Name: sperm collection of differential quality using density gradient centrifugation
Uploaded: 2018-11-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sperm Collection of Differential Quality Using Density Gradient Centrifugation at JoVE.com

Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) på University of Georgia.
1. vask ved hjælp af traditionelle centrifugering
<ol><li>Forberede fosfatstødpudeopløsningen (PBS). Tilføje 8,0 g NaCl, 0,2 g af KCl, 1.44 g Na2HPO4 og 0,24 g KH2PO4 til 800 mL destilleret vand (dH2O). PH indstilles til 7.4 ved hjælp af 0,1 N HCl og bringer løsningen til 1 L med dH2O.</li>
	<li>...

<ol>
	<li>Spargo, S. C., Hope, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+nomenclature+of+the+zona+pellucida+gene+family.">Evolution and nomenclature of the zona pellucida gene family.</a> Biology Reproduction. 68, 358-362 (2003).</li><li>Okamura, F., Nishiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+passage+of+spermatozoa+through+the+vitelline+membrane+in+the+domestic+fowl,+Gallus+gallus.">The passage of spermatozoa through the vitelline membrane in the domestic fowl, Gallus gallus.</a> Cell and Tissue Research. 188 (3), 497-508 (1978).</li><li>Henkel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+function+and+assisted+reproduction+technology.">Sperm function and assisted reproduction technology.</a> Reproductive Medicine and Biology. 4, 7-30 (2005).</li><li>Reddy, R. P., Bakst, M. R., Wishart, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+Insemination+of+broilers:+Economic+and+management+implications.">Artificial Insemination of broilers: Economic and management implications.</a> Proceedings of 1st International Symposium on Artificial Insemination of Poultry. Poultry Science Association. , 73-89 (1995).</li><li>Howarth, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Examination+for+Sperm+Capacitation+in+the+Fowl.">An Examination for Sperm Capacitation in the Fowl.</a> Biology of Reproduction. 3, 338-341 (1971).</li><li>Menkveld, R., Holleboom, C. A. G., Rhemrev, J. P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+and+significance+of+sperm+morphology.">Measurement and significance of sperm morphology.</a> Asian Journal of Andrology. 13, 59-68 (2011).</li><li>Kumaresan, A., Johannisson, A., Al-Essawe, E. M., Morrell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+viability,+reactive+oxygen+species,+and+DNA+fragmentation+index+combined+can+discriminate+between+above-+and+below-average+fertility+bulls.">Sperm viability, reactive oxygen species, and DNA fragmentation index combined can discriminate between above- and below-average fertility bulls.</a> Journal of Dairy Science. 100, 5824-5836 (2017).</li><li>Froman, D. P., McLean, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Objective+measurement+of+sperm+motility+based+upon+sperm+penetration+of+Accudenz.">Objective measurement of sperm motility based upon sperm penetration of Accudenz.</a> Poultry Science. 75, 776-784 (1996).</li><li>Zaneveld, L. J., De Jonge, C. J., Anderson, R. A., Mack, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+sperm+capacitation+and+the+acrosome+reaction.">Human sperm capacitation and the acrosome reaction.</a> Human Reproduction. 6 (9), 1265-1274 (1991).</li><li>Ahammad, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acrosome+reaction+of+fowl+sperm:+Evidence+for+shedding+of+acrosomal+cap+in+intact+form+to+release+acrosomal+enzyme.">Acrosome reaction of fowl sperm: Evidence for shedding of acrosomal cap in intact form to release acrosomal enzyme.</a> Poultry Science. 92 (3), 798-803 (2013).</li><li>Ahammad, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturational+changes+in+motility,+acrosomal+proteolytic+activity,+and+penetrability+of+the+inner+perivitelline+layer+of+fowl+sperm,+during+their+passage+through+the+male+genital+tract.">Maturational changes in motility, acrosomal proteolytic activity, and penetrability of the inner perivitelline layer of fowl sperm, during their passage through the male genital tract.</a> Theriogenology. 76 (6), 1100-1109 (2011).</li><li>Chalah, T., Brillard, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+assessment+of+fowl+sperm+viability+by+eosin-nigrosin+and+dual+fluorescence.">Comparison of assessment of fowl sperm viability by eosin-nigrosin and dual fluorescence.</a> Theriogenology. 50 (3), 487-493 (1998).</li><li>Aitken, R. J., West, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+relationship+between+reactive+oxygen+species+production+and+leukocyte+infiltration+in+fractions+of+human+semen+separated+on+Percoll+gradients.">Analysis of the relationship between reactive oxygen species production and leukocyte infiltration in fractions of human semen separated on Percoll gradients.</a> International Journal of Andrology. 