Name: simultaneous measurements of intracellular calcium and membrane potential in freshly isolated and intact mouse cerebral endothelium
Uploaded: 2019-01-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium at JoVE.com

Agradecemos Charles Hewitt excelente assistência técnica, enquanto estabelecendo e equipamentos necessários para os protocolos atuais. Agradecemos os Drs Sean M. Wilson e Christopher G. Wilson, do centro para a biologia Perinatal, LLU fornecendo-nos com um microscópio invertido adicional e eletrômetro, respectivamente. Esta pesquisa foi apoiada pela National Institutes of Health grant R00-AG047198 (EJB) e fundos de start-up da faculdade novos Loma Linda University School of Medicine. O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do institutos nacionais da saúde.

Antes de realizar os experimentos seguintes, certifique-se de que usar de todos os cuidados com animais e protocolos são aprovados pelos cuidados institucionais do Animal e usar Comité (IACUC) e executados de acordo com do Conselho Nacional de pesquisa "guia para o cuidado e o uso de ' De animais de laboratório (8th Edition, 2011) e as diretrizes de chegada. O IACUC da Loma Linda University aprovou todos os protocolos utilizados para este manuscrito para masculinos e femininos camundongos ...

<ol>
	<li>Longden, T. A., Hill-Eubanks, D. C., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channel+networks+in+the+control+of+cerebral+blood+flow.">Ion channel networks in the control of cerebral blood flow.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 36 (3), 492-512 (2016).</li><li>Chen, B. R., Kozberg, M. G., Bouchard, M. B., Shaik, M. A., Hillman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+role+for+the+vascular+endothelium+in+functional+neurovascular+coupling+in+the+brain.">A critical role for the vascular endothelium in functional neurovascular coupling in the brain.</a> Journal of the American Heart Association. 3 (3), e000787 (2014).</li><li>Iadecola, C., Yang, G., Ebner, T. J., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+and+propagated+vascular+responses+evoked+by+focal+synaptic+activity+in+cerebellar+cortex.">Local and propagated vascular responses evoked by focal synaptic activity in cerebellar cortex.</a> Journal of Neurophysiology. 78 (2), 651-659 (1997).</li><li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+blood+flow+in+the+microcirculation:+role+of+conducted+vasodilation.">Regulation of blood flow in the microcirculation: role of conducted vasodilation.</a> Acta Physiologica (Oxford, England). 202 (3), 271-284 (2011).</li><li>Garland, C. J., Dora, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EDH:+endothelium-dependent+hyperpolarization+and+microvascular+signalling.">EDH: endothelium-dependent hyperpolarization and microvascular signalling.</a> Acta Physiologica (Oxford, England). 219 (1), 152-161 (2017).</li><li>Hakim, M. A., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+dynamics+of+isolated+cerebral+and+skeletal+muscle+endothelial+tubes:+Differential+roles+of+G-protein-coupled+receptors+and+K++channels.">Electrical dynamics of isolated cerebral and skeletal muscle endothelial tubes: Differential roles of G-protein-coupled receptors and K+ channels.</a> Pharmacology Research &amp; Perspectives. 6 (2), e00391 (2018).</li><li>Marrelli, S. P., Eckmann, M. S., Hunte, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+endothelial+intermediate+conductance+KCa+channels+in+cerebral+EDHF-mediated+dilations.">Role of endothelial intermediate conductance KCa channels in cerebral EDHF-mediated dilations.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (4), H1590-H1599 (2003).</li><li>Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+electrical+signaling+in+arterial+endothelial+tubes:+New+insights+into+cellular+physiology+and+cardiovascular+function.">Calcium and electrical signaling in arterial endothelial tubes: New insights into cellular physiology and cardiovascular function.</a> Microcirculation. 24 (3), (2017).</li><li>Endemann, D. H., Schiffrin, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+dysfunction.">Endothelial dysfunction.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 15 (8), 1983-1992 (2004).</li><li>Rajendran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vascular+endothelium+and+human+diseases.">The vascular endothelium and human diseases.</a> International Journal of Biological Sciences. 9 (10), 1057-1069 (2013).</li><li>Socha, M. J., Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+effects+on+morphological+integrity+and+Ca2++signaling+in+freshly+isolated+murine+feed+artery+endothelial+cell+tubes.">Temperature effects on morphological integrity and Ca2+ signaling in freshly isolated murine feed artery endothelial cell tubes.