Name: simultaneous measurements of intracellular calcium and membrane potential in freshly isolated and intact mouse cerebral endothelium
Uploaded: 2019-01-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium at JoVE.com

우리는 우수한 기술 지원 장비 및 현재 프로토콜에 필요한 용품을 설정 하는 동안 찰스 휴이 트 감사 합니다. 우리 감사 박사 숀 M. 윌슨과 크리스토퍼 G. 윌슨 Perinatal 생물학의 LLU 센터에서 제공 하는 추가 거꾸로 한 현미경 및 전위 계, 각각. 이 연구는 건강의 국가 학회 교부 금 R00 AG047198 (EJB) 및 Loma Linda 대학의 학부의 새로운 교수 창업 자금 지원 되었습니다. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 국립 보건원의 공식 의견을 대표 하지 않는다.

다음과 같은 실험을 수행 하기 전에 모든 동물 보호 사용 및 확인 프로토콜 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 되 고 국가 연구 위원회의 "가이드에 수행 관리 및 활용에 대 한 실험실 동물' (8번째 판, 2011)와 도착 지침. Loma Linda 대학의 IACUC 남성과 여성의 C57BL/6 마우스에 대 한이 원고에 대 한 사용 되는 모든 프로토콜을 승인 했습니다 (나이 범위: 3 ~ 30 개월)....

