Name: sperm collection of differential quality using density gradient centrifugation
Uploaded: 2018-11-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sperm Collection of Differential Quality Using Density Gradient Centrifugation at JoVE.com

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של האוניברסיטה של גאורגיה.
1. שטיפה באמצעות צנטריפוגה מסורתי
<ol><li>להכין את בופר פוספט (PBS). הוסף 8.0 גר' NaCl, 0.2 גרם אשלגן כלורי, 1.44 g של Na-2-HPO-4 ו- g 0.242פו ח'4 800 מ ל מים מזוקקים (dH...

<ol>
	<li>Spargo, S. C., Hope, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+nomenclature+of+the+zona+pellucida+gene+family.">Evolution and nomenclature of the zona pellucida gene family.</a> Biology Reproduction. 68, 358-362 (2003).</li><li>Okamura, F., Nishiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+passage+of+spermatozoa+through+the+vitelline+membrane+in+the+domestic+fowl,+Gallus+gallus.">The passage of spermatozoa through the vitelline membrane in the domestic fowl, Gallus gallus.</a> Cell and Tissue Research. 188 (3), 497-508 (1978).</li><li>Henkel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+function+and+assisted+reproduction+technology.">Sperm function and assisted reproduction technology.</a> Reproductive Medicine and Biology. 4, 7-30 (2005).</li><li>Reddy, R. P., Bakst, M. R., Wishart, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+Insemination+of+broilers:+Economic+and+management+implications.">Artificial Insemination of broilers: Economic and management implications.</a> Proceedings of 1st International Symposium on Artificial Insemination of Poultry. Poultry Science Association. , 73-89 (1995).</li><li>Howarth, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Examination+for+Sperm+Capacitation+in+the+Fowl.">An Examination for Sperm Capacitation in the Fowl.</a> Biology of Reproduction. 3, 338-341 (1971).</li><li>Menkveld, R., Holleboom, C. A. G., Rhemrev, J. P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+and+significance+of+sperm+morphology.">Measurement and significance of sperm morphology.</a> Asian Journal of Andrology. 13, 59-68 (2011).</li><li>Kumaresan, A., Johannisson, A., Al-Essawe, E. M., Morrell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+viability,+reactive+oxygen+species,+and+DNA+fragmentation+index+combined+can+discriminate+between+above-+and+below-average+fertility+bulls.">Sperm viability, reactive oxygen species, and DNA fragmentation index combined can discriminate between above- and below-average fertility bulls.</a> Journal of Dairy Science. 100, 5824-5836 (2017).</li><li>Froman, D. P., McLean, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Objective+measurement+of+sperm+motility+based+upon+sperm+penetration+of+Accudenz.">Objective measurement of sperm motility based upon sperm penetration of Accudenz.</a> Poultry Science. 75, 776-784 (1996).</li><li>Zaneveld, L. J., De Jonge, C. J., Anderson, R. A., Mack, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+sperm+capacitation+and+the+acrosome+reaction.">Human sperm capacitation and the acrosome reaction.</a> Human Reproduction. 6 (9), 1265-1274 (1991).</li><li>Ahammad, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acrosome+reaction+of+fowl+sperm:+Evidence+for+shedding+of+acrosomal+cap+in+intact+form+to+release+acrosomal+enzyme.">Acrosome reaction of fowl sperm: Evidence for shedding of acrosomal cap in intact form to release acrosomal enzyme.</a> Poultry Science. 92 (3), 798-803 (2013).</li><li>Ahammad, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturational+changes+in+motility,+acrosomal+proteolytic+activity,+and+penetrability+of+the+inner+perivitelline+layer+of+fowl+sperm,+during+their+passage+through+the+male+genital+tract.">Maturational changes in motility, acrosomal proteolytic activity, and penetrability of the inner perivitelline layer of fowl sperm, during their passage through the male genital tract.</a> Theriogenology. 76 (6), 1100-1109 (2011).</li><li>Chalah, T., Brillard, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+assessment+of+fowl+sperm+viability+by+eosin-nigrosin+and+dual+fluorescence.">Comparison of assessment of fowl sperm viability by eosin-nigrosin and dual fluorescence.</a> Theriogenology. 50 (3), 487-493 (1998).</li><li>Aitken, R. J., West, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+relationship+between+reactive+oxygen+species+production+and+leukocyte+infiltration+in+fractions+of+human+semen+separated+on+Percoll+gradients.">Analysis of the relationship between reactive oxygen species production and leukocyte infiltration in fractions of human semen separated on Percoll gradients.</a> International Journal of Andrology. 13, 433-451 (1990).</li><li>Mortimer, D., Mortimer, S. T., Carrell, D., Aston, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Density+Gradient+Separation+of+Sperm+for+Artificial+Insemination.">Density Gradient Separation of Sperm for Artificial Insemination.