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (3), H773-H783 (2011).</li><li>Socha, M. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+microvascular+endothelial+tubes+from+mouse+resistance+arteries.">Isolation of microvascular endothelial tubes from mouse resistance arteries.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), (2013).</li><li>Ye, X., Beckett, T., Bagher, P., Garland, C. J., Dora, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-A+inhibits+agonist-mediated+Ca2++responses+and+activation+of+IKCa+channels+in+mouse+resistance+artery+endothelial+cells.">VEGF-A inhibits agonist-mediated Ca2+ responses and activation of IKCa channels in mouse resistance artery endothelial cells.</a> The Journal of Physiology. , (2018).</li><li>Norton, C. E., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcitonin+gene-related+peptide+hyperpolarizes+mouse+pulmonary+artery+endothelial+tubes+through+KATP+channel+activation.">Calcitonin gene-related peptide hyperpolarizes mouse pulmonary artery endothelial tubes through KATP channel activation.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular. , (2018).</li><li>Behringer, E. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potential+governs+calcium+influx+into+microvascular+endothelium:+integral+role+for+muscarinic+receptor+activation.">Membrane potential governs calcium influx into microvascular endothelium: integral role for muscarinic receptor activation.</a> The Journal of Physiology. 593 (20), 4531-4548 (2015).</li><li>Behringer, E. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Aging+on+Calcium+Signaling+and+Membrane+Potential+in+Endothelium+of+Resistance+Arteries:+A+Role+for+Mitochondria.">Impact of Aging on Calcium Signaling and Membrane Potential in Endothelium of Resistance Arteries: A Role for Mitochondria.</a> The Journal of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 72 (12), 1627-1637 (2017).</li><li>Behringer, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+electrical+dynamics+in+lymphatic+endothelium.">Calcium and electrical dynamics in lymphatic endothelium.</a> The Journal of Physiology. 595 (24), 7347-7368 (2017).</li><li>Simmers, M. B., Pryor, A. W., Blackman, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arterial+shear+stress+regulates+endothelial+cell-directed+migration,+polarity,+and+morphology+in+confluent+monolayers.">Arterial shear stress regulates endothelial cell-directed migration, polarity, and morphology in confluent monolayers.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiolog. 293 (3), H1937-H1946 (2007).</li><li>Sandow, S. L., Grayson, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limits+of+isolation+and+culture:+intact+vascular+endothelium+and+BKCa.">Limits of isolation and culture: intact vascular endothelium and BKCa.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 297 (1), H1-H7 (2009).</li><li>Diaz-Otero, J. M., Garver, H., Fink, G. D., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+is+associated+with+changes+to+the+biomechanical+properties+of+the+posterior+cerebral+artery+and+parenchymal+arterioles.">Aging is associated with changes to the biomechanical properties of the posterior cerebral artery and parenchymal arterioles.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (3), H365-H375 (2016).</li><li>Kochukov, M. Y., Balasubramanian, A., Abramowitz, J., Birnbaumer, L., Marrelli, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+endothelial+transient+receptor+potential+C3+channel+is+required+for+small+conductance+calcium-activated+potassium+channel+activation+and+sustained+endothelial+hyperpolarization+and+vasodilation+of+cerebral+artery.">Activation of endothelial transient receptor potential C3 channel is required for small conductance calcium-activated potassium channel activation and sustained endothelial hyperpolarization and vasodilation of cerebral artery.</a> Journal of the American Heart Association. 3 (4), (2014).</li><li>Zhang, L., Papadopoulos, P., Hamel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+TRPV4+channels+mediate+dilation+of+cerebral+arteries:+impairment+and+recovery+in+cerebrovascular+pathologies+related+to+Alzheimer's+disease.">Endothelial TRPV4 channels mediate dilation of cerebral arteries: impairment and recovery in cerebrovascular pathologies related to Alzheimer's disease.</a> British Journal of Pharmacology. 170 (3), 661-670 (2013).</li><li>Socha, M. J., Domeier, T. L., Behringer, E. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+intercellular+Ca2++signaling+in+endothelial+cell+tubes+of+mouse+resistance+arteries.">Coordination of intercellular Ca2+ signaling in endothelial cell tubes of mouse resistance arteries.</a> Microcirculation. 19 (8), 757-770 (2012).</li></ol>