<ol>
	<li>Longden, T. A., Hill-Eubanks, D. C., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channel+networks+in+the+control+of+cerebral+blood+flow.">Ion channel networks in the control of cerebral blood flow.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 36 (3), 492-512 (2016).</li><li>Chen, B. R., Kozberg, M. G., Bouchard, M. B., Shaik, M. A., Hillman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+role+for+the+vascular+endothelium+in+functional+neurovascular+coupling+in+the+brain.">A critical role for the vascular endothelium in functional neurovascular coupling in the brain.</a> Journal of the American Heart Association. 3 (3), e000787 (2014).</li><li>Iadecola, C., Yang, G., Ebner, T. J., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+and+propagated+vascular+responses+evoked+by+focal+synaptic+activity+in+cerebellar+cortex.">Local and propagated vascular responses evoked by focal synaptic activity in cerebellar cortex.</a> Journal of Neurophysiology. 78 (2), 651-659 (1997).</li><li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+blood+flow+in+the+microcirculation:+role+of+conducted+vasodilation.">Regulation of blood flow in the microcirculation: role of conducted vasodilation.</a> Acta Physiologica (Oxford, England). 202 (3), 271-284 (2011).</li><li>Garland, C. J., Dora, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EDH:+endothelium-dependent+hyperpolarization+and+microvascular+signalling.">EDH: endothelium-dependent hyperpolarization and microvascular signalling.</a> Acta Physiologica (Oxford, England). 219 (1), 152-161 (2017).</li><li>Hakim, M. A., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+dynamics+of+isolated+cerebral+and+skeletal+muscle+endothelial+tubes:+Differential+roles+of+G-protein-coupled+receptors+and+K++channels.">Electrical dynamics of isolated cerebral and skeletal muscle endothelial tubes: Differential roles of G-protein-coupled receptors and K+ channels.</a> Pharmacology Research &amp; Perspectives. 6 (2), e00391 (2018).</li><li>Marrelli, S. P., Eckmann, M. S., Hunte, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+endothelial+intermediate+conductance+KCa+channels+in+cerebral+EDHF-mediated+dilations.">Role of endothelial intermediate conductance KCa channels in cerebral EDHF-mediated dilations.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (4), H1590-H1599 (2003).</li><li>Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+electrical+signaling+in+arterial+endothelial+tubes:+New+insights+into+cellular+physiology+and+cardiovascular+function.">Calcium and electrical signaling in arterial endothelial tubes: New insights into cellular physiology and cardiovascular function.</a> Microcirculation. 24 (3), (2017).</li><li>Endemann, D. H., Schiffrin, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+dysfunction.">Endothelial dysfunction.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 15 (8), 1983-1992 (2004).</li><li>Rajendran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vascular+endothelium+and+human+diseases.">The vascular endothelium and human diseases.</a> International Journal of Biological Sciences. 9 (10), 1057-1069 (2013).</li><li>Socha, M. J., Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+effects+on+morphological+integrity+and+Ca2++signaling+in+freshly+isolated+murine+feed+artery+endothelial+cell+tubes.">Temperature effects on morphological integrity and Ca2+ signaling in freshly isolated murine feed artery endothelial cell tubes.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (3), H773-H783 (2011).</li><li>Socha, M. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+microvascular+endothelial+tubes+from+mouse+resistance+arteries.">Isolation of microvascular endothelial tubes from mouse resistance arteries.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), (2013).</li><li>Ye, X., Beckett, T., Bagher, P., Garland, C. J., Dora, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-A+inhibits+agonist-mediated+Ca2++responses+and+activation+of+IKCa+channels+in+mouse+resistance+artery+endothelial+cells.">VEGF-A inhibits agonist-mediated Ca2+ responses and activation of IKCa channels in mouse resistance artery endothelial cells.