Name: sperm collection of differential quality using density gradient centrifugation
Uploaded: 2018-11-29T15:00:00
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Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université de Georgie.
1. laver à l’aide de Centrifugation traditionnel
<ol><li>Préparer la solution de tampon phosphate (PBS). Ajouter 8,0 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4 et 0,24 g de KH2PO4 à 800 mL d’eau distillée (dH2O). Ajuster le pH à 7,4 avec 0,1 N HCl et porter la solution à 1 L avec...

<ol>
	<li>Spargo, S. C., Hope, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+nomenclature+of+the+zona+pellucida+gene+family.">Evolution and nomenclature of the zona pellucida gene family.</a> Biology Reproduction. 68, 358-362 (2003).</li><li>Okamura, F., Nishiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+passage+of+spermatozoa+through+the+vitelline+membrane+in+the+domestic+fowl,+Gallus+gallus.">The passage of spermatozoa through the vitelline membrane in the domestic fowl, Gallus gallus.</a> Cell and Tissue Research. 188 (3), 497-508 (1978).</li><li>Henkel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+function+and+assisted+reproduction+technology.">Sperm function and assisted reproduction technology.</a> Reproductive Medicine and Biology. 4, 7-30 (2005).</li><li>Reddy, R. P., Bakst, M. R., Wishart, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+Insemination+of+broilers:+Economic+and+management+implications.">Artificial Insemination of broilers: Economic and management implications.</a> Proceedings of 1st International Symposium on Artificial Insemination of Poultry. Poultry Science Association. , 73-89 (1995).</li><li>Howarth, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Examination+for+Sperm+Capacitation+in+the+Fowl.">An Examination for Sperm Capacitation in the Fowl.</a> Biology of Reproduction. 3, 338-341 (1971).</li><li>Menkveld, R., Holleboom, C. A. G., Rhemrev, J. P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+and+significance+of+sperm+morphology.">Measurement and significance of sperm morphology.</a> Asian Journal of Andrology. 13, 59-68 (2011).</li><li>Kumaresan, A., Johannisson, A., Al-Essawe, E. M., Morrell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+viability,+reactive+oxygen+species,+and+DNA+fragmentation+index+combined+can+discriminate+between+above-+and+below-average+fertility+bulls.">Sperm viability, reactive oxygen species, and DNA fragmentation index combined can discriminate between above- and below-average fertility bulls.</a> Journal of Dairy Science. 100, 5824-5836 (2017).</li><li>Froman, D. P., McLean, D. 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U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acrosome+reaction+of+fowl+sperm:+Evidence+for+shedding+of+acrosomal+cap+in+intact+form+to+release+acrosomal+enzyme.">Acrosome reaction of fowl sperm: Evidence for shedding of acrosomal cap in intact form to release acrosomal enzyme.</a> Poultry Science. 92 (3), 798-803 (2013).</li><li>Ahammad, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturational+changes+in+motility,+acrosomal+proteolytic+activity,+and+penetrability+of+the+inner+perivitelline+layer+of+fowl+sperm,+during+their+passage+through+the+male+genital+tract.">Maturational changes in motility, acrosomal proteolytic activity, and penetrability of the inner perivitelline layer of fowl sperm, during their passage through the male genital tract.</a> Theriogenology. 76 (6), 1100-1109 (2011).</li><li>Chalah, T., Brillard, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+assessment+of+fowl+sperm+viability+by+eosin-nigrosin+and+dual+fluorescence.">Comparison of assessment of fowl sperm viability by eosin-nigrosin and dual fluorescence.</a> Theriogenology. 50 (3), 487-493 (1998).</li><li>Aitken, R. J., West, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+relationship+between+reactive+oxygen+species+production+and+leukocyte+infiltration+in+fractions+of+human+semen+separated+on+Percoll+gradients.">Analysis of the relationship between reactive oxygen species production and leukocyte infiltration in fractions of human semen separated on Percoll gradients.</a> International Journal of Andrology. 13, 433-451 (1990).</li><li>Mortimer, D., Mortimer, S. T., Carrell, D., Aston, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Density+Gradient+Separation+of+Sperm+for+Artificial+Insemination.">Density Gradient Separation of Sperm for Artificial Insemination.