Name: simultaneous measurements of intracellular calcium and membrane potential in freshly isolated and intact mouse cerebral endothelium
Uploaded: 2019-01-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium at JoVE.com

Vi takker Charles Hewitt for utmerket kundestøtte ved opprettelse av utstyr og rekvisita som trengs for gjeldende protokollene. Vi takker Dr. Sean M. Wilson og Christopher G. Wilson, fra LLUB senter for Perinatal biologi, for å gi oss med en ekstra invertert mikroskop og electrometer, henholdsvis. Denne forskningen har blitt støttet av National Institutes of Health grant R00-AG047198 (EJB) og Loma Linda University School of Medicine nye fakultetet oppstart midler. Innholdet er ansvar forfattere og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synet til National Institutes of Health.

Før du gjennomfører følgende eksperimenter, sikre at alle dyr omsorg bruker og protokoller er godkjent av dyr institusjon og bruke Committee (IACUC) og utføres i samsvar med National Research Council's "Guide og bruk av Forsøksdyr" (8th utgave, 2011) og ANKOMME retningslinjene. IACUC av Loma Linda universitetet har godkjent alle protokoller som brukes for dette manuskriptet for mannlige og kvinnelige C57BL/6 mus (alder rekkevidde: 3 til 30 mo).
1. utstyr og mate...