13, 433-451 (1990).</li><li>Mortimer, D., Mortimer, S. T., Carrell, D., Aston, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Density+Gradient+Separation+of+Sperm+for+Artificial+Insemination.">Density Gradient Separation of Sperm for Artificial Insemination.</a> Spermatogenesis. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols. , 927 (2013).</li><li>Qingling, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+semen+by+density+gradient+centrifugation+selects+spermatozoa+with+longer+telomeres+for+assisted+reproduction+techniques.">Processing of semen by density gradient centrifugation selects spermatozoa with longer telomeres for assisted reproduction techniques.</a> Reproductive BioMedicine Online. 31, 44-50 (2015).</li><li>Moohan, J. M., Lindsay, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatozoa+selected+by+a+discontinuous+Percoll+density+gradient+exhibit+better+motion+characteristics,+more+hyperactivation,+and+longer+survival+than+direct+swim-up.">Spermatozoa selected by a discontinuous Percoll density gradient exhibit better motion characteristics, more hyperactivation, and longer survival than direct swim-up.</a> Fertility and Sterility. 64 (1), 160-165 (1995).</li><li>Paulson, J. D., Polakoski, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glass+wool+column+procedure+for+removing+extraneous+material+from+human+ejaculate.">A glass wool column procedure for removing extraneous material from human ejaculate.</a> Fertility and Sterility. 28, 178-181 (1977).</li><li>Ahammad, M. U., Chiaki, N., Tatemoto, H., Kawamoto, Y., Nakada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+the+swim-up+migration+sedimentation+technique+to+separate+viable+and+progressively+motile+fowl+spermatozoa.">Utilization of the swim-up migration sedimentation technique to separate viable and progressively motile fowl spermatozoa.</a> World's Poultry Science Association Proceedings. , (2010).</li><li>Lucena, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+motile+sperm+using+the+migration-sedimentation+technique+in+an+in+vitro+fertilization-embryo+transfer+programme.">Recovery of motile sperm using the migration-sedimentation technique in an in vitro fertilization-embryo transfer programme.</a> Human Reproduction. 4 (2), 163-165 (1989).</li><li>Henkel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+Processing+for+IVF.">Sperm Processing for IVF.</a> Clinical Embryology: A Practical Guide. , (2013).</li><li>Sherman, J., Paulson, D., Liu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+glass+wool+filtration+on+ultrastructure+of+human+spermatozoa.">Effect of glass wool filtration on ultrastructure of human spermatozoa.</a> Fertility and Sterility. 36, 643-647 (1981).</li><li>Freund, M., Carol, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+haemocytometer+counts+of+sperm+concentration+in+human+semen.">Factors affecting haemocytometer counts of sperm concentration in human semen.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 8, 149-155 (1964).</li><li>Bakst, M. R., Wishart, G. J., Brillard, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oviducal+sperm+selection,+transport+and+storage+in+poultry.">Oviducal sperm selection, transport and storage in poultry.</a> Poultry Science Review. 5, 117-143 (1994).</li><li>Ahammad, M. U., Okamoto, S., Kawamoto, Y., Nakada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+regular+fluid+secretion+from+the+uterus+of+laying+hens+on+the+longevity+and+fertilization+ability+of+fowl+sperm+in+the+oviduct.">The effects of regular fluid secretion from the uterus of laying hens on the longevity and fertilization ability of fowl sperm in the oviduct.</a> Poultry Science Journal. 1 (1), 13-22 (2013).</li><li>Ahammad, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturational+changes+in+the+survivability+and+fertility+of+fowl+sperm+during+their+passage+through+the+male+reproductive+tract.">Maturational changes in the survivability and fertility of fowl sperm during their passage through the male reproductive tract.</a> Animal Reproduction Science. 128 (1-4), 129-136 (2011).</li><li>Choi, K. H., Emery, D. A., Straub, D. E., Lee, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Percoll+process+can+improve+semen+quality+and+fertility+in+turkey+breeders.">Percoll process can improve semen quality and fertility in turkey breeders.</a> Asian-Australasian Journal of Animal Sciences. 12 (5), 702-707 (1999).</li><li>Chen, M. J., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+two+density+gradient+preparations+for+sperm+separation+for+medically+assisted+conception.">Comparative evaluation of two density gradient preparations for sperm separation for medically assisted conception.</a> Human Reproduction. 14 (3), 759-764 (1999).</li></ol>