</a> Spermatogenesis. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols. , 927 (2013).</li><li>Qingling, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+semen+by+density+gradient+centrifugation+selects+spermatozoa+with+longer+telomeres+for+assisted+reproduction+techniques.">Processing of semen by density gradient centrifugation selects spermatozoa with longer telomeres for assisted reproduction techniques.</a> Reproductive BioMedicine Online. 31, 44-50 (2015).</li><li>Moohan, J. M., Lindsay, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatozoa+selected+by+a+discontinuous+Percoll+density+gradient+exhibit+better+motion+characteristics,+more+hyperactivation,+and+longer+survival+than+direct+swim-up.">Spermatozoa selected by a discontinuous Percoll density gradient exhibit better motion characteristics, more hyperactivation, and longer survival than direct swim-up.</a> Fertility and Sterility. 64 (1), 160-165 (1995).</li><li>Paulson, J. D., Polakoski, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glass+wool+column+procedure+for+removing+extraneous+material+from+human+ejaculate.">A glass wool column procedure for removing extraneous material from human ejaculate.</a> Fertility and Sterility. 28, 178-181 (1977).</li><li>Ahammad, M. U., Chiaki, N., Tatemoto, H., Kawamoto, Y., Nakada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+the+swim-up+migration+sedimentation+technique+to+separate+viable+and+progressively+motile+fowl+spermatozoa.">Utilization of the swim-up migration sedimentation technique to separate viable and progressively motile fowl spermatozoa.</a> World's Poultry Science Association Proceedings. , (2010).</li><li>Lucena, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+motile+sperm+using+the+migration-sedimentation+technique+in+an+in+vitro+fertilization-embryo+transfer+programme.">Recovery of motile sperm using the migration-sedimentation technique in an in vitro fertilization-embryo transfer programme.</a> Human Reproduction. 4 (2), 163-165 (1989).</li><li>Henkel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+Processing+for+IVF.">Sperm Processing for IVF.</a> Clinical Embryology: A Practical Guide. , (2013).</li><li>Sherman, J., Paulson, D., Liu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+glass+wool+filtration+on+ultrastructure+of+human+spermatozoa.">Effect of glass wool filtration on ultrastructure of human spermatozoa.</a> Fertility and Sterility. 36, 643-647 (1981).</li><li>Freund, M., Carol, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+haemocytometer+counts+of+sperm+concentration+in+human+semen.">Factors affecting haemocytometer counts of sperm concentration in human semen.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 8, 149-155 (1964).</li><li>Bakst, M. R., Wishart, G. J., Brillard, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oviducal+sperm+selection,+transport+and+storage+in+poultry.">Oviducal sperm selection, transport and storage in poultry.</a> Poultry Science Review. 5, 117-143 (1994).</li><li>Ahammad, M. U., Okamoto, S., Kawamoto, Y., Nakada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+regular+fluid+secretion+from+the+uterus+of+laying+hens+on+the+longevity+and+fertilization+ability+of+fowl+sperm+in+the+oviduct.">The effects of regular fluid secretion from the uterus of laying hens on the longevity and fertilization ability of fowl sperm in the oviduct.</a> Poultry Science Journal. 1 (1), 13-22 (2013).</li><li>Ahammad, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturational+changes+in+the+survivability+and+fertility+of+fowl+sperm+during+their+passage+through+the+male+reproductive+tract.">Maturational changes in the survivability and fertility of fowl sperm during their passage through the male reproductive tract.</a> Animal Reproduction Science. 128 (1-4), 129-136 (2011).</li><li>Choi, K. H., Emery, D. A., Straub, D. E., Lee, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Percoll+process+can+improve+semen+quality+and+fertility+in+turkey+breeders.">Percoll process can improve semen quality and fertility in turkey breeders.</a> Asian-Australasian Journal of Animal Sciences. 12 (5), 702-707 (1999).</li><li>Chen, M. J., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+two+density+gradient+preparations+for+sperm+separation+for+medically+assisted+conception.">Comparative evaluation of two density gradient preparations for sperm separation for medically assisted conception.</a> Human Reproduction. 14 (3), 759-764 (1999).</li></ol>

