ・ g. ウィルソンをありがとうございます。この研究は、国立衛生研究グラント R00 AG047198 (EJB) そして Loma リンダ大学医学部新学部設立基金によってサポートされています。内容は著者の責任と国立衛生研究所の公式見解を必ずしも表さない。

次の実験を実施する前に、すべての動物の世話使用し、プロトコル施設動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) によって承認され、国家研究会議"ガイドと一致を実行をようにケアとの使用のため実験動物" (8th版、2011) のガイドラインが到着。Loma リンダ大学 IACUC は男性と女性の c57bl/6 マウスのこの原稿を使うすべてのプロトコルを承認した (年齢: 30 に 3 mo)。
<p class="jove_titl...

<ol>
	<li>Longden, T. A., Hill-Eubanks, D. C., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channel+networks+in+the+control+of+cerebral+blood+flow.">Ion channel networks in the control of cerebral blood flow.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 36 (3), 492-512 (2016).</li><li>Chen, B. R., Kozberg, M. G., Bouchard, M. B., Shaik, M. A., Hillman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+role+for+the+vascular+endothelium+in+functional+neurovascular+coupling+in+the+brain.">A critical role for the vascular endothelium in functional neurovascular coupling in the brain.</a> Journal of the American Heart Association. 3 (3), e000787 (2014).</li><li>Iadecola, C., Yang, G., Ebner, T. J., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+and+propagated+vascular+responses+evoked+by+focal+synaptic+activity+in+cerebellar+cortex.">Local and propagated vascular responses evoked by focal synaptic activity in cerebellar cortex.</a> Journal of Neurophysiology. 78 (2), 651-659 (1997).</li><li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+blood+flow+in+the+microcirculation:+role+of+conducted+vasodilation.">Regulation of blood flow in the microcirculation: role of conducted vasodilation.</a> Acta Physiologica (Oxford, England). 202 (3), 271-284 (2011).</li><li>Garland, C. J., Dora, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EDH:+endothelium-dependent+hyperpolarization+and+microvascular+signalling.">EDH: endothelium-dependent hyperpolarization and microvascular signalling.</a> Acta Physiologica (Oxford, England). 219 (1), 152-161 (2017).</li><li>Hakim, M. A., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+dynamics+of+isolated+cerebral+and+skeletal+muscle+endothelial+tubes:+Differential+roles+of+G-protein-coupled+receptors+and+K++channels.">Electrical dynamics of isolated cerebral and skeletal muscle endothelial tubes: Differential roles of G-protein-coupled receptors and K+ channels.</a> Pharmacology Research &amp; Perspectives. 6 (2), e00391 (2018).</li><li>Marrelli, S. P., Eckmann, M. S., Hunte, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+endothelial+intermediate+conductance+KCa+channels+in+cerebral+EDHF-mediated+dilations.">Role of endothelial intermediate conductance KCa channels in cerebral EDHF-mediated dilations.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (4), H1590-H1599 (2003).</li><li>Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+electrical+signaling+in+arterial+endothelial+tubes:+New+insights+into+cellular+physiology+and+cardiovascular+function.">Calcium and electrical signaling in arterial endothelial tubes: New insights into cellular physiology and cardiovascular function.</a> Microcirculation. 24 (3), (2017).</li><li>Endemann, D. H., Schiffrin, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+dysfunction.">Endothelial dysfunction.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 15 (8), 1983-1992 (2004).</li><li>Rajendran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vascular+endothelium+and+human+diseases.">The vascular endothelium and human diseases.</a> International Journal of Biological Sciences. 9 (10), 1057-1069 (2013).</li><li>Socha, M. J., Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+effects+on+morphological+integrity+and+Ca2++signaling+in+freshly+isolated+murine+feed+artery+endothelial+cell+tubes.">Temperature effects on morphological integrity and Ca2+ signaling in freshly isolated murine feed artery endothelial cell tubes.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (3), H773-H783 (2011).</li><li>Socha, M. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+microvascular+endothelial+tubes+from+mouse+resistance+arteries.">Isolation of microvascular endothelial tubes from mouse resistance arteries.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), (2013).