À luz dos recentes desenvolvimentos6,15,16,17, demonstraremos agora o método para isolar o endotélio arterial cerebral de rato em preparação para a medida simultânea de [Ca2 +] eu e o Vm subjacentes EDH consistentemente para ~ 2 h a 37 ° C. Embora tecnicamente difícil, podemos medir a-celular acoplamento também (veja referência6...

Fluxo de sangue em todo o cérebro é regulado pela coordenação da vasodilatação entre artérias cerebrais e arteríolas em redes vasculares1. Células endoteliais que revestem mudanças de comando de artérias de resistência cerebral vascular diâmetro conforme necessário para atender a demanda metabólica dos neurônios1,2,3. Em particular, durante a hiperpolarização derivado de endotélio (vulgarmente conhecida por EDH), intracelular Ca2 + ([Ca2 +]eu) e sinalização eléctrica em células endoteliais vasodilatação coordenada entre as células endoteliais e seus células de músculo liso circundante através de junções para relaxamento arterial4. Iniciação fisiológica de EDH sequencialmente implica a estimulação do Gq-acoplados a receptores (GPCRs), um aumento de [Ca2 +]eue ativação de endotelial pequeno - e intermediário-Ca2 +-ativado K+ (SKCacomoCa) canais para hiperpolarizar a membrana endotelial cerebral potenciais (Vm)5,6,7. Assim, a relação íntima de endotelial [Ca2 +]eu e Vm é parte integrante do Regulamento de fluxo de sangue e indispensável para cardio e cerebrovascular função6,8. Em toda a literatura mais ampla, numerosos estudos relataram Associação de disfunção endotelial vascular com o desenvolvimento de doenças crônicas (por exemplo, hipertensão, diabetes, insuficiência cardíaca, doença arterial coronariana, insuficiência renal crônica, doença arterial periférica)9,10, indicando a importância de se estudar a função endotelial em condições fisiológicas, bem como patológicas.
Endotélio vascular é essencial para a produção de hiperpolarização, vasodilatação e perfusão do tecido e assim, o exame de suas propriedades celulares nativas é crucial. Como um modelo de estudo geral, preparação de modelo de tubo endotelial arterial o mouse foi publicada antes por músculo esquelético11,12, intestino13, pulmão14e, recentemente, para o cérebro6. Estudos de simultânea [Ca2 +]eu e medições dem V em particular têm sido publicados para o músculo esquelético endotélio arterial15,16 , bem como de endotélio de vasos linfáticos17. Além de estudos primários, utilizando a abordagem de tubo endotelial, uma revisão abrangente das suas vantagens e desvantagens8 pode ser consultada para determinar se esta ferramenta experimental é apropriada para um estudo específico. Em breve, uma vantagem é que os principais componentes fisiológicos da função endothelial da pilha são retidos (por exemplo,, Ca2 + influxo e liberação intracelular, hiperpolarização de Vm até o potencial de Nernst para K+ através SKCacomo ativação deCa e acoplamento intercelular endoteliais através de junções) sem confusão de fatores tais como a entrada do nervo perivascular, função de canais voltagem-dependentes de músculo liso e contratilidade, circulação do sangue e influências hormonais8. Em contraste, abordagens de cultura celular comumente usados introduzir alterações significativas na morfologia18 e íon canal expressão19 de uma maneira que grandemente pode ofuscar as comparações fisiológicas observações determinadas ex vivo ou na vivo. Limitações incluem a falta de integração com outros componentes essenciais para regular o fluxo de sangue, tais como músculo liso e flexibilidade restrita em um horário experimental, como este modelo ideal é testado dentro de 4 h de isolamento de segmento vascular intacta do animal.
Construção de um protocolo de vídeo anterior de autoria de Socha e Segal12 e recentes desenvolvimentos experimentais no intercalar6,15,16, por este meio demonstrar o isolamento do endotélio fresco de artéria cerebral posterior e medições simultâneas de endotelial [Ca2 +]eu e Vm usando fotometria de Fura-2 e eletrodos afiados intracelulares, respectivamente. Além disso, esta experiência implica superfusion contínua de soluções salinas e agentes farmacológicos durante condições fisiológicas (pH 7,4, 37 ° C). Escolhemos a artéria cerebral posterior, como rende endotélio isolado com a integridade estrutural (células acopladas através de junções) e dimensões suficientes (largura ≥ 50 µm, comprimento ≥300 µm) favoráveis para intrae sinalização intercelular ao longo e entre células endoteliais. Além disso, estudos da artéria cerebral posterior roedor estão substancialmente representados na literatura e abrangem o exame de mecanismos fundamentais de sinalização endoteliais vascular desenvolvimento/envelhecimento e patologia20, 21 , 22. esta aplicação experimental é esperada para produzir uma análise de alto rendimento da função endotelial cerebral (e disfunção) e desse modo permitirá avanços significativos no entendimento do Regulamento de fluxo de sangue ao longo envelhecimento e o desenvolvimento de doenças neurodegenerativas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)</td>
			<td>A466250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase (Type H Blend)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithioerythritol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2 AM dye</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>F14185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recirculating chiller (Isotemp 500LCU)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>13874647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglas superfusion chamber&#160;</td>