Fécondité non seulement détermine la rentabilité de la production animale, mais agit également comme un moyen de sélection naturelle des espèces pour l’existence. La fonction ultime d’un spermatozoïde doit féconder un ovule. L’oviducte de la femelle choisit seulement ces spermatozoïdes plus forts afin d’assurer la fécondation de l’ovule23,24. Des études in vitro ont révélé également une étroite corrélation entre les caractéri...

Chez les vertébrés, les gamètes mâles subissent une intense pression sélective ; reproduction remise en forme d’un mâle est donc essentiel pour la réalisation de fécondation réussie. Les hommes de toute espèce de vertébrés donnée doivent être en mesure de produire des spermatozoïdes en grande quantité et de qualité suffisante pour répondre aux besoins de fertilisation. Cellules du sperme, avoir une tête de sperme et d’un flagelle, sont des cellules plus polarisées dans le corps. Ils sont également très hétérogènes dans la qualité du sperme (vivant et mort, morphologiquement normal et anormal et immobile, low haut et mobile mobile), qui se révèle à travers la grande variation dans efficacité reproductive des mâles. Plus la proportion de spermatozoïdes de qualité, au moins le nombre d’accouplements pour avec succès de féconder l’ovule. Toutefois, pour atteindre la fertilité, des spermatozoïdes morphologiquement normaux comptent sur propulsion forces générées par leurs flagelles pour accéder au site de fertilisation ainsi quant à pénétrer la zone pellucide1 (ZP ; dans le cas des mammifères) ou intérieure périvitellin couche2 (IPVL ; dans le cas des oiseaux et reptiles) de l’ovule après l’accouplement naturel ou l’insémination artificielle (IA). Détermination de sperme qualité est nécessaire pour une utilisation dans les techniques de procréation assistée3 (ART) et des programmes de sélection des mâles reproducteurs pour être utilisé en intelligence artificielle4. En revanche, le succès de l’ART se fonde uniquement sur l’évaluation précise de la qualité du sperme. Un certain nombre de tests de laboratoire ont été développé afin de déterminer les caractéristiques fonctionnelles du sperme. Les paramètres les plus importants sont la morphologie des spermatozoïdes, de viabilité, de mobilité, de capacitation (sperme aviaire ne nécessite pas de capacitation des5), réaction de l’acrosome (AR ; l’exocytose et libération d’une enzyme protéolytique de l’acrosome, de la tête du spermatozoïde), Sodo, sperm pénétration de la ZP ou IPVL et fertilisation6,7,8,9,10,11. Mesures de fertilité seule ne fournissent pas une évaluation précise de la capacité fécondante d’un sperme population11. Les mesures des plusieurs événements menant à la fécondation d’un ovule permettre une représentation appropriée de la performance des spermatocytes individuel7.
La méthodologie développée pour mesurer la fonction spermatique est essentiellement propres à chaque espèce. Par exemple, dans le sperme aviaire, viabilité, la mobilité et la pénétration de IPVL sont les paramètres couramment utilisés pour évaluer la qualité de sperme pour8,11,12. Le nombre de spermatozoïdes vivants dans le sperme joue un rôle crucial pour la survie des spermatozoïdes, car la présence d’un grand nombre de spermatozoïdes morts dans le sperme affecte la qualité du sperme. Cela augmente la production d’espèces réactives de l’oxygène dans le sperme et provoque des dommages oxydatifs aux spermatozoïdes vivants13. Mobilité des spermatozoïdes, la capacité de mouvement flagellaire du sperme aviaire contre la résistance à la température corporelle, est connue pour jouer un rôle direct dans fertilisation8. Il est bien établi que la mobilité est en corrélation positive avec la fertilité et est donc déterminant de fertilité8. Toutefois, un spermatozoïde mobile doit avoir aussi la capacité de subir un AR et de pénétrer l' IPVL11. Essais de pénétration IPVL prennent en compte pour chaque spermatozoïde qui participe dans le processus de fécondation11.
Dans l’application de l’ART, l’éjaculat est généralement traitée afin de maximiser la concentration du sperme de qualité et de réduire la concentration de spermatozoïdes de mauvaise qualité. Après le prélèvement du sperme, la proportion de spermatozoïdes de qualité peut être enrichie par des procédures de séparation de sperme couramment utilisés dans les pratiques de l’industrie et la recherche. Beaucoup de ces procédures ont été développées, avec des avantages respectifs et les limites, mais tous utilisent la nature hétérogène du sperme pour recueillir uniquement le sperme avec haute capacité fécondante. Ces procédures incluent des méthodes de migration des spermatozoïdes, filtration de colonne de l’adhérence et densité centrifugation en gradient (DGC)14,15,16,17,18,19 , 20. parmi les techniques disponibles, DGC s’est avéré pour être très simple, reproductible, rentable et efficace pour isoler le montant maximal du sperme de haute qualité pour une utilisation dans l’ART dans le but de maximiser les chances de fécondation14 , 15. en outre, la DGC n’est pas préjudiciable à la membrane de la cellule de sperme. En revanche, recueillent des méthodes de migration de sperme sperme seulement progressivement mobile18,19, mais la quantité de sperme recueilli est très faible, rendant inefficace dans la collecte de grandes quantités de sperme18, 20. adhérence colonne filtration est très efficace pour le filtrage très mobiles spermatozoïdes du sperme17; Toutefois, elle tend à nuire aux spermatozoïdes membranes20,21.