<ol>
	<li>Longden, T. A., Hill-Eubanks, D. C., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channel+networks+in+the+control+of+cerebral+blood+flow.">Ion channel networks in the control of cerebral blood flow.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 36 (3), 492-512 (2016).</li><li>Chen, B. R., Kozberg, M. G., Bouchard, M. B., Shaik, M. A., Hillman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+role+for+the+vascular+endothelium+in+functional+neurovascular+coupling+in+the+brain.">A critical role for the vascular endothelium in functional neurovascular coupling in the brain.</a> Journal of the American Heart Association. 3 (3), e000787 (2014).</li><li>Iadecola, C., Yang, G., Ebner, T. J., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+and+propagated+vascular+responses+evoked+by+focal+synaptic+activity+in+cerebellar+cortex.">Local and propagated vascular responses evoked by focal synaptic activity in cerebellar cortex.</a> Journal of Neurophysiology. 78 (2), 651-659 (1997).</li><li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+blood+flow+in+the+microcirculation:+role+of+conducted+vasodilation.">Regulation of blood flow in the microcirculation: role of conducted vasodilation.</a> Acta Physiologica (Oxford, England). 202 (3), 271-284 (2011).</li><li>Garland, C. J., Dora, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EDH:+endothelium-dependent+hyperpolarization+and+microvascular+signalling.">EDH: endothelium-dependent hyperpolarization and microvascular signalling.</a> Acta Physiologica (Oxford, England). 219 (1), 152-161 (2017).</li><li>Hakim, M. A., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+dynamics+of+isolated+cerebral+and+skeletal+muscle+endothelial+tubes:+Differential+roles+of+G-protein-coupled+receptors+and+K++channels.">Electrical dynamics of isolated cerebral and skeletal muscle endothelial tubes: Differential roles of G-protein-coupled receptors and K+ channels.</a> Pharmacology Research &amp; Perspectives. 6 (2), e00391 (2018).</li><li>Marrelli, S. P., Eckmann, M. S., Hunte, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+endothelial+intermediate+conductance+KCa+channels+in+cerebral+EDHF-mediated+dilations.">Role of endothelial intermediate conductance KCa channels in cerebral EDHF-mediated dilations.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (4), H1590-H1599 (2003).</li><li>Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+electrical+signaling+in+arterial+endothelial+tubes:+New+insights+into+cellular+physiology+and+cardiovascular+function.">Calcium and electrical signaling in arterial endothelial tubes: New insights into cellular physiology and cardiovascular function.</a> Microcirculation. 24 (3), (2017).</li><li>Endemann, D. H., Schiffrin, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+dysfunction.">Endothelial dysfunction.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 15 (8), 1983-1992 (2004).</li><li>Rajendran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vascular+endothelium+and+human+diseases.">The vascular endothelium and human diseases.</a> International Journal of Biological Sciences. 9 (10), 1057-1069 (2013).</li><li>Socha, M. J., Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+effects+on+morphological+integrity+and+Ca2++signaling+in+freshly+isolated+murine+feed+artery+endothelial+cell+tubes.">Temperature effects on morphological integrity and Ca2+ signaling in freshly isolated murine feed artery endothelial cell tubes.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (3), H773-H783 (2011).</li><li>Socha, M. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+microvascular+endothelial+tubes+from+mouse+resistance+arteries.">Isolation of microvascular endothelial tubes from mouse resistance arteries.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), (2013).</li><li>Ye, X., Beckett, T., Bagher, P., Garland, C. J., Dora, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-A+inhibits+agonist-mediated+Ca2++responses+and+activation+of+IKCa+channels+in+mouse+resistance+artery+endothelial+cells.">VEGF-A inhibits agonist-mediated Ca2+ responses and activation of IKCa channels in mouse resistance artery endothelial cells.</a> The Journal of Physiology. , (2018).</li><li>Norton, C. E., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcitonin+gene-related+peptide+hyperpolarizes+mouse+pulmonary+artery+endothelial+tubes+through+KATP+channel+activation.">Calcitonin gene-related peptide hyperpolarizes mouse pulmonary artery endothelial tubes through KATP channel activation.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular. , (2018).</li><li>Behringer, E. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potential+governs+calcium+influx+into+microvascular+endothelium:+integral+role+for+muscarinic+receptor+activation.">Membrane potential governs calcium influx into microvascular endothelium: integral role for muscarinic receptor activation.</a> The Journal of Physiology. 593 (20), 4531-4548 (2015).</li><li>Behringer, E. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Aging+on+Calcium+Signaling+and+Membrane+Potential+in+Endothelium+of+Resistance+Arteries:+A+Role+for+Mitochondria.">Impact of Aging on Calcium Signaling and Membrane Potential in Endothelium of Resistance Arteries: A Role for Mitochondria.</a> The Journal of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 72 (12), 1627-1637 (2017).</li><li>Behringer, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+electrical+dynamics+in+lymphatic+endothelium.">Calcium and electrical dynamics in lymphatic endothelium.</a> The Journal of Physiology. 595 (24), 7347-7368 (2017).</li><li>Simmers, M. B., Pryor, A. W., Blackman, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arterial+shear+stress+regulates+endothelial+cell-directed+migration,+polarity,+and+morphology+in+confluent+monolayers.">Arterial shear stress regulates endothelial cell-directed migration, polarity, and morphology in confluent monolayers.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiolog. 293 (3), H1937-H1946 (2007).</li><li>Sandow, S. L., Grayson, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limits+of+isolation+and+culture:+intact+vascular+endothelium+and+BKCa.">Limits of isolation and culture: intact vascular endothelium and BKCa.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 297 (1), H1-H7 (2009).</li><li>Diaz-Otero, J. M., Garver, H., Fink, G. D., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+is+associated+with+changes+to+the+biomechanical+properties+of+the+posterior+cerebral+artery+and+parenchymal+arterioles.">Aging is associated with changes to the biomechanical properties of the posterior cerebral artery and parenchymal arterioles.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (3), H365-H375 (2016).</li><li>Kochukov, M. Y., Balasubramanian, A., Abramowitz, J., Birnbaumer, L., Marrelli, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+endothelial+transient+receptor+potential+C3+channel+is+required+for+small+conductance+calcium-activated+potassium+channel+activation+and+sustained+endothelial+hyperpolarization+and+vasodilation+of+cerebral+artery.">Activation of endothelial transient receptor potential C3 channel is required for small conductance calcium-activated potassium channel activation and sustained endothelial hyperpolarization and vasodilation of cerebral artery.</a> Journal of the American Heart Association. 3 (4), (2014).</li><li>Zhang, L., Papadopoulos, P., Hamel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+TRPV4+channels+mediate+dilation+of+cerebral+arteries:+impairment+and+recovery+in+cerebrovascular+pathologies+related+to+Alzheimer's+disease.">Endothelial TRPV4 channels mediate dilation of cerebral arteries: impairment and recovery in cerebrovascular pathologies related to Alzheimer's disease.</a> British Journal of Pharmacology. 170 (3), 661-670 (2013).</li><li>Socha, M. J., Domeier, T. L., Behringer, E. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+intercellular+Ca2++signaling+in+endothelial+cell+tubes+of+mouse+resistance+arteries.">Coordination of intercellular Ca2+ signaling in endothelial cell tubes of mouse resistance arteries.</a> Microcirculation. 19 (8), 757-770 (2012).</li></ol>