Fertilitet ikke kun bestemmer rentabiliteten af animalsk produktion men også fungerer som et middel til naturlig udvælgelse af arter for eksistens. Den ultimative funktion af en sædcelle er at befrugte et æg. Oviduct af en kvinde vælger kun de stærkeste sæd for at sikre befrugtning af ægcellen23,24. In vitro undersøgelser har også afsløret en tæt sammenhæng mellem kvalitativ sperm træk og befrugtning succes4,</s...

I hvirveldyr gennemgå mandlige kønsceller intens selektivt pres; reproduktiv fitness af en mand er derfor afgørende for at opnå succesfulde befrugtning. Hanner af enhver given vertebrater skal være i stand til at producere sædceller i store mængder og af tilstrækkelig kvalitet for at opfylde behovene hos befrugtning. Sædceller, at have både en sperm hoved og en fimrehår, er de mest polariserede celler i kroppen. De er også meget heterogene i sædkvalitet (levende og døde, morfologisk normale og unormale og immobile, lav mobile og høj mobile), som er åbenbaret gennem den brede variation i reproduktiv effektivitet af hannerne. Jo større andel af høj kvalitet sædceller, færre antallet af parringer kræves for at med held befrugte ægget. Men for at opnå frugtbarhed, morfologisk normale sædceller stole på fremdrivningseffektiviteten styrker genereret af deres flageller at nå stedet for befrugtning samt at trænge igennem zona pellucida1 (ZP; for pattedyr) eller indre perivitelline Layer2 (IPVL, fugle og krybdyr) af ægget efter naturlig parring eller kunstig befrugtning (AI). Bestemmelse af sæd kvalitet er nødvendigt til brug i assisteret reproduktionsteknologi3 (kunst) og udvalg af ynglende hanner skal anvendes i AI programmer4. På den anden side er succes af kunst udelukkende afhængig af den præcise vurdering af sædkvalitet. En række af laboratorieundersøgelser er blevet udviklet for at bestemme de funktionelle egenskaber af sæd. De vigtigste parametre er sperm morfologi, levedygtighed, mobilitet, retsevne (aviær sæd ikke kræver retsevne5), acrosome reaktion (AR; exocytose og frigivelse af et proteolytisk enzym fra acrosome af sperm hoved), sperm penetration af ZP eller IPVL og befrugtning6,7,8,9,10,11. Foranstaltninger af fertilitet alene giver ikke en nøjagtig vurdering af gødskning evne til en sæd befolkning11. Foranstaltninger af de flere begivenheder, der førte til befrugtning af æg giver mulighed for en passende repræsentation af udførelsen af individuelle spermatocytes7.
Den metode, udviklet til måling af sperm funktion er primært artsspecifikke. For eksempel i aviær sperm er levedygtighed, mobilitet og penetration af IPVL de mest almindelige parametre bruges til at vurdere sæd kvalitet8,11,12. Antallet af levende sædceller i sædvæsken spiller en afgørende rolle for overlevelse af sædceller, fordi tilstedeværelsen af et stort antal døde sædceller i sædvæsken påvirker kvaliteten af sperm. Dette øger produktion af reaktive ilt arter i sæden og forårsager oxidative skader på levende sædceller13. Sperm mobilitet, kapacitet til flagellaternes bevægelse af aviær sæd mod modstand ved kropstemperatur, er kendt for at spille en direkte rolle i at bringe om befrugtning8. Det er veletableret, at mobilitet er positivt korreleret med frugtbarhed og er derfor en primær faktor for frugtbarhed8. En mobil sæd skal dog også have mulighed for at gennemgå en AR og trænge IPVL11. IPVL penetration assays tage højde for hver sædceller, der deltager i processen med befrugtning11.
I anvendelsen af kunst behandles ejakulere normalt med henblik på at maksimere koncentrationen af sædceller af høj kvalitet og minimere koncentrationen af sædceller, lav kvalitet. Efter opsamlingen af sæden, kan andelen af høj kvalitet sædceller blive beriget gennem sperm adskillelse procedurer almindeligt anvendt i praksis både industri og forskning. Mange af disse procedurer er blevet udviklet, alle med respektive fordele og begrænsninger, men alle udnytte det heterogene karakter af sæd til at indsamle kun sæd med højt gødskning evne. Disse procedurer omfatter sæd overførselsmetoder, overholdelse af kolonne filtrering og tæthed gradient centrifugering (DGC)14,15,16,17,18,19 , 20. blandt de tilgængelige teknikker, DGC har vist sig for at være meget enkel, repeterbare, omkostningseffektive og effektive i isolere den maksimale mængde af høj kvalitet sæd til brug ved kunst med mål af maksimering chance for befrugtning14 , 15. Derudover DGC er ikke skadelig for sperm cellemembran. Derimod sperm overflytningsmetoder indsamler kun gradvis mobile sperm18,19, men mængden af sæd opsamlet er meget lav, hvilket gør det ineffektivt i at indsamle store mængder sperm18, 20. overholdelse af kolonne filtrering er meget effektiv i filtrering meget mobile sæd fra sæd17; men det har tendens til at være skadelig for sperm membraner20,21.