Dans la technique de la Guilde canadienne des réalisateurs, le substrat le plus couramment utilisé pour générer le gradient de densité est Percoll, qui est composé de particules de silice colloïdale recouvert de polyvinylpryrolidone. Centrifugation en gradient de densité Percoll (PDGC) peut être continu ou discontinu, mais un gradient discontinu est plus couramment utilisé pour l’isolement de rendement élevé de spermatozoïdes mobiles13,16,20. Dans un gradient discontinu, média de densité inférieure plane au-dessus de média de densité supérieure, créant un gradient qui augmente la densité du haut vers le bas d’un tube conique. Cela crée des limites à l’interface entre les deux milieux de densité différente. L’efficacité de PDGC est dérivée de deux facteurs : 1) la capacité propulsive de spermatozoïdes individuels et 2) la tendance des spermatozoïdes avec haute intégrité structurale a une densité accrue. Sperme avec une plus grande mobilité est mieux capables de traverser des médias de densité plus faible et de pénétrer dans un média de densité plus élevé. Sperme de mobilité plus faible est plus susceptibles d’être coincé à la limite créée par l’interface entre les médias de densité différente. Spermatozoïdes à haute intégrité structurale et de la mobilité ont tendance à avoir une densité plus élevée que les spermatozoïdes mobiles morts, anormales ou faibles. Lorsque la force centrifuge est appliquée en PDGC, cela facilite le déplacement des spermatozoïdes avec des densités différentes à leur place respective dans le gradient.
En médecine générale, après PDGC, le pellet mou de sperme avec une fécondité élevée potentielle au fond du tube conique est recueillie, et le reste est ignoré. Cependant, un avantage sous-utilisées de cette technique est sa capacité à séparer les cellules spermatiques en plusieurs groupes fondés sur les différences de qualité. À des fins de recherche, séparation des spermatozoïdes par degré de qualité utilisant la technique PDGC permet d’étudier de la qualité du sperme en ce qui concerne les différences physiologiques, de métabolomique et protéomique. Ici, nous visons à détailler comment cette technique peut être utilisée pour séparer les spermatozoïdes de qualité, mais aussi de montrer ces différences de qualité, à l’aide de l’éosine-nigrosine préétablie coloration vitale pour la viabilité, Accudenz dosage pour la mobilité et sperme-IPVL analyse d’interaction pour la pénétration.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:824px;" width="825">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Accudenz</td>
			<td style="width:323px;">Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY, USA</td>
			<td style="width:119px;">AN7050</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Percoll&#160;</td>
			<td style="width:323px;">Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:119px;">P7828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Schiff&#8217;s reagent</td>
			<td style="width:323px;">Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:119px;">3952016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TES</td>
			<td style="width:323px;">Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:119px;">T1375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Eosin Y</td>
			<td style="width:323px;">Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:119px;">E4009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nigrosin</td>
			<td style="width:323px;">Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA</td>
			<td align="right" style="width:119px;">198285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ST 40R Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:323px;">Thermo Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td align="right" style="width:119px;">75004524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DU 530 Life Sciences UV/Vis Spectrophotometer</td>
			<td style="width:323px;">Beckman Coulter, Brea, CA, USA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>No catalogue is found</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Olympus IX 71 Inverted Fluorescence and Phase Contrast Microscope</td>
			<td style="width:323px;">Olympus America Inc., PA, USA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>No catalogue is found</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sperm collection of differential quality using density gradient centrifugation