I lys av nyere utviklingen6,15,16,17viser vi nå metoden for å isolere musen cerebral arteriell endotelet i forberedelse til samtidig måling av [Ca2 +] jeg og Vm underliggende EDH konsekvent for ~ 2 h på 37 ° C. Selv om teknisk vanskelig, kan vi måle celle-til-celle kopling også (se referanse6figur 1). På denne måten kan vi måle ...

Blodstrøm gjennom hjernen er regulert av samordning av vasodilatasjon blant cerebral arterier og arterioler i vaskulære nettverk1. Endotelceller fôr cerebral motstand arterier kommandoen endringer i vaskulær diameter som trengs for å oppfylle metabolske neurons1,2,3. Spesielt i endotelet-avledet hyperpolarization (kjent som EDH), intracellulær Ca2 + ([Ca2 +]jeg) og elektriske signalene i endotelceller koordinere vasodilatasjon blant endotelceller og deres rundt glatte muskelcellene gjennom gapet veikryss for arteriell avslapning4. Fysiologiske initiering av EDH sekvensielt innebærer stimulering av Gq-kombinert reseptorer (GPCRs), en økning i [Ca2 +]jeg, og aktivering av endothelial små og middels Ca2 +-aktivert K+ (SKCa/IKCa) kanaler hyperpolarize cerebral endothelial membran potensial (Vm)5,6,7. Dermed er intime forholdet mellom endothelial [Ca2 +]jeg og Vm integrert i blodet flyt regulering og uunnværlig til kondisjons- og cerebrovascular funksjon6,8. Gjennom bredere litteratur, har flere studier rapportert foreningen av vaskulær endotelial dysfunksjon med utviklingen av kroniske sykdommer (f.eks hypertensjon, diabetes, hjertesvikt, koronarsykdom, kroniske nyre-svikt, perifer karsykdom)9,10, angir betydningen av studere endothelial funksjon i fysiologiske samt patologiske forhold.
Vaskulære endotelet er integrert produksjon av hyperpolarization, vasodilatasjon og vevsperfusjon og dermed undersøkelse av innfødte mobilnettet egenskapene er avgjørende. Som en generell studie er utarbeidelsen av musen arteriell endothelial røret modellen publisert før Skjelettmuskel11,12, gut13, lunge14, og nylig for hjernen6. Studier samtidig [Ca2 +]jeg og Vm målinger er spesielt publisert for Skjelettmuskel arteriell endotelet15,16 samt lymfatisk fartøy endotelet17. I tillegg til primære studier utnytte endothelial tube tilnærming, kan en omfattende gjennomgang av sine fordeler og ulemper8 bli konsultert om eksperimentell verktøyet er passende for en bestemt studie. I korte trekk en fordel er at fysiologiske hovedkomponentene i endothelial celle funksjon beholdes (, Ca2 + tilstrømningen og intracellulær utgivelse, hyperpolarization Vm opp til han potensialet for K+ via SKCa/IKCa aktivering og endothelial intercellulære kobling via gapet veikryss) uten confounding faktorer som perivascular nerve inndata, glatt muskel spenning-gated kanal funksjon og contractility, blodsirkulasjonen, og hormonelle påvirkninger8. I kontrast, brukte celle kultur tilnærminger introdusere betydelige endringer i morfologi18 og ion kanal uttrykk19 på en måte som kan sterkt Beskytt sammenligninger fysiologiske observasjoner fastslått ex vivo eller i vivo. Begrensninger omfatter mangel på integrasjon med andre viktige komponenter for å regulere blodstrøm, som glatt muskel og begrenset fleksibilitet i en eksperimentell tidsplan, som denne modellen er optimalt testet innenfor 4 h intakt vaskulær segmentet isolasjon fra dyret.
Fra en tidligere video protokoll forfattet av Socha og Segal12 og eksperimentelle bruer i midlertidige6,15,16, viser vi herved isolering av fersk endotelet fra bakre hjerne arterier og samtidig måling av endothelial [Ca2 +]jeg og Vm med Fura-2 fotometri og intracellulær skarpe elektroder, henholdsvis. I tillegg innebærer dette eksperimentet kontinuerlig superfusion salt løsninger og farmakologiske agenter i fysiologiske forhold (pH 7.4, 37 ° C). Vi valgte den bakre arterien cerebri, som det gir isolert endotelet med den strukturelle integriteten (celler koblet gjennom gapet veikryss) og tilstrekkelig størrelse (bredde ≥50 µm, lengde ≥300 µm) mottakelig for intra- og intercellulære signalering langs og blant endotelceller. I tillegg studier av gnager bakre hjerne arterien er vesentlig representert i litteratur og omfatter undersøkelse av grunnleggende endothelial signalnettverk mekanismer, vaskulære utvikling/aldring og patologi20, 21 , 22. eksperimentelle programmet forventes å gi en høy gjennomstrømming analyse av cerebral endothelial funksjon (og dysfunksjon) og vil dermed gi betydelige fremskritt i forståelsen av blod flyte gjennom aldring og utvikling av nevrodegenerative sykdommer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)</td>
			<td>A466250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase (Type H Blend)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithioerythritol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2 AM dye</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>F14185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recirculating chiller (Isotemp 500LCU)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>13874647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglas superfusion chamber&#160;</td>