</li><li>Ye, X., Beckett, T., Bagher, P., Garland, C. J., Dora, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-A+inhibits+agonist-mediated+Ca2++responses+and+activation+of+IKCa+channels+in+mouse+resistance+artery+endothelial+cells.">VEGF-A inhibits agonist-mediated Ca2+ responses and activation of IKCa channels in mouse resistance artery endothelial cells.</a> The Journal of Physiology. , (2018).</li><li>Norton, C. E., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcitonin+gene-related+peptide+hyperpolarizes+mouse+pulmonary+artery+endothelial+tubes+through+KATP+channel+activation.">Calcitonin gene-related peptide hyperpolarizes mouse pulmonary artery endothelial tubes through KATP channel activation.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular. , (2018).</li><li>Behringer, E. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potential+governs+calcium+influx+into+microvascular+endothelium:+integral+role+for+muscarinic+receptor+activation.">Membrane potential governs calcium influx into microvascular endothelium: integral role for muscarinic receptor activation.</a> The Journal of Physiology. 593 (20), 4531-4548 (2015).</li><li>Behringer, E. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Aging+on+Calcium+Signaling+and+Membrane+Potential+in+Endothelium+of+Resistance+Arteries:+A+Role+for+Mitochondria.">Impact of Aging on Calcium Signaling and Membrane Potential in Endothelium of Resistance Arteries: A Role for Mitochondria.</a> The Journal of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 72 (12), 1627-1637 (2017).</li><li>Behringer, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+electrical+dynamics+in+lymphatic+endothelium.">Calcium and electrical dynamics in lymphatic endothelium.</a> The Journal of Physiology. 595 (24), 7347-7368 (2017).</li><li>Simmers, M. B., Pryor, A. W., Blackman, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arterial+shear+stress+regulates+endothelial+cell-directed+migration,+polarity,+and+morphology+in+confluent+monolayers.">Arterial shear stress regulates endothelial cell-directed migration, polarity, and morphology in confluent monolayers.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiolog. 293 (3), H1937-H1946 (2007).</li><li>Sandow, S. L., Grayson, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limits+of+isolation+and+culture:+intact+vascular+endothelium+and+BKCa.">Limits of isolation and culture: intact vascular endothelium and BKCa.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 297 (1), H1-H7 (2009).</li><li>Diaz-Otero, J. M., Garver, H., Fink, G. D., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+is+associated+with+changes+to+the+biomechanical+properties+of+the+posterior+cerebral+artery+and+parenchymal+arterioles.">Aging is associated with changes to the biomechanical properties of the posterior cerebral artery and parenchymal arterioles.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (3), H365-H375 (2016).</li><li>Kochukov, M. Y., Balasubramanian, A., Abramowitz, J., Birnbaumer, L., Marrelli, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+endothelial+transient+receptor+potential+C3+channel+is+required+for+small+conductance+calcium-activated+potassium+channel+activation+and+sustained+endothelial+hyperpolarization+and+vasodilation+of+cerebral+artery.">Activation of endothelial transient receptor potential C3 channel is required for small conductance calcium-activated potassium channel activation and sustained endothelial hyperpolarization and vasodilation of cerebral artery.</a> Journal of the American Heart Association. 3 (4), (2014).</li><li>Zhang, L., Papadopoulos, P., Hamel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+TRPV4+channels+mediate+dilation+of+cerebral+arteries:+impairment+and+recovery+in+cerebrovascular+pathologies+related+to+Alzheimer's+disease.">Endothelial TRPV4 channels mediate dilation of cerebral arteries: impairment and recovery in cerebrovascular pathologies related to Alzheimer's disease.</a> British Journal of Pharmacology. 170 (3), 661-670 (2013).</li><li>Socha, M. J., Domeier, T. L., Behringer, E. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+intercellular+Ca2++signaling+in+endothelial+cell+tubes+of+mouse+resistance+arteries.">Coordination of intercellular Ca2+ signaling in endothelial cell tubes of mouse resistance arteries.</a> Microcirculation. 19 (8), 757-770 (2012).</li></ol>

最近の動向6,15,16,17、照らして今 [Ca2 +] の同時測定のための準備のマウス脳血管内皮細胞を分離する方法を示すiおよび Vm 37 ° C の ~ 2 h を一貫して EDH の基になります。技術的に困難な細胞間の結合も (参照6図 1 を参照) を測定できます。この方法では、離...