Dans la reproduction sexuée, un gamète mâle ou spermatozoïde fusionne avec un gamète femelle pour parvenir à la fécondation. Toutefois, un grand nombre de spermatozoïdes avec capacité de fertilisation est requises pour interagir avec un gamète femelle pour assurer la fécondation. Par conséquent, la capacité fécondante des spermatozoïdes individuels est critique pour la reproduction réussie. Centrifugation en gradient de densité a été utilisée pendant plusieurs décennies comme une méthode reproductible, rapide, efficace et extrêmement adaptable pour recueillir seulement qualité sperme devant servir à la reproduction assistée. Les protocoles que nous décrit ci-après portent sur l’utilisation de la technique de centrifugation en gradient (PDGC) densité de Percoll discontinue pour isoler les trois populations distinctes de sperme du coq par leur qualité. Nous avons pu recueillir, faible, moyen et haute qualité sperme. Nous décrivons également les protocoles reproductibles qui entraînent déterminant potentiel de fertilité du sperme en évaluant leur viabilité, la mobilité et la pénétrabilité. Collection de spermatozoïdes par leur qualité à l’aide de la technique de PDGC serait utile à avec précision et caractériser complètement sperme avec différentielle fertilité potentielle.

La technique PDGC a été nette séparation de trois couches de sperme par degré de qualité à travers tous les paramètres. Spermatozoïdes se sépare en une couche de qualité inférieure à la solution de densité plus élevée, une couche de qualité moyenne entre le supérieur et solution de densité plus faible et une couche de faible qualité au-dessus de la solution de densité plus faible. Ces différences de qualité sont mis en évidence de différences évidentes dans la via...

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Sperm Collection of Differential Quality Using Density Gradient Centrifugation

Dans cet article, nous visons à décrire les performances de la technique de centrifugation en gradient de densité et de son application dans la recherche de la physiologie de sperme.

Prélèvement du sperme de qualité différentielle en utilisant la Centrifugation en Gradient de densité