</a> Spermatogenesis. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols. , 927 (2013).</li><li>Qingling, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+semen+by+density+gradient+centrifugation+selects+spermatozoa+with+longer+telomeres+for+assisted+reproduction+techniques.">Processing of semen by density gradient centrifugation selects spermatozoa with longer telomeres for assisted reproduction techniques.</a> Reproductive BioMedicine Online. 31, 44-50 (2015).</li><li>Moohan, J. M., Lindsay, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatozoa+selected+by+a+discontinuous+Percoll+density+gradient+exhibit+better+motion+characteristics,+more+hyperactivation,+and+longer+survival+than+direct+swim-up.">Spermatozoa selected by a discontinuous Percoll density gradient exhibit better motion characteristics, more hyperactivation, and longer survival than direct swim-up.</a> Fertility and Sterility. 64 (1), 160-165 (1995).</li><li>Paulson, J. D., Polakoski, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glass+wool+column+procedure+for+removing+extraneous+material+from+human+ejaculate.">A glass wool column procedure for removing extraneous material from human ejaculate.</a> Fertility and Sterility. 28, 178-181 (1977).</li><li>Ahammad, M. U., Chiaki, N., Tatemoto, H., Kawamoto, Y., Nakada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+the+swim-up+migration+sedimentation+technique+to+separate+viable+and+progressively+motile+fowl+spermatozoa.">Utilization of the swim-up migration sedimentation technique to separate viable and progressively motile fowl spermatozoa.</a> World's Poultry Science Association Proceedings. , (2010).</li><li>Lucena, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+motile+sperm+using+the+migration-sedimentation+technique+in+an+in+vitro+fertilization-embryo+transfer+programme.">Recovery of motile sperm using the migration-sedimentation technique in an in vitro fertilization-embryo transfer programme.</a> Human Reproduction. 4 (2), 163-165 (1989).</li><li>Henkel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+Processing+for+IVF.">Sperm Processing for IVF.</a> Clinical Embryology: A Practical Guide. , (2013).</li><li>Sherman, J., Paulson, D., Liu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+glass+wool+filtration+on+ultrastructure+of+human+spermatozoa.">Effect of glass wool filtration on ultrastructure of human spermatozoa.</a> Fertility and Sterility. 36, 643-647 (1981).</li><li>Freund, M., Carol, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+haemocytometer+counts+of+sperm+concentration+in+human+semen.">Factors affecting haemocytometer counts of sperm concentration in human semen.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 8, 149-155 (1964).</li><li>Bakst, M. R., Wishart, G. J., Brillard, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oviducal+sperm+selection,+transport+and+storage+in+poultry.">Oviducal sperm selection, transport and storage in poultry.</a> Poultry Science Review. 5, 117-143 (1994).</li><li>Ahammad, M. U., Okamoto, S., Kawamoto, Y., Nakada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+regular+fluid+secretion+from+the+uterus+of+laying+hens+on+the+longevity+and+fertilization+ability+of+fowl+sperm+in+the+oviduct.">The effects of regular fluid secretion from the uterus of laying hens on the longevity and fertilization ability of fowl sperm in the oviduct.</a> Poultry Science Journal. 1 (1), 13-22 (2013).</li><li>Ahammad, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturational+changes+in+the+survivability+and+fertility+of+fowl+sperm+during+their+passage+through+the+male+reproductive+tract.">Maturational changes in the survivability and fertility of fowl sperm during their passage through the male reproductive tract.</a> Animal Reproduction Science. 128 (1-4), 129-136 (2011).</li><li>Choi, K. H., Emery, D. A., Straub, D. E., Lee, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Percoll+process+can+improve+semen+quality+and+fertility+in+turkey+breeders.">Percoll process can improve semen quality and fertility in turkey breeders.</a> Asian-Australasian Journal of Animal Sciences. 12 (5), 702-707 (1999).</li><li>Chen, M. J., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+two+density+gradient+preparations+for+sperm+separation+for+medically+assisted+conception.">Comparative evaluation of two density gradient preparations for sperm separation for medically assisted conception.</a> Human Reproduction. 14 (3), 759-764 (1999).</li></ol>

פוריות לא רק קובעת את הרווחיות של ייצור בעלי החיים, אלא פועלת גם כאמצעי הברירה הטבעית של מינים לקיום. הפונקציה האולטימטיבי של תא זרע היא להפרות את הביצית. Oviduct של הנקבה בוחרת רק את הזרע בכושר כדי להבטיח הפריה של ביצית23,24. מחקרים במבחנה נחשפו גם מתאם קרוב ?...