脳全体の血流は、中大脳動脈と細動脈血管ネットワーク1で血管拡張反応の調整によって規制されています。血管内皮細胞は、脳の抵抗動脈ニューロン1,2,3の代謝需要を満たすために必要に応じて血管径に変更するコマンドをライニングします。(通称 EDH)、内皮由来過分極反応の中に特に、細胞内 Ca2 + ([Ca2 +]私) 内皮細胞座標血管内皮細胞間の電気信号と、動脈弛緩4のギャップ結合を介した周囲の平滑筋細胞。EDH の生理開始は順次 Gqの刺激を伴います-受容体 (Gpcr) [Ca2 +]私との内皮小中間 Ca2 +活性化の増加を結合-アクティブに K+(SKCa/IKCa) hyperpolarize 脳血管内皮膜電位 (Vm)5,6,7チャンネル。したがって、内皮 [Ca2 +]私と Vmの親密な関係は血の流れの調節に不可欠な心臓・脳血管の機能6、8に欠かせない。広範な文献の中で多くの研究 (例えば、高血圧、糖尿病、心不全、冠動脈疾患、慢性腎不全、慢性疾患の整備に血管内皮機能障害の関連を報告しています。末梢動脈疾患)9,10、生理学的、病理学的条件の血管内皮機能を勉強の意義を示します。
血管内皮細胞が過分極、血管拡張、および組織灌流の生産に不可欠である、したがって、そのネイティブの細胞特性の検討は重要です。一般的な研究モデルとして骨格筋11,12, 腸13、肺14、および最近脳6前にマウスの動脈の内皮の管モデルの準備を公開されています。同時 [Ca2 +]私と Vm測定の研究特に骨格筋動脈内皮15,16としてリンパ管の内皮細胞17公開されています。内皮の管アプローチを利用してプライマリの研究に加えてその長所と短所8の包括的な見直しは、この実験的なツールが特定の調査のために適切であるかどうかに相談ことができます。簡単に言えば、利点は、内皮細胞の機能の主要な生理学的なコンポーネントが保持されます (, Ca2 +流入や細胞内放出、ネルンストの潜在性 Vmの K+の過分極経由でSKCa/IKCa活性化とギャップ結合を介して血管内皮細胞間結合) 血管周囲神経入力、平滑筋の電位依存性チャネルの関数、収縮性などの要因が交絡なし血とホルモンの影響8の循環。対照的に、一般的に使用されるセル文化アプローチ導入形態18とイオン チャネル発現19大きく決定前のヴィヴォ生理学的観察との比較を隠ぺいする方法の重要な変化または生体内で。制限は、このモデルはそのまま血管セグメント分離の 4 h 以内テスト最適平滑筋など実験的スケジュールで制限された柔軟性、血流を規制するその他の重要なコンポーネントとの統合の欠如動物。
ここから新鮮な内皮細胞の分離を示す、Socha とシーガルの12および中間6,15,16, 実験的動向によって以前のビデオ議定書からの構築後大脳動脈と血管内皮 [Ca2 +]私と Vmそれぞれ Fura 2 測光および細胞内の鋭い電極を使用しての同時測定。さらに、この実験は、生理学的な条件 (pH 7.4 では、37 ° C) の間に塩水濃度および薬理学的エージェントの連続的なスパーフュー ジョン法を伴います。それは構造健全性 (細胞のギャップ結合を介した結合) と十分な寸法 (幅: 50 μ m、長さ ≥ 300 μ m) さと内に沿ってとの間で、細胞間情報伝達および孤立した内皮細胞を得られるように選んだ後大脳動脈血管内皮細胞。また、齧歯動物の後大脳動脈の研究の文献で実質的に表され、基本的な内皮細胞シグナル伝達機構、血管開発/老化、そして病理学20,の試験を網羅21,22. この実験的脳血管内皮機能 (機能不全) の高スループット解析に期待し、全体の血液の流れの規制の理解する上で重要な進歩を可能にすることにより加齢と神経変性疾患の開発。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)</td>
			<td>A466250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase (Type H Blend)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithioerythritol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2 AM dye</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>F14185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recirculating chiller (Isotemp 500LCU)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>13874647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglas superfusion chamber&#160;</td>
			<td>Warner Instruments, Camden, CT, USA</td>
			<td>RC-27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip bottom (2.4&#160;&#215;&#160;5.0&#160;cm)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12-548-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anodized aluminum platform (diameter: 7.8&#160;cm)&#160;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PM6 or PH6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact aluminum stage&#160;</td>
			<td>Siskiyou, Grants Pass, OR, USA</td>
			<td>8090P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>&#160;MX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscopes&#160;</td>
			<td>Zeiss, NY, USA</td>
			<td>Stemi 2000 &#38; 2000-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber optic light sources</td>
			<td>&#160;Schott, Mainz, Germany &#38; KL200, Zeiss</td>
			<td>Fostec 8375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon inverted microscope</td>
			<td>Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA</td>
			<td>Ts2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast objectives&#160;</td>
			<td>Nikon Instruments Inc</td>
			<td>&#160;(Ph1 DL; 10X &#38; 20X)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent objectives&#160;</td>
			<td>Nikon Instruments Inc</td>
			<td>20X (S-Fluor), and 40X (Plan Fluor)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon inverted microscope</td>
			<td>Nikon Instruments Inc</td>
			<td>Eclipse TS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsyringe pump controller (Micro4 )&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA</td>
			<td>SYS-MICRO4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration isolation table</td>
			<td>Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA</td>
			<td>&#160;Micro-g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifiers</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td>
			<td>Axoclamp 2B &#38; Axoclamp 900A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headstages&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>HS-2A &#38; HS-9A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function generator&#160;</td>
			<td>EZ Digital, Seoul, South Korea</td>
			<td>FG-8002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Acquision System</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td>
			<td>Digidata 1550A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Audible Baseline Monitors</td>
			<td>Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA</td>
			<td>&#160;BM-A-TM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Storage Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix, Beaverton, Oregon, USA</td>
			<td>&#160;TDS 2024B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence System Interface, ARC Lamp + Power Supply, Hyperswitch, PMT</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td>
			<td>IonOptix Systems</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Controller&#160;&#160;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-344B or C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline Heater&#160;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SH- 27B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valve Controller&#160;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>VC-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline Flow Control Valve</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>&#160;FR-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic Puller&#160;</td>
			<td>Sutter Instruments, Novato, CA, USA</td>
			<td>P-97 or P-1000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige, East Meadow, NY, USA</td>
			<td>&#160;MF-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Tubes (Trituration)</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA</td>
			<td>1B100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Tubes (Pinning)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>G150T-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Tubes (Sharp Electrodes)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>GC100F-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter (0.22 &#181;m)&#160;&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>722-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri Dish + Charcoal Sylgard</td>
			<td>Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA</td>
			<td>DD-90-S-BLK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Style Scissors (3 mm &#38; 9.5&#160;mm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>555640S, 14364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors 3 &#38; 7 mm blades</td>
			<td>Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA</td>
			<td>Moria MC52 &#38; 15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharpened fine-tipped forceps&#160;</td>
			<td>FST</td>
			<td>Dumont #5 &#38; Dumont #55</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous measurements of intracellular calcium and membrane potential in freshly isolated and intact mouse cerebral endothelium