I DGC teknik er de mest almindeligt anvendte substrat til at generere tæthed farveforløb Percoll, som består af kolloid silica partikler belagt med polyvinylpryrolidone. Percoll tæthed gradient centrifugering (PDGC) kan enten være kontinuerligt eller diskontinuerligt, men en diskontinuerlig gradient er mest brugt til højtydende isolering af stærkt mobile sperm13,16,20. I en diskontinuerlig gradient svæver lavere massefylde media over højere tæthed medier, at skabe et forløb, der øger i tæthed fra toppen til bunden af en konisk slange. Dette skaber grænser på grænsefladen mellem to medier af forskellig densitet. Effektiviteten af PDGC er afledt af to faktorer: 1) fremdrivningseffektiviteten mulighed for individuelle sædceller og 2) sædceller med høj strukturel integritet tendens til at have en øget tæthed. Sæd med højere mobilitet er bedre i stand til at krydse fra lavere massefylde medier og trænge ind i en højere densitet medier. Lavere mobilitet sæd er mere tilbøjelige til at blive fanget på grænsen lavet af grænsefladen mellem medier af forskellig densitet. Sædceller med høj strukturel integritet og mobilitet har tendens til at have en højere densitet end døde, unormal eller lav mobile sædceller. Når centrifugalkraften anvendes i PDGC, letter det bevægelse af sædceller med forskellige tætheder til deres respektive sted i farveforløbet.
I almen praksis, når PDGC er udført, den bløde pellet af sperm med høj fertilitet potentielle nederst i den koniske rør er indsamlet, og resten er kasseret. Men en underudnyttet fordel af denne teknik er dens evne til at adskille sædceller i flere grupper baseret på kvalitetsforskellene. Til forskningsformål, adskillelse af sperm af graden af kvalitet udnytter PDGC teknik giver mulighed for undersøgelse af sædkvaliteten som den vedrører fysiologisk, metabolomic og proteom forskelle. Her, tilstræber vi at detaljer, hvordan denne teknik kan bruges til at adskille sperm af kvaliteten, samt vise disse forskelle i kvalitet, ved hjælp af den tidligere etablerede eosin-nigrosin vitale farvning for levedygtighed, Accudenz assay for mobilitet, og sæd-IPVL interaktion assay for gennemslagskraft.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:824px;" width="825">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Accudenz</td>
			<td style="width:323px;">Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY, USA</td>
			<td style="width:119px;">AN7050</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Percoll&#160;</td>
			<td style="width:323px;">Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:119px;">P7828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Schiff&#8217;s reagent</td>
			<td style="width:323px;">Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:119px;">3952016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TES</td>
			<td style="width:323px;">Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:119px;">T1375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Eosin Y</td>
			<td style="width:323px;">Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:119px;">E4009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nigrosin</td>
			<td style="width:323px;">Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA</td>
			<td align="right" style="width:119px;">198285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ST 40R Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:323px;">Thermo Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td align="right" style="width:119px;">75004524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DU 530 Life Sciences UV/Vis Spectrophotometer</td>
			<td style="width:323px;">Beckman Coulter, Brea, CA, USA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>No catalogue is found</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Olympus IX 71 Inverted Fluorescence and Phase Contrast Microscope</td>
			<td style="width:323px;">Olympus America Inc., PA, USA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>No catalogue is found</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sperm collection of differential quality using density gradient centrifugation