			<td>Warner Instruments, Camden, CT, USA</td>
			<td>RC-27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip bottom (2.4&#160;&#215;&#160;5.0&#160;cm)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12-548-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anodized aluminum platform (diameter: 7.8&#160;cm)&#160;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PM6 or PH6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact aluminum stage&#160;</td>
			<td>Siskiyou, Grants Pass, OR, USA</td>
			<td>8090P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>&#160;MX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscopes&#160;</td>
			<td>Zeiss, NY, USA</td>
			<td>Stemi 2000 &#38; 2000-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber optic light sources</td>
			<td>&#160;Schott, Mainz, Germany &#38; KL200, Zeiss</td>
			<td>Fostec 8375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon inverted microscope</td>
			<td>Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA</td>
			<td>Ts2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast objectives&#160;</td>
			<td>Nikon Instruments Inc</td>
			<td>&#160;(Ph1 DL; 10X &#38; 20X)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent objectives&#160;</td>
			<td>Nikon Instruments Inc</td>
			<td>20X (S-Fluor), and 40X (Plan Fluor)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon inverted microscope</td>
			<td>Nikon Instruments Inc</td>
			<td>Eclipse TS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsyringe pump controller (Micro4 )&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA</td>
			<td>SYS-MICRO4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration isolation table</td>
			<td>Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA</td>
			<td>&#160;Micro-g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifiers</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td>
			<td>Axoclamp 2B &#38; Axoclamp 900A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headstages&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>HS-2A &#38; HS-9A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function generator&#160;</td>
			<td>EZ Digital, Seoul, South Korea</td>
			<td>FG-8002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Acquision System</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td>
			<td>Digidata 1550A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Audible Baseline Monitors</td>
			<td>Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA</td>
			<td>&#160;BM-A-TM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Storage Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix, Beaverton, Oregon, USA</td>
			<td>&#160;TDS 2024B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence System Interface, ARC Lamp + Power Supply, Hyperswitch, PMT</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td>
			<td>IonOptix Systems</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Controller&#160;&#160;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-344B or C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline Heater&#160;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SH- 27B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valve Controller&#160;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>VC-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline Flow Control Valve</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>&#160;FR-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic Puller&#160;</td>
			<td>Sutter Instruments, Novato, CA, USA</td>
			<td>P-97 or P-1000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige, East Meadow, NY, USA</td>
			<td>&#160;MF-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Tubes (Trituration)</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA</td>
			<td>1B100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Tubes (Pinning)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>G150T-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Tubes (Sharp Electrodes)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>GC100F-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter (0.22 &#181;m)&#160;&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>722-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri Dish + Charcoal Sylgard</td>
			<td>Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA</td>
			<td>DD-90-S-BLK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Style Scissors (3 mm &#38; 9.5&#160;mm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>555640S, 14364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors 3 &#38; 7 mm blades</td>
			<td>Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA</td>
			<td>Moria MC52 &#38; 15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharpened fine-tipped forceps&#160;</td>
			<td>FST</td>
			<td>Dumont #5 &#38; Dumont #55</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous measurements of intracellular calcium and membrane potential in freshly isolated and intact mouse cerebral endothelium