</a> The Journal of Physiology. , (2018).</li><li>Norton, C. E., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcitonin+gene-related+peptide+hyperpolarizes+mouse+pulmonary+artery+endothelial+tubes+through+KATP+channel+activation.">Calcitonin gene-related peptide hyperpolarizes mouse pulmonary artery endothelial tubes through KATP channel activation.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular. , (2018).</li><li>Behringer, E. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potential+governs+calcium+influx+into+microvascular+endothelium:+integral+role+for+muscarinic+receptor+activation.">Membrane potential governs calcium influx into microvascular endothelium: integral role for muscarinic receptor activation.</a> The Journal of Physiology. 593 (20), 4531-4548 (2015).</li><li>Behringer, E. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Aging+on+Calcium+Signaling+and+Membrane+Potential+in+Endothelium+of+Resistance+Arteries:+A+Role+for+Mitochondria.">Impact of Aging on Calcium Signaling and Membrane Potential in Endothelium of Resistance Arteries: A Role for Mitochondria.</a> The Journal of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 72 (12), 1627-1637 (2017).</li><li>Behringer, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+electrical+dynamics+in+lymphatic+endothelium.">Calcium and electrical dynamics in lymphatic endothelium.</a> The Journal of Physiology. 595 (24), 7347-7368 (2017).</li><li>Simmers, M. B., Pryor, A. W., Blackman, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arterial+shear+stress+regulates+endothelial+cell-directed+migration,+polarity,+and+morphology+in+confluent+monolayers.">Arterial shear stress regulates endothelial cell-directed migration, polarity, and morphology in confluent monolayers.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiolog. 293 (3), H1937-H1946 (2007).</li><li>Sandow, S. L., Grayson, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limits+of+isolation+and+culture:+intact+vascular+endothelium+and+BKCa.">Limits of isolation and culture: intact vascular endothelium and BKCa.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 297 (1), H1-H7 (2009).</li><li>Diaz-Otero, J. M., Garver, H., Fink, G. D., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+is+associated+with+changes+to+the+biomechanical+properties+of+the+posterior+cerebral+artery+and+parenchymal+arterioles.">Aging is associated with changes to the biomechanical properties of the posterior cerebral artery and parenchymal arterioles.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (3), H365-H375 (2016).</li><li>Kochukov, M. Y., Balasubramanian, A., Abramowitz, J., Birnbaumer, L., Marrelli, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+endothelial+transient+receptor+potential+C3+channel+is+required+for+small+conductance+calcium-activated+potassium+channel+activation+and+sustained+endothelial+hyperpolarization+and+vasodilation+of+cerebral+artery.">Activation of endothelial transient receptor potential C3 channel is required for small conductance calcium-activated potassium channel activation and sustained endothelial hyperpolarization and vasodilation of cerebral artery.</a> Journal of the American Heart Association. 3 (4), (2014).</li><li>Zhang, L., Papadopoulos, P., Hamel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+TRPV4+channels+mediate+dilation+of+cerebral+arteries:+impairment+and+recovery+in+cerebrovascular+pathologies+related+to+Alzheimer's+disease.">Endothelial TRPV4 channels mediate dilation of cerebral arteries: impairment and recovery in cerebrovascular pathologies related to Alzheimer's disease.</a> British Journal of Pharmacology. 170 (3), 661-670 (2013).</li><li>Socha, M. J., Domeier, T. L., Behringer, E. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+intercellular+Ca2++signaling+in+endothelial+cell+tubes+of+mouse+resistance+arteries.">Coordination of intercellular Ca2+ signaling in endothelial cell tubes of mouse resistance arteries.</a> Microcirculation. 19 (8), 757-770 (2012).</li></ol>