I seksuel reproduktion, en mandlig gamet eller sædcelle sikringer med en kvindelig gamet at bringe om befrugtning. Men et stort antal sædceller med befrugtende evne skal interagere med en kvindelig gamet at sikre befrugtning. Som sådan, er gødskning evne til individuelle sædceller afgørende for vellykket reproduktion. Tæthed gradient centrifugering har været udnyttet i flere årtier som en reproducerbar, hurtig, effektiv og særdeles fleksibel metode til at indsamle kun høj kvalitet sæd anvendes i assisteret reproduktiv teknologi. De protokoller vi beskrevet heri fokusere på udnyttelse af den diskontinuerlige Percoll tæthed gradient centrifugering (PDGC) teknik til at isolere tre adskilte populationer af hane sperm af deres kvalitet. Vi var i stand til at indsamle lav-, mellem- og lang-seriøs sperm. Vi beskriver også reproducerbare protokoller, der indebærer afgørende frugtbarhed potentiale af sædceller ved at vurdere deres levedygtighed, mobilitet og gennemslagskraft. Samling af sperm af deres kvalitet ved hjælp af PDGC teknik ville være nyttigt at præcist og grundigt karakterisere sperm med differentieret frugtbarhed potentielle.

PDGC teknik resulterede i tydelig adskillelse af tre lag af sperm af graden af kvalitet på tværs af alle parametre. Sperm adskiller i en høj kvalitet lag under den højere tæthed løsning, et medium kvalitet lag mellem de højere og lavere massefylde løsning og en lav kvalitet lag over den lavere massefylde løsning. Disse forskelle i kvalitet er dokumenteret ved klare forskelle i levedygtighed (figur 4), mobilitet (figur 5)...

Watch this Scientific Journal Video about Sperm Collection of Differential Quality Using Density Gradient Centrifugation at JoVE.com

Sperm Collection of Differential Quality Using Density Gradient Centrifugation

I dette papir, vi sigter mod at beskrive tæthed gradient centrifugering teknik og dens anvendelse i sæd fysiologi forskning ydeevne.