			<td>Warner Instruments, Camden, CT, USA</td>
			<td>RC-27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip bottom (2.4&#160;&#215;&#160;5.0&#160;cm)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12-548-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anodized aluminum platform (diameter: 7.8&#160;cm)&#160;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PM6 or PH6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact aluminum stage&#160;</td>
			<td>Siskiyou, Grants Pass, OR, USA</td>
			<td>8090P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>&#160;MX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscopes&#160;</td>
			<td>Zeiss, NY, USA</td>
			<td>Stemi 2000 &#38; 2000-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber optic light sources</td>
			<td>&#160;Schott, Mainz, Germany &#38; KL200, Zeiss</td>
			<td>Fostec 8375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon inverted microscope</td>
			<td>Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA</td>
			<td>Ts2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast objectives&#160;</td>
			<td>Nikon Instruments Inc</td>
			<td>&#160;(Ph1 DL; 10X &#38; 20X)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent objectives&#160;</td>
			<td>Nikon Instruments Inc</td>
			<td>20X (S-Fluor), and 40X (Plan Fluor)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon inverted microscope</td>
			<td>Nikon Instruments Inc</td>
			<td>Eclipse TS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsyringe pump controller (Micro4 )&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA</td>
			<td>SYS-MICRO4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration isolation table</td>
			<td>Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA</td>
			<td>&#160;Micro-g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifiers</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td>
			<td>Axoclamp 2B &#38; Axoclamp 900A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headstages&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>HS-2A &#38; HS-9A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function generator&#160;</td>
			<td>EZ Digital, Seoul, South Korea</td>
			<td>FG-8002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Acquision System</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td>
			<td>Digidata 1550A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Audible Baseline Monitors</td>
			<td>Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA</td>
			<td>&#160;BM-A-TM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Storage Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix, Beaverton, Oregon, USA</td>
			<td>&#160;TDS 2024B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence System Interface, ARC Lamp + Power Supply, Hyperswitch, PMT</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td>
			<td>IonOptix Systems</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Controller&#160;&#160;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-344B or C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline Heater&#160;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SH- 27B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valve Controller&#160;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>VC-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline Flow Control Valve</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>&#160;FR-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic Puller&#160;</td>
			<td>Sutter Instruments, Novato, CA, USA</td>
			<td>P-97 or P-1000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige, East Meadow, NY, USA</td>
			<td>&#160;MF-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Tubes (Trituration)</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA</td>
			<td>1B100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Tubes (Pinning)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>G150T-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Tubes (Sharp Electrodes)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>GC100F-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter (0.22 &#181;m)&#160;&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>722-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri Dish + Charcoal Sylgard</td>
			<td>Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA</td>
			<td>DD-90-S-BLK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Style Scissors (3 mm &#38; 9.5&#160;mm)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>555640S, 14364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors 3 &#38; 7 mm blades</td>
			<td>Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA</td>
			<td>Moria MC52 &#38; 15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharpened fine-tipped forceps&#160;</td>
			<td>FST</td>
			<td>Dumont #5 &#38; Dumont #55</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous measurements of intracellular calcium and membrane potential in freshly isolated and intact mouse cerebral endothelium