脳動脈および彼らのそれぞれの微小循環血流調節を介して脳に酸素と栄養を提供します。神経細胞の代謝需要を満たすために必要に応じて血管内皮細胞の血管と血管径に変更するコマンドのルーメンを行します。過分極膜電位 (Vm) と窒素酸化物の主な内皮依存性シグナル経路は、通常血管拡張反応を仲介し、それにより血流を増加する並列で動作します。血管の長さ数ミリの血管拡張反応の調整には不可欠な内皮由来過分極 (EDH) のコンポーネントされている歴史的に測定することは困難。EDH のこれらのコンポーネントは細胞内 Ca2 + [Ca2 +]私が増加との小規模でその後活性化を伴うし、中間コンダクタンス Ca2 +-K+を活性化 (SKCa/IKCa) チャンネル。
ここでは、提案するマウス脳動脈から新鮮な内皮細胞の分離の簡略図内皮 [Ca2 +]私と Vmそれぞれ Fura 2 測光と細胞内の鋭い電極を使用しての同時測定塩水濃度および生理学的な条件 (pH 7.4 では、37 ° C) の下で薬剤の継続的なスパーフュー ジョン法。ウィリス動脈輪から後大脳動脈が削除されます, 通信と脳底動脈の無料。洗浄後大脳動脈セグメントとその後製粉の酵素の消化力は、外膜、血管周囲神経や平滑筋細胞の除去を促進します。結果後大脳動脈内皮「チューブ」は、顕微鏡下では、保護し、カメラ、光電子増倍管、連続スパーフュー ジョン法を受けながら、1 〜 2 electrometers を用いています。総称して、このメソッドことができますと同時に測定内皮 [Ca2 +]私の変化に沿ってそのまま距離をミリ波までのギャップ結合を介した EDH の広がりに加え、離れた細胞場所で Vm血管内皮細胞。このメソッドは、高スループット分析の正常および病的脳血流調節機構の基礎となる脳の血管内皮機能をもたらすと予想されます。