Sperm samling af Differential kvalitet ved hjælp af tæthed Gradient centrifugering

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål inden for sædfysiologi, såsom de kemiske determinates af sædkvalitet. Den største fordel ved denne teknik er det evne til at adskille store mængder af prøve efter kvalitet, samt tilpasningsevne i forhold til alternative metoder. Selv om denne metode kan give indsigt i forskellene i sædkvalitet, kan det også anvendes på andre prøver såsom blandede celletyper eller subcellulære komponenter med forskellige tætheder.Til at begynde, lave to 3 milliliter Percoll fortyndinger i to separate rør. I et rent reagensglas fortyndes 1 ml sædprøve med 2 milliliter PBS. Rør den forsigtigt for at blande opløsningen.Tilsæt 3 milliliter af den lavere tæthed Percoll sollution til et sterilt konisk rør. Derefter pipetters forsigtigt 3 milliliter af percoll-opløsningen med højere tæthed under percollopløsningens lavere tæthed. Mens det koniske rør vippes i en vinkel på 45 grader, pipetteres 3 milliliter af den fortyndede sædprøve oven på Percoll-tæthedens gradient.Efter klargøring af et tomt rør centrifugeres begge rør ved 1500 Gs i 20 minutter. Sikre, at tre forskellige lag af sæd er dannet i karret efter centrifugering. Ved hjælp af en pipette indsamle de tre lag af sæd, begyndende med det øverste lag, efterfulgt af det midterste lag, og slutter med den hårde pellet i bunden af røret.Overfør hvert lag til et sterilt mikrocentrifugerør. Hver sædprøverne fortyndes med 1,5 milliliter PBS, og prøverne centrifugeres ved 1500 Gs i ti minutter. Endelig hældes supernatant og rekonstituere pellets med motilitet buffer.I denne protokol blev Percoll-tæthedsgradientcentrifugeringsteknikken eller PDGC brugt til at adskille en sædprøve i tre forskellige lag. Sædcellerne adskiller sig i et lag af høj kvalitet under opløsningen med højere tæthed, et medium kvalitetslag mellem de højere og lavere tæthedsopløsninger og et lag af lav kvalitet over den lavere tæthedsopløsning. Disse forskelle i sædkvalitet fremgår af forskelle i levedygtighed, mobilitet og gennemtrængelighed.Mens du forsøger denne procedure, er det vigtigt at huske, at prøver skal bringes til stuetemperatur. PDGC's succes afhænger af omhyggelig forberedelse af gradienten samt omhyggelig indsamling af de isolerede lag. Efter det er udvikling, denne teknik banede vejen for vores forskning inden for sædperdiomics at udforske bio markører for frugtbarhed i aviær arter.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Biology

Unit 1

Introduction to Separation Methods

SCIENTISTS IN ACTION

Harvesting Sperm and Artificial Insemination of Mice

Rodents of the genus Peromyscus (deer mice) are the most prevalent native North American mammals.  Peromyscus species are used in a wide range of research ...

DNA Extraction from 0.22 &mu;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

DNA Extraction from 0.22 ÃƒÅ½Ã‚Â¼M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

This method is used to extract high molecular weight genomic DNA from planktonic biomass concentrated on 0.22 &mu;M Sterivex filters that have been ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the IÃƒâ€šÃ‚Â·Cryo Kit

Mus Sperm Kryopræservering og Recovery bruger I · Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

Bestemmelse af protein-ligand interaktioner Brug Differential Scanning fluorimetri

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Isolering af Intakt Mitokondrier fra Skeletal Muscle ved differentialcentrifugering for høj opløsning respirometri Målinger

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Avian Semen Collection by Cloacal Massage and Isolation of DNA from Sperm

Aviær tyrestationer ved Cloacal Massage og isolering af DNA fra sæden

Collection of semen may be useful for a wide range of applications including studies involving sperm quality, sperm telomere dynamics, and epigenetics. ...

Fish Sperm Assessment Using Software and Cooling Devices

Fisk Sperm vurdering ved hjælp af Software og afkøling enheder

For gamete quality evaluation, there are innovative, rapid, and quantitative techniques that can provide useful data for aquaculture. Computerized systems ...

Field Identification of Matricaria chamomilla using a Portable qPCR System

Field Identification of Matricaria chamomilla using a Portable qPCR System

Feltidentifikation af Matricaria chamomilla ved hjælp af et bærbart qPCR-system

Quality control in botanical products begins with the raw material supply. Traditionally, botanical identification is performed through morphological ...