גולגולת, זכר גמטות עוברים אינטנסיבי הלחץ הסלקטיבי; לכן כושר הרבייה של הזכר הוא מרכזי להשגת הפריה מוצלחת. הזכרים של כל מין חוליות נתון חייב להיות מסוגל לייצר תאי זרע בכמויות גדולות ושל באיכות טובה דיה על מנת לענות על הצרכים של הפריה. תאי זרע, יש ראש הזרע והן של שוטון, הם התאים מקוטב ביותר בגוף. הם גם מאוד הטרוגנית באיכות הזרע (נמוך בשידור חי ולא מת, מורפולוגית נורמלי חריג ואני משותק, ניידים וגבוה ניידים), אשר מתגלה וריאציה רחב יעילות הרבייה של הזכרים. גדול יותר חלקם של זרע באיכות גבוהה, פחות המספר של matings נדרשים בהצלחה להפרות את הביצית. עם זאת, כדי להשיג פוריות, תאי זרע נורמלי מורפולוגית להסתמך על כוחות-חליפת שנוצר על ידי שוטון שלהם כדי להגיע לאתר של הפריה גם כדי לחדור את zona pellucida1 (מסוג ZP; במקרה של יונקים) או perivitelline הפנימי שכבה2 (IPVL; במקרה של ציפורים וזוחלים) של הביצית לאחר ההזדווגות טבעי או הזרעה מלאכותית (AI). קביעת זרע באיכות הדרושים לשימוש בטכנולוגיות הרבייה בסיוע3 (אמנות), בחירה של הרבייה הזכרים כדי לשמש AI תוכניות4. מצד שני, ההצלחה של אמנות מתבססת אך ורק הערכה מדויקת של איכות הזרע. מספר בדיקות מעבדה פותחו כדי לקבוע את המאפיינים הפונקציונליים של זרע. הפרמטרים החשובים ביותר הם זרע-מורפולוגיה, הכדאיות, ניידות, capacitation (זרע העופות אינן דורשות capacitation5), תגובה acrosome (AR; אקסוציטוזה, שחרור של אנזים הפרוטאוליטי acrosome הראש זרע), זרע חדירה מסוג ZP או IPVL, הפריה6,7,8,9,10,11. מדדי פריון לבד אינם מספקים הערכה מדויקת של היכולת המפרה של האוכלוסייה זרע11. מדדים של מספר האירועים שהובילו הפריה של ביצית לאפשר ייצוג הולם של הביצועים של הפרט spermatocytes7.
המתודולוגיה פיתח למדידת תפקוד הזרע הוא בעיקר ספציפית. לדוגמה, זרע העופות, הכדאיות, ניידות, חדירה של IPVL הם הפרמטרים הנפוץ ביותר להערכת זרע באיכות8,11,12. המספר של זרע חי ב השפיכה ממלא תפקיד מכריע להישרדותה של הזרע כי הנוכחות של מספר גדול של הזרע מת ב הזרע משפיע על איכות הזרע. זה מגביר את הייצור של מינים חמצן תגובתי ב הזרע וגורם נזק חמצוני זרע חיים13. זרע ניידות, יכולת השוטוניים תנועת הזרע העופות נגד התנגדות בטמפרטורה של הגוף, ידוע כדי לשחק תפקיד ישיר מביא על הפריה8. היא מבוססת היטב כי ניידות בקורלציה חיובית עם פוריות, ולכן, דטרמיננטה העיקרי של פוריות8. עם זאת, זרע נייד צריך גם את היכולת לעבור על AR לחדור IPVL11. מבחני חדירה IPVL לקחת בחשבון עבור כל זרע המשתתפת בתהליך ההפריה11.
ביישום של אמנות, לפלוט מעובד בדרך כלל על מנת למקסם את הריכוז של זרע באיכות גבוהה, למזער את הריכוז של זרע באיכות נמוכה. לאחר איסוף זרע, יכול להעשיר את הפרופורציה של זרע באיכות גבוהה באמצעות הליכים הפרדת זרע נפוץ בשיטות המחקר והתעשייה. רבים של הליכים אלה פותחו, כל עם הטבות בהתאמה, מגבלות, אך כל לנצל את הטבע הטרוגנית של הזרע כדי לאסוף רק את הזרע עם יכולת גבוהה המפרה. הליכים אלה כוללים שיטות ההעברה זרע, סינון העמודה הדבקות, צפיפות הדרגתיות צנטריפוגה (DGC)14,15,16,17,18,19 , 20. בין הטכניקות הזמינות, DGC נמצאה להיות מאוד פשוטים, הדיר, חסכונית ויעילה לבודד את הסכום המקסימלי של זרע באיכות גבוהה לשימוש באמנות במטרה למקסם את הסיכוי הפריה14 , 15. בנוסף, DGC אינו מזיק קרום תא הזרע. לעומת זאת, שיטות ההעברה זרע לאסוף זרע רק בהדרגה ניידים18,19, אבל כמות הזרע שנאסף הוא נמוך מאוד, שהופך אותו לא יעיל באיסוף כמויות גדולות של זרע18, 20. הדבקות בעמודה סינון יעיל מאוד של סינון הזרע ניידים במיוחד של זרע17; עם זאת, הוא נוטה להיות מזיק זרע ממברנות20,21.