上記で説明したプロトコルの概略のデモは、添付図に表示されます。若い成人男性 C57BL/6 n マウス (5 ヶ月) から分離された脳は、図 1 aに表示されます。後大脳動脈は、ウィリス輪、結合組織せずに削除し、(図 1 bの D) のセグメントにカットから慎重に分離されています。部分的に消化動脈セグメントからその?...

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Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium

ここで説明は、(1) たてそのまま脳血管内皮「チューブ」と内皮細胞のカルシウムと膜内皮由来過分極電位 (2) 同時計測を隔離するためのプロトコルです。さらに、これらのメソッド内皮細胞カルシウムと個々 またはインタラクティブな実験変数として電気シグナリングの薬理学的チューニングを可能にします。

細胞内カルシウムと新鮮な分離とそのままマウス脳血管内皮細胞の膜電位の同時計測

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the ...

この方法は、慢性疾患の老化および発症時の脳血流調節に関連する脳血管生理学の分野における重要な質問に答える助けとなる。この技術の主な利点は、生理学的条件下でのネイティブな形態の脳動脈内皮の細胞内カルシウムと膜電位の同時測定を可能にすることです。マウスの脳を分離するには、顕微鏡下で頭蓋骨の上に皮膚と毛を取り除きます。そして、冷たいカルシウムフリーPSSで過剰な血液を除去します。次に、標準的な解剖はさみの先端だけを使って切開を行います。後頭部の骨から始まり、頭蓋骨の鼻骨を通って伸びる。その後、彼女は粗い先端の鉗子を使用して、切開に沿って慎重に頭蓋骨を開き、脳を露出させるために結合組織を分離します。分離した脳を冷たいカルシウムフリーのPSSでビーカーで静かに洗い、血液を取り除きます。脳動脈の分離のための冷たい解剖液を含むチャンバーに脳腹側を上に置きます.脳動脈を分離するには、2本のステンレス製ピンをガラスペトリ皿の底に炭を注入したシリコンポリマーコーティングに挿入して、冷たい解剖液中の単離された脳を固定します。続いて、後部脳動脈を約0.3〜0.5センチメートルのセグメントを後部通信およびバジル動脈から外科的に隔離する。シャーレの解剖液中の分離された後脳動脈を両方確保するために、ステンレス製のピンを使用してください。その後、鋭利な細かい先端の鉗子を使用して結合組織を除去することによって、分離された後脳動脈を慎重に清掃する。酵素消化のために無傷の動脈を1〜2ミリメートルのセグメントに切り分ける。この手順では、顕微鏡、カメラ、チャンバーとマイクロマニピュレータを保持するアルミニウム段を用いてトリチャレーション装置を準備する。マイクロシリンジを、ステージと試料に隣接するポンプコントローラで固定します。次に、滴定ピペットに鉱物油を完全にバックフィルし、マイクロシリンジピストンの上に固定します。次に、マイクロシリンジをポンプコントローラで使用して、約130ナノリットルの解離溶液をピペットに引き出し、気泡がないことを保証します。続いて、無傷の動脈セグメントを10ミリリットルのガラスチューブに必要な酵素濃度を含む解離液の1ミリリットルに入れる。部分的な消化のために10〜12分間摂氏34度でインキュベートします。消化後、酵素溶液を5ミリリットルの新鮮な解離液に置き換えます。1ミリリットルのピペットを使用して、室温で解離液を含むチャンバに1つのセグメントを移す。次に、ピペットをチャンバー内の解離液に入れ、消化された容器の一端近くに置きます。穏やかなトリアーレーションのためのポンプコントローラーの毎秒2から5ナノリットルの範囲内の速度を設定しなさい。100倍から200倍の拡大を見ながら、動脈セグメントを引き出して排出し、内皮管を産生しながら平滑筋細胞を解体する。必要に応じて、細かい先端の鉗子を慎重に使用して、分離されたアドベンチアと内部弾性薄層を内皮管から分離します。すべての平滑筋細胞が解体され、内皮細胞のみが無傷のチューブとして残っていることを確認します。マイクロマニピュレータを使用して、重ね合うガラスピンピペットを使用して、重ね液室のガラスカバースリップ上の内皮管の両端を固定します。解離されたアドベンチシアと平滑筋細胞をチャンバーから洗い流します。そして、解離液を2モル以上塩化カルシウムPSSに交換します。高融および実験リグの顕微鏡に固定された内皮管を備えた移動式プラットフォームを移します。その後、実験中にPSSとそれぞれの薬物溶液の連続配信のために6つのクリーン50ミリリットルの貯水池を使用してください。インラインフロー制御バルブを使用して、流量をラミナーフローと同じ一貫性に設定し、フローフィードを真空吸引に合わせるようにします。バックグラウンドデータと染料のロードを記録する前に、少なくとも5分間、内皮管の重ね合せのためにPSSをチャンバに送ります。膜電位を細胞内カルシウム濃度と同時に測定するには、鋭利な電極を引っ張り、2つの塩化モルカリウムを埋め戻して、フラ2染料を積んだ細胞から記録します。