Artérias cerebrais e sua respectiva microcirculação entregam oxigênio e nutrientes para o cérebro através do sangue fluxo do regulamento. Células endoteliais linha o lúmen dos vasos sanguíneos e mudanças de comando no diâmetro vascular conforme necessário para atender a demanda metabólica dos neurônios. Primárias vias de sinalização endotélio-dependente de hiperpolarização do potencial de membrana (Vm) e óxido nítrico normalmente operam em paralelo para mediar a vasodilatação e, assim, aumentar o fluxo sanguíneo. Embora integral para coordenar a vasodilatação mais vários milímetros de comprimento vascular, componentes do endotélio-derivado hiperpolarização (EDH) foram historicamente difíceis de medir. Esses componentes de EDH implicar intracelular Ca2 + [Ca2 +]eu aumenta e subsequente ativação de pequenas e intermediário condutância de Ca2 +-ativado K+ (SKCacomoCa) canais.
Aqui, apresentamos uma ilustração simplificada do isolamento de fresco endotélio de artérias cerebrais do rato; medições simultâneas de endotelial [Ca2 +]eu e Vm usando fotometria de Fura-2 e eletrodos afiados intracelulares, respectivamente; e uma superfusion contínua de soluções salinas e agentes farmacológicos sob condições fisiológicas (pH 7,4, 37 ° C). Artéria cerebral posterior do círculo de Willis é removida sem a comunicação posterior e as artérias basilar. Digestão enzimática de segmentos de arteriais cerebrais posteriores limpos e posterior trituração facilita a remoção da adventícia, perivascular nervos e células musculares lisas. Resultantes posteriores cerebrais arteriais endoteliais "tubos" Então são protegidos sob um microscópio e examinaram usando uma câmera, tubo fotomultiplicador, e um ou dois Electrómetros sob contínua superfusion. Coletivamente, esse método pode medir simultaneamente alterações endoteliais [Ca2 +]eu e Vm em locais celulares discretas, além da propagação de EDH através de junções até distâncias milímetros ao longo da intacta endotélio. Este método é esperado para produzir uma análise do elevado-throughput das funções endoteliais cerebrais subjacente mecanismos de regulação de fluxo de sangue no cérebro normal e doente.

A demonstração esquemática do protocolo descrito acima é mostrada nas figuras anexadas. Um cérebro isolado de um jovem macho C57BL/6N rato adulto (5 meses) é mostrado na figura 1A. Artérias cerebrais posteriores são cuidadosamente isoladas do círculo de Willis, removido sem tecido conjuntivo e cortado em segmentos (figura 1B-D). De segmentos arteriais parcialmente digeridos, o tubo endotelial intacto é ...

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Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium

Demonstrado aqui são protocolos para isolar (1) recém endoteliais cerebrais intactos "tubos" e medições (2) simultâneas de cálcio endotelial e potencial durante o endotélio-derivado hiperpolarização de membrana. Além disso, esses métodos permitem a otimização farmacológica de cálcio da célula endotelial e sinalização eléctrica como variáveis experimentais individuais ou interativas.