최근 개발6,15,,1617에 비추어 우리 지금 [캘리포니아2 +]의 동시 측정을 위한 준비에 마우스 대뇌 동맥 내 피 분리 하는 방법을 보여 줍니다. i 및 Vm EDH 일관 되 게 ~ 2 h 37 ° c.에 대 한 기본 비록 기술적으로 어려운 우리 셀-커플링 뿐 (참조6, 그림 1 참조)을 측정?...

두뇌를 통해 혈액 흐름 중 대뇌 동맥과 혈관 네트워크1arterioles 혈관의 조정에 의해 통제 된다. 내 피 세포 신경1,2,3의 대사 요구에 맞게 필요에 따라 혈관 직경에 대뇌 저항 동맥 명령 변경 안 감. 내 피 파생 hyperpolarization (일반적으로 라고도 EDH), 동안에, 특히 세포내 캘리포니아2 + ([캘리포니아2 +]나) 및 내 피 세포 좌표 혈관 내 피 세포 사이에서 전기 신호 그리고 그들의 간격 접속점 동맥 이완4통해 주변의 부드러운 근육 세포. EDH의 생리 개시 순차적으로 Gq의 자극을 수반-결합 수용 체 (GPCRs), [캘리포니아2 +]나, 그리고 내 피 성장 작은 및 중간 Ca2 +의 활성화에서 증가-K활성화 + (SKCa/IKCa) 채널 hyperpolarize 대뇌 내 피 막 잠재력 (Vm)5,,67. 따라서, 내 피 [캘리포니아2 +]i 와 Vm 의 친밀 한 관계 혈액 흐름 조절에 필수적인 이며 불가결 하 심장-뇌혈관 기능6,8. 광범위 한 문학에 걸쳐 다 수의 연구 개발 (예: 고혈압, 당뇨병, 심장 마비, 관상 동맥 질환, 만성 신부전, 만성 질환의 혈관 내 피 기능 장애의 협회 보고 주변 동맥 질환)9,10, 생리 뿐만 아니라 병 적인 조건에서 내 피 기능 공부의 중요성을 나타내는.
혈관 내 피 hyperpolarization, 혈관 확장, 그리고 조직 관류의 생산에 필수적인 것 이며 따라서, 기본 셀룰러 속성의 검사는 중요 한. 일반 연구 모델로, 마우스 동맥 내 피 튜브 모델의 준비 게시 되었습니다 전에 골격 근11,12, 창 자13,14, 폐 그리고 최근 뇌6. 동시 [캘리포니아2 +]i 와 Vm 측정 연구 특히 골격 근육 동맥 내 피15,16 뿐만 아니라 림프 혈관 내 피17출판 되었습니다. 내 피 튜브 접근을 이용 하 여 기본 연구, 뿐만 아니라 그것의 장단점과8 의 종합적인 검토는이 실험 도구는 특정 연구에 적합 여부를 확인 하 상담 수 있습니다. 간단히는 장점은 내 피 세포 기능의 주요 생리 적인 구성 요소 유지 됩니다 (예:, 캘리포니아2 + 유입 및 intracellular 자료, hyperpolarization Nernst 잠재력까지 Vm 의 k+ 통해 SKCa/IKCa 활성화 및 내 피 세포 결합을 통해 간격 접속점) 혈관 주위 신경 입력, 부드러운 근육 전압-문이 채널 기능 및 수축, 같은 요인을 혼동 없이 혈액, 그리고 호르몬 영향8의 순환. 대조적으로, 일반적으로 사용 되는 세포 문화 접근 소개 형태학18 및 이온 채널 식19 크게 생리 적인 관측 비보 전 결정에 대 한 비교를 난독 처리할 수 있습니다 방식에서에 중요 한 변경 또는 vivo에서. 이 모델은 그대로 혈관 세그먼트 격리의 4 h 이내 테스트 최적으로 혈액의 흐름, 부드러운 근육과 실험 일정에 제한 된 유연성 등 규제에 대 한 다른 필수 구성 요소와 통합의 부족 등 동물.
Socha 및 시걸12 및 중간6,,1516, 최근 실험 개발 저술로 이전 비디오 프로토콜에서 건물 이로써 설명에서 신선한 피 내 막의 절연 후부 대뇌 동맥 그리고 내 피 [캘리포니아2 +]i 와 Vm Fura-2 광도 및 세포내 날카로운 전극, 각각 사용 하 여 동시 측정. 또한,이 실험 생리 적인 조건 (pH 7.4, 37 ° C) 동안 소금 솔루션 및 약리 에이전트의 연속 superfusion를 수반 한다. 우리 후부 대뇌 동맥, 구조적 무결성 (셀 간격 접속점 통해 결합)와 충분 한 크기 (폭 50 µ m, 길이 ≥300 µ m) 내부 및 세포 신호 따라 중에 대 한 의무가 격리 endothelium 생성 선택 내 피 세포입니다. 또한, 설치류 후부 대뇌 동맥의 연구는 실질적으로 문학에서 나타내고 근본적인 내 피 신호 메커니즘, 혈관 개발/노화, 그리고 병 리20, 의 시험을 포함 21 , 22.이 실험의 대뇌 내 피 기능 (기능 장애) 높은 처리량 분석을 얻을 것으로 예상 된다 애플리케이션과 통해 혈액 흐름의 이해에서 중요 한 발전 그로 인하여 허용 한다 노화 및 신경 질환의 개발