Cerebral arterier og deres respektive mikrosirkulasjonen levere oksygen og næringsstoffer til hjernen via blod flyte regulering. Endotelceller linje lumen blodkar og kommandoen endringer i vaskulær diameter for å møte de metabolske behovet av neurons. Primære endothelial-avhengige signalveier av hyperpolarization membran potensial (Vm) og nitrogenoksid vanligvis operere parallelt å megle vasodilatasjon og dermed øke blodstrøm. Selv om integrert å koordinere vasodilatasjon over flere millimeter vaskulær lengde, har komponenter i endotelet-avledet hyperpolarization (EDH) vært historisk vanskelig å måle. Disse komponentene av EDH innebærer intracellulær Ca2 + [Ca2 +]jeg øker og påfølgende aktivering av små - og middels konduktans Ca2 +-aktivert K+ (SKCa/IKCa) kanaler.
Her presenterer vi en forenklet illustrasjon av isolering av fersk endotelet fra musen cerebral arterier; samtidig måling av endothelial [Ca2 +]jeg og Vm med Fura-2 fotometri og intracellulær skarpe elektroder, henholdsvis; og en kontinuerlig superfusion salt løsninger og farmakologiske agenter under fysiologiske forhold (pH 7.4, 37 ° C). Bakre hjerne arterier fra sirkel av Willis fjernes uten den bakre kommunikasjon og basilar arteriene. Enzymatisk fordøyelsen av renset bakre hjerne arteriell segmenter og påfølgende føden forenkler fjerning av adventitia, perivascular nerver og glatt muskelceller. Resulterende bakre hjerne arteriell endothelial "rør" er deretter festes under et mikroskop og undersøkt ved hjelp av et kamera, photomultiplier rør, og en til to electrometers under kontinuerlig superfusion. Kollektivt kan denne metoden samtidig måle endringer i endothelial [Ca2 +]jeg og Vm diskret mobilnettet steder, i tillegg til spredning av EDH gjennom gapet veikryss til millimeter avstander langs den intakt endotelet. Denne metoden er forventet å gi en høy gjennomstrømming analyse av cerebral endothelial funksjonene underliggende mekanismene av blod flyte i normal og syke hjernen.

Skjematisk demonstrasjon av protokollen beskrevet ovenfor er vist i vedlagte tallene. En hjerne isolert fra en ung voksen mann C57BL/6N mus (5 måneder) vises i figur 1A. Bakre hjerne arterier er forsiktig isolere fra sirkel av Willis, fjernet uten bindevev, og kutt i segmenter (figur 1B-D). Fra delvis fordøyde arteriell segmenter, er intakt endothelial røret produsert og sikret på glass cover slip med feste p...

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium at JoVE.com

Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium

Demonstrert her er protokoller for (1) ferske isolere intakt cerebral endothelial "rør" og (2) samtidig måling av endothelial kalsium og membran potensial under endotelet-avledet hyperpolarization. Videre tillater disse metodene farmakologiske tuning av endothelial celle kalsium og elektriske signalene som individuelle eller interaktive eksperimentelle variabler.