Medições simultâneas de cálcio intracelular e potencial de membrana no endotélio Cerebral rato recém isoladas e intacta

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da fisiologia vascular cerebral no que se refere à regulação do fluxo sanguíneo cerebral durante o envelhecimento e desenvolvimento de doenças crônicas. A principal vantagem desta técnica é que permite a medição simultânea do cálcio intracelular e potencial de membrana do endotélio arterial cerebral em sua forma nativa sob condições fisiológicas. Para isolar o cérebro do rato, sob o microscópio remova a pele e o cabelo sobre o crânio.E remova o sangue excessivo com PSS frio sem cálcio. Em seguida, faça uma incisão usando apenas as pontas da tesoura de dissecção padrão. Começando pelo osso occipital e estendendo-se através do osso nasal do crânio.Em seguida, abra seu crânio cuidadosamente ao longo da incisão, usando fórceps de ponta grosseira e separe o tecido conjuntivo para expor o cérebro. Lave suavemente o cérebro isolado com PSS frio sem cálcio em um béquer para remover o sangue. Coloque o lado ventral do cérebro para cima em uma câmara contendo solução de dissecção a frio para o isolamento das artérias cerebrais.Para isolar as artérias cerebrais, fixar o cérebro isolado na solução de dissecção a frio, inserindo dois pinos de aço inoxidável através dele, em um revestimento de polímero de silício infundido com carvão na parte inferior de uma placa de petri de vidro. Posteriormente, isole cirurgicamente as artérias cerebrais posteriores em cerca de 0,3 a 0,5 centímetros dos segmentos posteriores de comunicação e basilares. Use pinos de aço inoxidável para fixar ambas as artérias cerebrais posteriores isoladas na solução de dissecção na placa de Petri.Em seguida, limpe cuidadosamente as artérias cerebrais posteriores isoladas, removendo o tecido conjuntivo usando fórceps afiados de ponta fina. Corte as artérias intactas em segmentos de um a dois milímetros para digestão enzimática. Neste procedimento, prepare o aparelho de trituração usando um microscópio, uma câmera e um estágio de alumínio segurando uma câmara e micromanipuladores.Fixar uma microsiringe com um controlador de bomba adjacente ao estágio e ao espécime. Em seguida, encha completamente uma pipeta de titulação com óleo mineral e fixe-a sobre o pistão de microsiringe. Em seguida, usando o microsiringe com o controlador da bomba retire cerca de 130 nanoliters de solução de dissociação na pipeta, garantindo a ausência de bolhas de ar.Posteriormente, coloque segmentos arteriais intactos em um mililitro de solução de dissociação com concentrações necessárias de enzimas em um tubo de vidro de 10 mililitros. Incubar a 34 graus Celsius por 10 a 12 minutos para digestão parcial. Após a digestão, substitua a solução enzimática por cinco mililitros de solução de dissociação fresca.Usando uma pipeta de um mililitro, transfira um segmento para a câmara contendo solução de dissociação à temperatura ambiente. Em seguida, coloque a pipeta na solução de dissociação na câmara e posicione-a perto de uma extremidade do vaso digerido. Defina uma taxa dentro da faixa de dois a cinco nanoliters por segundo no controlador da bomba para trituração suave.Ao visualizar 100 vezes a 200 vezes a ampliação, retire e ejete o segmento arterial para dissociar células musculares lisas enquanto produz um tubo endotelial. Se necessário, use cuidadosamente fórceps finos para separar a adventitia dissociada e a lâmina elástica interna do tubo endotelial. Confirme que todas as células musculares lisas estão dissociadas e que apenas as células endoteliais permanecem como tubo intacto.Usando micromanipuladores, fixe cada extremidade do tubo endotelial no deslizamento de tampa de vidro da câmara de superfusão usando pipetas de fixação de vidro borossilicato. Lave a adventitia dissociada e as células musculares lisas da câmara. E substitua a solução de dissociação por dois molar mais Cloreto de Cálcio PSS.Transfira a plataforma móvel com tubo endotelial seguro para o microscópio de superfusão e plataforma experimental. Em seguida, use seis reservatórios limpos de 50 mililitros para a entrega contínua de PSS e respectivas soluções de