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)</td>
			<td>A466250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase (Type H Blend)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithioerythritol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2 AM dye</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>F14185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recirculating chiller (Isotemp 500LCU)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>13874647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglas superfusion chamber&#160;</td>
			<td>Warner Instruments, Camden, CT, USA</td>
			<td>RC-27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip bottom (2.4&#160;&#215;&#160;5.0&#160;cm)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12-548-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anodized aluminum platform (diameter: 7.8&#160;cm)&#160;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PM6 or PH6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact aluminum stage&#160;</td>
			<td>Siskiyou, Grants Pass, OR, USA</td>
			<td>8090P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>&#160;MX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscopes&#160;</td>
			<td>Zeiss, NY, USA</td>
			<td>Stemi 2000 &#38; 2000-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber optic light sources</td>
			<td>&#160;Schott, Mainz, Germany &#38; KL200, Zeiss</td>
			<td>Fostec 8375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon inverted microscope</td>
			<td>Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA</td>
			<td>Ts2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast objectives&#160;</td>
			<td>Nikon Instruments Inc</td>
			<td>&#160;(Ph1 DL; 10X &#38; 20X)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent objectives&#160;</td>
			<td>Nikon Instruments Inc</td>
			<td>20X (S-Fluor), and 40X (Plan Fluor)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon inverted microscope</td>
			<td>Nikon Instruments Inc</td>
			<td>Eclipse TS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsyringe pump controller (Micro4 )&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA</td>
			<td>SYS-MICRO4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration isolation table</td>
			<td>Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA</td>
			<td>&#160;Micro-g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifiers</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td>
			<td>Axoclamp 2B &#38; Axoclamp 900A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headstages&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>HS-2A &#38; HS-9A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function generator&#160;</td>
			<td>EZ Digital, Seoul, South Korea</td>
			<td>FG-8002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Acquision System</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td>
			<td>Digidata 1550A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Audible Baseline Monitors</td>
			<td>Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA</td>
			<td>&#160;BM-A-TM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Storage Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix, Beaverton, Oregon, USA</td>
			<td>&#160;TDS 2024B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence System Interface, ARC Lamp + Power Supply, Hyperswitch, PMT</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td>
			<td>IonOptix Systems</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Controller&#160;&#160;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-344B or C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline Heater&#160;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SH- 27B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valve Controller&#160;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>VC-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline Flow Control Valve</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>&#160;FR-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic Puller&#160;</td>
			<td>Sutter Instruments, Novato, CA, USA</td>
			<td>P-97 or P-1000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige, East Meadow, NY, USA</td>
			<td>&#160;MF-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Tubes (Trituration)</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA</td>
			<td>1B100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Tubes (Pinning)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>G150T-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Tubes (Sharp Electrodes)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>GC100F-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter (0.22 &#181;m)&#160;&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>722-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri Dish + Charcoal Sylgard</td>
			<td>Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA</td>
			<td>DD-90-S-BLK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Style Scissors (3 mm &#38; 9.5&#160;mm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>555640S, 14364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors 3 &#38; 7 mm blades</td>
			<td>Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA</td>
			<td>Moria MC52 &#38; 15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharpened fine-tipped forceps&#160;</td>
			<td>FST</td>
			<td>Dumont #5 &#38; Dumont #55</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous measurements of intracellular calcium and membrane potential in freshly isolated and intact mouse cerebral endothelium

대뇌 동맥 및 그들의 각각 미세 혈액 흐름 규칙을 통해 뇌에 산소와 영양분을 제공합니다. 내 피 세포의 변화 수요를 충족 하는 데 필요한 혈관과 혈관 직경에서 명령 변경의 루멘 라인. 막 잠재력 (Vm) 및 질소 산화물의 hyperpolarization의 기본 내 피 종속 신호 경로 일반적으로 중재 혈관 확장 및 혈액 흐름 증가 하는 동시에 작동 합니다. 혈관의 혈관 길이 몇몇 밀리미터 이상의 조정에 필수적인, 하지만 내 피 파생 hyperpolarization (EDH)의 구성 요소 역사적으로 측정 하기 어려운 되었습니다. EDH의 이러한 구성 요소 세포내 캘리포니아2 + [캘리포니아2 +]나 증가의 작은-후속 활성화 수반 및 중간 계수 캘리포니아2 +-K+ 를 활성화 (SKCa/IKCa) 채널.
여기, 우리가 마우스 대뇌 동맥;에서 신선한 피 내 막의 절연의 단순화 된 그림 제시 내 피 [캘리포니아2 +]i 와 Vm 각각; Fura-2 광도 및 세포내 날카로운 전극를 사용 하 여 동시 측정 그리고 소금 솔루션 및 약리 에이전트 생리 조건 (pH 7.4, 37 ° C)에서 지속적인 superfusion. 윌리스의 원형에서 후부 대뇌 동맥 제거 됩니다 후부 통신 및 두개골 기저 부의 동맥. 청소 후부 대뇌 동맥 세그먼트 및 후속 분쇄의 효소 소화 adventitia, 혈관 주위 신경, 그리고 부드러운 근육 세포의 제거를 촉진 한다. 결과 후부 대뇌 동맥 내 피 "튜브" 다음 현미경으로 확보 하 고 카메라, 광 전 증폭 관 관, 고 1 ~ 2 연속 superfusion에서 electrometers를 사용 하 여 시험. 내 피 [캘리포니아2 +]나 변화와 그대로 따라 밀리미터 거리까지 간격 접속점 통해 EDH의 확산 뿐만 아니라 개별 세포 위치에 Vm 이 방법은 동시에 측정할 수 있습니다 피입니다. 이 방법은 정상과 병에 걸린 뇌에 혈액 흐름의 메커니즘을 기본 대뇌 내 피 기능의 높은 처리량 분석을 얻을 전망 이다.