Samtidige målinger av intracellulær kalsium og membran potensialet i fersk isolert og intakt musen Cerebral endotelet

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål innen cerebral vaskulær fysiologi som det gjelder cerebral blodstrømregulering under aldring og utvikling av kroniske sykdommer. Den primære fordelen med denne teknikken er at den tillater samtidig måling av intracellulær kalsium og membran potensial av cerebral arteriell endotel i sin innfødte form under fysiologiske forhold. For å isolere musehjernen, fjern huden og håret over skallen under mikroskopet.Og fjern overdreven blod med kald kalsiumfri PSS. Deretter gjør et snitt ved hjelp av bare tipsene til standard disseksjon saks. Starter fra occipital bein og strekker seg opp gjennom nesebenet i skallen.Deretter åpner hun skallen forsiktig langs snittet, ved hjelp av grove spisse tang og skille bindevevet for å avsløre hjernen. Vask forsiktig den isolerte hjernen med kald kalsiumfri PSS i et beger for å fjerne blodet. Plasser hjernen ventral side opp i et kammer som inneholder kald disseksjon løsning for isolering av cerebrale arterier.For å isolere hjernearteriene, fest den isolerte hjernen i kald disseksjonsløsning ved å sette inn to pinner i rustfritt stål gjennom den, i et kull-infundert silisiumpolymerbelegg på bunnen av et glass Petriskål. Deretter isolerer kirurgisk de bakre cerebrale arteriene ca 0,3 til 0,5 centimeter segmenter fra bakre kommuniserende og basilære arterier. Bruk pinner i rustfritt stål til å feste begge isolerte bakre cerebrale arterier i disseksjonsløsningen i petriskålen.Rengjør deretter de isolerte bakre cerebrale arteriene nøye ved å fjerne bindevev ved hjelp av skjerpet finspisset tang. Skjær de intakte arteriene i ett til to millimeter segmenter for enzymatisk fordøyelse. I denne prosedyren forbereder du triturasjonsapparatet ved hjelp av et mikroskop, et kamera og et aluminiumsstadium som holder et kammer og mikromanipulatorer.Fest en mikrosyring med en pumpekontroller ved siden av scenen og prøven. Deretter fyller du en titreringspipette helt med mineralolje og fester den over mikrosyringstempelet. Deretter trekker mikrosyringen med pumpekontrolleren ca. 130 nanoliter dissosiasjonsløsning inn i pipetten samtidig som det sikrer fravær av luftbobler.Deretter plasserer du intakte arterielle segmenter i en milliliter dissosiasjonsløsning med nødvendige konsentrasjoner av enzymer i et 10 milliliter glassrør. Inkuber ved 34 grader Celsius i 10 til 12 minutter for delvis fordøyelse. Etter fordøyelsen, erstatt enzymoppløsningen med fem milliliter frisk dissosiasjonsløsning.Bruk en en milliliter pipette til å overføre ett segment til kammeret som inneholder dissosiasjonsløsning ved romtemperatur. Deretter plasserer pipetten i dissosiasjonsløsningen i kammeret og plasserer den nær den ene enden av det fordøyde fartøyet. Sett en hastighet innenfor området to til fem nanoliter per sekund på pumpekontrolleren for skånsom triturasjon.Mens du ser gjennom 100 ganger til 200 ganger forstørrelse trekke og kaste ut arteriell segmentet for å fjerne glatte muskelceller mens du produserer en endotelrør. Bruk om nødvendig finspissede tang for å skille dissosiert adventitia og intern elastisk lamina fra endeotelrøret. Bekreft at alle glatte muskelceller er dissosiert og at bare endotelceller forblir som intakte rør.Bruk mikromanipulatorer til å feste hver ende av endeotelrøret på glassdekselet slip av superfusjonskammeret ved hjelp av borosilikatglassfesting pipetter. Vask ut dissosiert adventitia og glatte muskelceller fra kammeret. Og erstatt dissosiasjonsløsningen med to molar mer kalsiumklorid PSS.Overfør den mobile plattformen med sikret endotelrør til mikroskopet av superfusjon og eksperimentell rigg. Bruk deretter seks rene 50 milliliter reservoarer for kontinuerlig levering av PSS og respektive legemiddelløsninger under forsøket. Bruk den in-line strømningskontrollventilen til å manuelt sette strømningshastigheten så konsistent som laminerstrømning mens du matcher strømningsstrømmen til vakuumsuging.Lever PSS til kammeret for superfusjon av endotelrøret i minst fem minutter før du registrerer bakgrunnsdata og fargestofflasting. For å måle membranpotensialet samtidig med intracellulær kalsiumkonsentrasjon, trekk en skarp elektrode og fyll den med to molarkaliumklorid