medicamentos durante o experimento. Use a válvula de controle de fluxo em linha para definir manualmente a taxa de fluxo tão consistente quanto o fluxo de laminer enquanto corresponde a alimentação de fluxo à sucção do vácuo.Entregue PSS na câmara para a superfusão do tubo endotelial por pelo menos cinco minutos antes de registrar os dados de fundo e o carregamento de corantes. Para medir o potencial da membrana simultaneamente com concentração intracelular de cálcio, puxe um eletrodo afiado e encha-o com dois cloreto de potássio molar para registrar a partir de células carregadas com corante fura-2. Para estudar o acoplamento intracelular via transferência de corante, encha o microeletrou com iodeto de 0,1% de propidium dissolvido em dois cloreto de potássio molar.Em seguida, coloque o eletrodo sobre um fio de prata revestido com cloreto no suporte de pipeta preso a um estágio de cabeça eletrometro preso com um micromanipulador. Use o micromanipulador para posicionar brevemente a ponta do eletrodo no PSS que flui na câmara, enquanto visualiza através do objetivo quatro vezes. Posteriormente, defina o potencial da membrana de repouso a zero como consistente com o potencial de banho aterrado.Se desejar, use monitores de linha de base audíveis ligados a eletrometros para associar o tom sonoro a gravações potenciais. Depois, aumente a ampliação para 400 vezes usando um objetivo de 40 vezes e posicione a ponta do eletrodo logo acima da célula do tubo endotelial. Ajuste a janela fotométrica usando o software de fotometria para focar em cerca de 50 a 80 células endoteliais.Em seguida, coloque suavemente o eletrodo em uma das células do tubo endotelial usando o micromanipulador e espere pelo menos dois minutos para que o potencial da membrana de repouso se estabilize. Uma vez que o potencial da membrana de repouso seja estável em seu valor esperado, ligue o tubo fotomultiplier na interface da fluorescência na ausência de luz e comece a aquisição da concentração intracelular de cálcio pelo excitante Fura-2 alternadamente em 340 e 380 nanômetros enquanto coleta a emissão de floresnce a 510 nanômetros. Uma vez estabelecidas medidas simultâneas do potencial da membrana e da concentração intracelular de cálcio, permita cerca de cinco minutos para a superfusão do tubo endotelial com PSS a uma taxa de fluxo laminar constante antes da aplicação de drogas.Aplique a droga preparada em PSS na câmara de superfusão a uma taxa de fluxo constante. Durante o tratamento medicamentoso mede o potencial da membrana nas proporções F340/F380 simultaneamente. Uma vez feito o experimento, retire o eletrodo da célula.Em seguida, pare as respectivas gravações de potencial de membrana e concentração intracelular de cálcio e salve os arquivos para análise de dados. Esta é uma imagem de contraste de interferência diferencial de um tubo endotelial arterial cerebral do rato, ajustado para experimento em janela fotométrica usando um objetivo de 40 vezes. Um eletrodo afiado é colocado em uma célula, como mostrado na parte superior da imagem.Aqui estão os exemplos de traços brutos para medição simultânea da razão F340/F380 e potencial de membrana em resposta a 100 ATP micromolar. Após este procedimento, outros métodos como microscopia fluorescente confocal, podem ser realizados a fim de responder a perguntas adicionais sobre a sinalização de microdomina de cálcio endotelial, e espécies reativas de oxigênio, como exemplos. Em geral, essa técnica continuará a abrir caminho para pesquisas em fisiologia celular explorarem a função vascular e o envelhecimento no sangue e na circulação linfática.

Research

JoVE Journal

Biology

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Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolamento de miócitos murinos atrial e ventricular de alta qualidade para medidas simultâneas de Ca2+ transitórios e corrente de cálcio tipo L

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Isolating and Imaging Live, Intact Pacemaker Regions of Mouse Renal Pelvis by Vibratome Sectioning

Isolando e Imagens Ao Vivo, Regiões de Marcapasso Intacta da Pelve Renal do Rato por Vibratome Sectioning

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