위에서 설명한 프로토콜의 도식 데모 연결 된 그림에 표시 됩니다. 두뇌는 젊은 성인 남성 C57BL/6N 마우스 (5 개월)에서 고립 된 그림 1A에 표시 됩니다. 후부 대뇌 동맥은 윌리스의 원, 결합 조직, 없이 제거 하 고 (그림 1B-D) 세그먼트로 잘라에서 신중 하 게 격리 됩니다. 부분적으로 소화 동맥 세그먼트에서 그대로 내 ...

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium at JoVE.com

Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium

여기 설명 (1) 갓 그대로 뇌 내 피 "튜브" 및 내 피 칼슘과 막 내 피 파생 hyperpolarization 동안 잠재적인의 (2) 동시 측정을 분리에 대 한 프로토콜이 있습니다. 또한, 이러한 메서드는 내 피 세포 칼슘 및 개별 또는 대화형 실험 변수로 전기 신호의 약리 튜닝 수 있습니다.

세포내 칼슘과 갓 고립과 그대로 마우스 대뇌 피에 막 잠재력의 동시 측정

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the ...

이 방법은 만성 질환의 노화 및 발달 중 뇌혈 흐름 조절과 관련이 있기 때문에 뇌혈관 생리학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 생리적 조건하에서 본체 형태인 대뇌 동맥 내피의 세포내 칼슘과 막 전위의 동시 측정을 허용한다는 것입니다. 마우스 뇌를 격리하려면 현미경으로 두개골 위에 피부와 머리카락을 제거합니다.차가운 칼슘이 없는 PSS로 과도한 혈액을 제거합니다. 다음으로 표준 해부 가위의 팁만 사용하여 절개를 합니다. 후두 뼈에서 시작하여 두개골의 비강 뼈를 통해 확장.그런 다음 그녀는 거친 팁 포셉을 사용하여 절개를 따라 조심스럽게 두개골을 열고 결합 조직을 분리하여 뇌를 노출시합니다. 차가운 칼슘없는 PSS로 고립 된 뇌를 부드럽게 씻어 혈액을 제거합니다. 뇌복부를 대뇌 동맥의 분리를 위해 차가운 해부 용액을 포함하는 챔버에 뇌 복부 면을 올려 놓습니다.대뇌 동맥을 분리하려면, 그것을 통해 두 개의 스테인레스 스틸 핀을 삽입하여 차가운 해부 용액에서 고립 된 뇌를 확보, 유리 페트리 접시의 바닥에 숯 주입 실리콘 폴리머 코팅에. 그 후, 외과적으로 후방 대뇌 동맥을 약 0.3~ 0.5센티미터 세그먼트를 후방 통신 및 바실라 동맥으로부터 분리합니다. 스테인레스 스틸 핀을 사용하여 페트리 접시의 해부 용액에서 격리된 후방 대뇌 동맥을 모두 보호합니다.그런 다음 날카로운 미세 기울어진 집게를 사용하여 결합 조직을 제거하여 격리 된 후방 대뇌 동맥을 조심스럽게 청소하십시오. 효소 소화를 위해 그대로 동맥을 1~2밀리미터 세그먼트로 자른다. 이 절차에서는 현미경, 카메라 및 챔버 및 미세 조작제를 들고 있는 알루미늄 스테이지를 사용하여 삼각 장치를 준비합니다.단계와 시편에 인접한 펌프 컨트롤러로 현미경을 확보하십시오. 다음으로 미네랄 오일로 적정 파이펫을 완전히 채우고 미세 한 피스톤 위에 고정하십시오. 그런 다음 펌프 컨트롤러와 함께 현미경을 사용하여 기포가 없는지 확인하면서 약 130 나노리터의 해화 용액을 파이펫으로 인출합니다.그 후, 10 밀리리터 유리 튜브에 필요한 효소 농도로 해리 용액의 1 밀리리터에 그대로 동맥 세그먼트를 배치합니다. 부분 소화를 위해 섭씨 34도에서 10~12분 동안 배양합니다. 소화후 효소 용액을 5밀리리터의 신선한 해리 용액으로 대체하십시오.1 밀리리터 파이펫을 사용하여 실온에서 해리 용액을 포함하는 챔버로 한 세그먼트를 옮기. 다음으로 파이펫을 챔버내 해리 용액에 넣고 소화된 용기의 한쪽 끝에 가깝게 배치합니다. 펌프 컨트롤러에서 초당 2~5나노리터 범위 내에서 속도를 설정하여 부드러운 트리튜레이션을 제공합니다.100배내지 200배의 배율을 통해 보는 동안 내피관을 생성하는 동안 동맥 분단을 철회하고 배출하여 부드러운 근육 세포를 해리시한다. 