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la physiologie du sperme, telles que les déterminats chimiques de la qualité du sperme. Le principal avantage de cette technique est sa capacité à séparer de grandes quantités d’échantillon par qualité, ainsi que l’adaptabilité par rapport aux méthodes alternatives. Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu des différences dans la qualité du sperme, elle peut également être appliquée à d’autres échantillons tels que les types de cellules mixtes ou les composants subcellulaires avec des densités différentes.Pour commencer, faire deux dilutions Percoll de 3 millilitres dans deux tubes séparés. Dans un tube à essai propre, diluer 1 millilitre d’échantillon de sperme avec 2 millilitres de PBS. Pipe doucement pour mélanger la solution.Ajouter 3 millilitres de la sollution percoll de basse densité à un tube conique stérile. Ensuite, pipette soigneusement 3 millilitres de la solution Percoll de densité plus élevée sous la solution Percoll de faible densité. Tout en inclinant le tube conique à un angle de 45 degrés, pipette 3 millilitres de l’échantillon de sperme dilué sur le dessus du gradient de densité Percoll.Après avoir préparé un tube blanc, centrifuger les deux tubes à 1500 Gs pendant 20 minutes. Assurez-vous que trois couches distinctes de sperme se sont formées dans la baignoire après centrifugation. À l’aide d’une pipette recueillir les trois couches de sperme, en commençant par la couche supérieure, suivie par la couche moyenne, et se terminant par la pastille dure au fond du tube.Transférer chacune des couches dans un tube stérile de micro centrifugeuse. Diluer chacun des échantillons de sperme avec 1,5 millilitres de PBS et centrifuger les échantillons à 1500 Gs pendant dix minutes. Enfin, versez le supernatant et reconstituez les granulés avec tampon de motilité.Dans ce protocole, la technique de centrifugation du gradient de densité Percoll, ou PDGC, a été utilisée pour séparer un échantillon de sperme en trois couches distinctes. Le sperme se sépare en une couche de haute qualité au-dessous de la solution de densité plus élevée, une couche de qualité moyenne entre les solutions de densité plus élevée et inférieure, et une couche de faible qualité au-dessus de la solution de basse densité. Ces différences dans la qualité du sperme sont démontrées par des différences dans la viabilité, la mobilité et la pénétrabilité.Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler que les échantillons doivent être amenés à température ambiante. Le succès de PDGC dépend d’une préparation minutieuse du gradient ainsi que d’une collecte minutieuse des couches isolées. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à nos recherches dans le domaine de la perdiomics de sperme pour explorer les marqueurs biologiques de la fertilité chez les espèces aviaires.

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Unit 1

Introduction to Separation Methods

SCIENTISTS IN ACTION

Harvesting Sperm and Artificial Insemination of Mice

Le sperme de récolte et l&#39;insémination artificielle des souris

Rodents of the genus Peromyscus (deer mice) are the most prevalent native North American mammals.  Peromyscus species are used in a wide range of research ...

Recherche

Biologie

DNA Extraction from 0.22 &mu;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

DNA Extraction from 0.22 ÃƒÅ½Ã‚Â¼M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

Extraction de l&#39;ADN à partir de 0,22 Filtres Sterivex uM et le césium Centrifugation gradient de chlorure de densité

This method is used to extract high molecular weight genomic DNA from planktonic biomass concentrated on 0.22 &mu;M Sterivex filters that have been ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

In vivo d&#39;embryons de drosophile Centrifugation

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates

Préparation de la qualité de pyrophosphates inositol

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the IÃƒâ€šÃ‚Â·Cryo Kit

Cryoconservation du sperme de souris et de récupération utilisant les I · Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

Détermination des interactions protéine-ligand à l&#39;aide différentielle à balayage Fluorimétrie

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Isolement des mitochondries Intact du muscle squelettique par centrifugation différentielle pour respirométriques mesures haute résolution

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Avian Semen Collection by Cloacal Massage and Isolation of DNA from Sperm

Collecte de sperme aviaire Massage cloacale et l’isolement de l’ADN des spermatozoïdes par

Collection of semen may be useful for a wide range of applications including studies involving sperm quality, sperm telomere dynamics, and epigenetics. ...

Fish Sperm Assessment Using Software and Cooling Devices

Évaluation de sperme de poissons à l’aide de logiciels et de dispositifs de refroidissement

For gamete quality evaluation, there are innovative, rapid, and quantitative techniques that can provide useful data for aquaculture. Computerized systems ...

Field Identification of Matricaria chamomilla using a Portable qPCR System

Field Identification of Matricaria chamomilla using a Portable qPCR System

Identification sur le terrain de Matricaria chamomilla à l’aide d’un système qPCR portable

Quality control in botanical products begins with the raw material supply. Traditionally, botanical identification is performed through morphological ...