色素移動による細胞内結合を研究するために、2つの塩化モルカリウムに溶解した0.1%のヨウ化プロピジウムを微小電極に埋め戻す。次に、マイクロマニピュレータで固定された電気計ヘッドステージに取り付けられたピペットホルダーに塩化物でコーティングされた銀線の上に電極を置きます。マイクロマニピュレーターを使用して、電極の先端をチャンバー内の流れるPSSに簡単に配置し、4倍の目的を見ることができます。続いて、静設膜電位を、接地浴電位と一致するようにゼロに設定する。必要に応じて、エレクトロメーターにリンクされた可聴ベースラインモニタを使用して、サウンドピッチと潜在的な録音を関連付けます。その後、40倍の目的を使用して倍率を400倍に増やし、電極先端を内皮管のセルの上に配置します。フォトメトリーソフトウェアを使用してフォトメトリックウィンドウを調整し、約50〜80個の内皮細胞に焦点を当てます。次に、マイクロマニピュレータを使用して電極を内皮管のセルの1つにそっと入れ、安静時膜電位が安定するまで少なくとも2分間待ちます。静止した膜電位が期待値で安定したら、光がない場合は蛍光界面の光電子増倍管をオンにし、510ナノメートルで蛍光放射を収集しながら340ナノメートルと380ナノメートルで交互に励起フラ2により細胞内カルシウム濃度の取得を開始します。膜電位と細胞内カルシウム濃度の同時測定が確立されると、薬物の適用前に一定の層流量でPSSを有する内皮管の重ね合わせに約5分を要する。PSSで調製した薬剤を一定の流量でスーパーフュージョンチャンバーに塗布する。薬物治療中にF340/F380比で膜電位を同時に測定します。実験が終わったら、電極をセルから引き出します。次に、膜電位と細胞内カルシウム濃度の各記録を停止し、データ分析のためにファイルを保存します。これはマウス大脳動脈内皮管の差動干渉コントラスト画像であり、40倍の目的を用いてフォトメトリックウィンドウでの実験のために調整される。画像の上部に示すように、鋭い電極がセルに配置されます。ここでは、100マイクロモルATPに応答してF340/F380比と膜電位を同時測定するための生のトレースの例を示します。この手順に従って、共焦点蛍光顕微鏡のような他の方法は、例として、内皮カルシウムのマイクロドメインシグナル伝達、及び活性酸素種に関する追加の質問に答えるために行うことができる。一般に、この技術は、細胞生理学の研究が血管機能を探求し、血液およびリンパ循環の老化を探求するための道を開き続けます。

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

アストロサイトの細胞膜とグローバル細胞内カルシウム動態の近くの測定

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Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

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カルシウムの同時測定のための人間の心房筋細胞の分離<sup&gt; 2 +</sup&gt;過渡と膜電流

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

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Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

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Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli

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Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

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Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Ca2+過渡現象とL型カルシウム電流の同時測定のための高品質マウス心房および心室筋細胞の分離

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Isolating and Imaging Live, Intact Pacemaker Regions of Mouse Renal Pelvis by Vibratome Sectioning

ビブラートーム切除によるマウス腎盂の分離とイメージングライブ、無傷のペースメーカー領域

The renal pelvis (RP) is a funnel-shaped, smooth muscle structure that facilitates normal urine transport from the kidney to the ureter by regular, ...