필요한 경우 미세 한 포셉을 사용하여 내피 튜브에서 해리 된 출현 및 내부 탄성 라미나분리를 조심스럽게 사용하십시오. 모든 부드러운 근육 세포가 해리되고 내피 세포만 그대로 튜브로 남아 있는지 확인하십시오.마이크로 조작기사용, 보로실리케이트 유리 고정 파이펫을 사용하여 슈퍼퓨전 챔버의 유리 커버 슬립에 내피 튜브의 각 끝을 확보. 챔버에서 해리 된 출현과 부드러운 근육 세포를 씻어. 그리고 해리 용액을 염화 칼슘 PSS 2마리로 대체한다.안전한 내피 튜브를 사용하여 모바일 플랫폼을 슈퍼퓨전 및 실험 장비의 현미경으로 전송합니다. 그런 다음 6개의 깨끗한 50 밀리리터 저장소를 사용하여 실험 중에 PSS 및 각 약물 용액을 지속적으로 전달합니다. 인라인 유량 제어 밸브를 사용하여 유량 흐름을 진공 흡입에 일치시키면서 라미너 흐름만큼 일관된 흐름을 수동으로 설정합니다.배경 데이터 및 염료 적재물을 기록하기 전에 적어도 5 분 동안 내피 튜브의 슈퍼 주입을 위해 챔버에 PSS를 전달합니다. 세포 내 칼슘 농도와 함께 멤브레인 전위를 동시에 측정하려면 날카로운 전극을 당기고 두 개의 어금니 칼륨으로 백필하여 fura-2 염료로 로드된 세포에서 기록하십시오. 염료 전달을 통한 세포내 커플링을 연구하려면 2개의 어금니 칼륨염에 용해된 0.1%의 프로피듐 요오드로 마이크로전극을 백필한다.다음으로 전극을 마이크로 조작기로 고정된 전기계 헤드 스테이지에 부착된 파이펫 홀더에 염화물로 코팅된 은철위에 놓습니다. 마이크로 조작기를 사용하여 전극의 끝을 챔버내의 흐르는 PSS에 간략하게 배치하고 4배 의 목표를 통해 볼 수 있습니다. 그 후, 접지 된 목욕 잠재력과 일치 하 고 나머지 막 잠재력을 0으로 설정 합니다.원하는 경우 전기계에 연결된 가청 기준 모니터를 사용하여 사운드 피치를 잠재적 인 기록과 연결합니다. 그 후, 40배의 목표를 사용하여 배율을 400배로 늘리고 내피관의 세포 바로 위에 전극의 끝을 배치한다. 포토메트릭 소프트웨어를 사용하여 포토메트릭 창을 조정하여 약 50~80개의 내피 세포에 초점을 맞춥니다.그런 다음 마이크로 조작기를 사용하여 내피 튜브의 세포 중 하나에 전극을 부드럽게 배치하고 휴식 막 전위가 안정화될 때까지 적어도 2분 정도 기다립니다. 일단 휴식 막 잠재력은 예상된 값에 안정, 빛의 부재에 형광 인터페이스에 광증 튜브를 켜고 510 나노 미터에서 꽃 방출을 수집하는 동안 340 및 380 나노미터에서 340 및 380 나노미터에서 번갈아 흥미로운 Fura-2에 의해 세포 내 칼슘 농도의 취득을 시작합니다. 멤브레인 전위 및 세포내 칼슘 농도의 동시 측정이 완료되면, 약물의 적용 전에 일정한 라미나르 유량으로 PSS와 내피 튜브의 슈퍼 주입을 위해 약 5 분을 허용합니다.PSS에서 제조된 약물을 일정한 유량으로 슈퍼퓨전 챔버에 적용하십시오. 약물 치료 중 F340/F380 비율의 멤브레인 전위를 동시에 측정합니다. 실험이 완료되면 전극을 셀에서 철회합니다.그런 다음 멤브레인 전위 및 세포 내 칼슘 농도의 각각의 기록을 중지하고 데이터 분석을 위해 파일을 저장합니다. 이것은 40배의 목표를 사용하여 포토메트릭 윈도우에서 실험을 위해 조정된 마우스 뇌동맥 내피튜브의 차동 간섭 대조 이미지이다. 날카로운 전극은 이미지 의 상단에 표시된 대로 셀에 배치됩니다.다음은 100 마이크로몰러 ATP에 대한 응답으로 F340/F380 비율 및 멤브레인 전위의 동시 측정을 위한 원시 추적의 예입니다. 이 절차에 따라, 공초점 형광 현미경 검사법과 같은 다른 방법은 내피 칼슘및 반응성 산소 종의 미세 도메인 신호에 관한 추가 질문에 대답하기 위해 수행 될 수있다, 예를 들어. 일반적으로이 기술은 혈액과 림프 순환에서 혈관 기능과 노화를 탐구하는 세포 생리학연구를위한 길을 계속 포장할 것입니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