for å registrere fra celler lastet med fura-2 fargestoff. For å studere intracellulær kobling via fargeoverføring, fyll mikroelektrogen med 0,1% propidiumjodid oppløst i to molarkaliumklorid.Deretter plasserer elektroden over en sølvtråd belagt med klorid i pipetteholderen festet til et elektrometerhodetrinn festet med en mikromanipulator. Bruk mikromanipulatoren til kort å plassere spissen av elektroden i den flytende PSS i kammeret, mens du ser gjennom det fire ganger objektive målet. Deretter setter du hvilemembranpotensialet til null som konsistent med jordet badpotensial.Bruk eventi nødvendig hørbare baselinemonitorer som er koblet til elektrometer, til å knytte lydhøyde til potensielle opptak. Etterpå øker du forstørrelsen til 400 ganger ved hjelp av et 40 ganger objektiv og plasserer spissen av elektroden like over cellen i endeotelrøret. Juster det fotometriske vinduet ved hjelp av fotometriprogramvaren for å fokusere på ca. 50 til 80 endotelceller.Plasser deretter elektroden forsiktig i en av cellene i endeotelrøret ved hjelp av mikromanipulatoren og vent minst to minutter på at hvilemembranpotensialet stabiliserer seg. Når hvilemembranpotensialet er stabilt til forventet verdi, slå på fotomultiplierrøret på fluorescensgrensesnittet i fravær av lys og begynne oppkjøpet av intracellulær kalsiumkonsentrasjon ved spennende Fura-2 vekselvis på 340 og 380 nanometer mens du samler florescence utslipp på 510 nanometer. Når samtidige målinger av membranpotensial og intracellulær kalsiumkonsentrasjon er etablert, la det være omtrent fem minutter for superfusjon av endotelrør med PSS med konstant laminær strømningshastighet før bruk av legemidler.Påfør stoffet som er utarbeidet i PSS til superfusjonskammeret med konstant strømningshastighet. Under medikamentbehandling måle membranpotensialet i F340/F380-forhold samtidig. Når eksperimentet er ferdig, trekk elektroden ut av cellen.Stopp deretter respektive registreringer av membranpotensial og intracellulær kalsiumkonsentrasjon og lagre filene for dataanalyse. Dette er et differensial interferens kontrastbilde av en mus cerebral arteriell endotelrør, justert for eksperiment i fotometrisk vindu ved hjelp av et 40 ganger mål. En skarp elektrode plasseres i en celle, som vist øverst på bildet.Her er eksemplene på rå spor for samtidig måling av F340/F380-forhold og membranpotensial som svar på 100 mikromos ATP. Etter denne prosedyren kan andre metoder som konfokal fluorescerende mikroskopi utføres for å svare på flere spørsmål om mikrodomenesignalering av endotelkalsium og reaktive oksygenarter, som eksempler. Generelt vil denne teknikken fortsette å bane vei for undersøkelser i cellulær fysiologi for å utforske vaskulær funksjon og aldring i blod og lymfesirkulasjon.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

Isolering av humant Atrial myocytes for samtidige målinger av Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Transienter og Membran Currents

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Intramikros for Imaging subcellulære strukturer i levende mus Uttrykke Fluorescent Proteiner

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Vurdering av kalsium Sparks i Intakt skjelettmuskelfibre

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

Cytosolisk Kalsium Målinger i nyre Epitelceller med flowcytometri

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli

Single-kanal Analyse og Kalsium Imaging i Podocytes av nyisolerte glomeruli

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

Musen isolerte perfuserte Nyre Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Samtidig Måling av mitokondrie Kalsium og Mitokondriell membranpotensialet i levende celler med fluorescerende mikros

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolering av høykvalitets murine atrielle og ventrikulære myocytter for samtidige målinger av ca2+ transienter og L-type kalsiumstrøm

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Isolating and Imaging Live, Intact Pacemaker Regions of Mouse Renal Pelvis by Vibratome Sectioning

Isolere og imaging Live, intakt Pacemaker regioner av mus Renal Pelvis av Vibratome seksjonering

The renal pelvis (RP) is a funnel-shaped, smooth muscle structure that facilitates normal urine transport from the kidney to the ureter by regular, ...