Astrocytes의 플라즈마 막 글로벌 세포내 칼슘 역학 니어 측정

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

연구

생물학

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

칼슘의 동시 측정을위한 인간의 심방 근육 세포의 분리<sup&gt; 2 +</sup&gt; 과도하고 막 전류

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

형광 단백질을 표현 라이브 마우스의 이미징 세포 이하의 구조물의 intravital 현미경

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

칼슘의 평가는 그대로 골격 근육 섬유에서 불꽃

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

유동 세포 계측법에 의한 신장 상피 세포에서 세포 내 칼슘 측정

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli

갓 격리 된 사구체 족 세포의 단일 채널 분석 및 칼슘 이미징

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

마우스입니다 관류 신장 기법

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

형광 현미경으로 살아있는 세포의 잠재적 인 미토콘드리아의 칼슘과 미토콘드리아 막의 동시 측정

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Ca2+ 과도 현상 및 L형 칼슘 전류의 동시 측정을 위한 고품질 쥐 심방 및 심실 근세포의 분리

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Isolating and Imaging Live, Intact Pacemaker Regions of Mouse Renal Pelvis by Vibratome Sectioning

진동 및 이미징 라이브, 진동 절제에 의해 마우스 신장 골반의 그대로 페이스 메이커 영역

The renal pelvis (RP) is a funnel-shaped, smooth muscle structure that facilitates normal urine transport from the kidney to the ureter by regular, ...