בשיטה DGC, המצע הנפוץ ביותר ליצירת מעבר הצבע צפיפות הוא Percoll, אשר מורכב של סיליקה colloidal חלקיקי מצופה polyvinylpryrolidone. Percoll צפיפות הדרגתיות צנטריפוגה (PDGC) יכול להיות רציף או מקוטע אבל הדרגתי מקוטע משמשת בעיקר לבידוד תשואה גבוהה של זרע ניידים במיוחד13,16,20. ב הדרגתי מקוטע, מדיה צפיפות נמוכה יותר צף מעל מדיה צפיפות גבוהה יותר, יצירת מעבר צבע מגבירה צפיפות מהחלק העליון לחלק התחתון של צינור חרוטי. פעולה זו יוצרת גבולות בין התקשורת שני של צפיפות שונות. היעילות של PDGC נגזרת בשני גורמים: 1) היכולת-חליפת בין 2) הנטייה של תאי זרע בעלי שלמות מבנית גבוהה יש צפיפות מוגברת של תאי זרע בודדים. זרע עם ניידות גבוהה יותר טובים מסוגלים לחצות ממדיה צפיפות נמוכה יותר, לחדור לתוך בתקשורת צפיפות גבוהה יותר. זרע ניידות נמוכה יותר נוטים יותר להיות לכודים על הגבול שנוצר על ידי הממשק בין המדיה של צפיפות שונות. תאי זרע בעלי שלמות מבנית גבוהה וניידות נוטים להיות בעלי צפיפות גבוהה יותר מאשר מת, לא תקין או נמוך תאי זרע ניידים. כאשר כוח צנטריפוגלי מוחל ב PDGC, זה מקל על תנועת הזרע בצפיפויות שונות למקומן המתאים המילוי ההדרגתי.
בפועל כללית, לאחר PDGC מבוצע, בגדר רך של זרע עם פוטנציאל בחלק התחתון של צינור חרוטי גבוה פוריות נאסף, היתרה נמחקת. עם זאת, יש יתרון חקלאות לא מנוצלים של טכניקה זו היא היכולת שלה להפריד בין תאי הזרע לתוך מספר קבוצות מבוסס על ההבדלים באיכות. למטרות מחקר, הפרדת זרע על ידי מידת איכות ניצול הטכניקה PDGC מאפשר לימוד של איכות הזרע כפי שהוא נוגע להבדלים הפיזיולוגיות, metabolomic ופרוטיאומיה מבנית. כאן, אנו שואפים לפרט איך טכניקה זו עשוי לשמש כדי להפריד את הזרע על-ידי איכות, כמו גם להדגים את ההבדלים באיכות, באמצעות צביעת חיוני אאוזין שנקבעו קודם-nigrosin, עבור הכדאיות, Accudenz assay ניידות, זרע-IPVL האינטראקציה assay עבור חדירות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:824px;" width="825">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Accudenz</td>
			<td style="width:323px;">Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY, USA</td>
			<td style="width:119px;">AN7050</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Percoll&#160;</td>
			<td style="width:323px;">Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:119px;">P7828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Schiff&#8217;s reagent</td>
			<td style="width:323px;">Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:119px;">3952016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TES</td>
			<td style="width:323px;">Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:119px;">T1375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Eosin Y</td>
			<td style="width:323px;">Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:119px;">E4009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nigrosin</td>
			<td style="width:323px;">Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA</td>
			<td align="right" style="width:119px;">198285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ST 40R Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:323px;">Thermo Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td align="right" style="width:119px;">75004524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DU 530 Life Sciences UV/Vis Spectrophotometer</td>
			<td style="width:323px;">Beckman Coulter, Brea, CA, USA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>No catalogue is found</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Olympus IX 71 Inverted Fluorescence and Phase Contrast Microscope</td>
			<td style="width:323px;">Olympus America Inc., PA, USA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>No catalogue is found</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sperm collection of differential quality using density gradient centrifugation

ברבייה מינית, תא רבייה גברית או תא הזרע בין עם תא רבייה נקבה על הפריה. עם זאת, מספר רב של תאי זרע בעלי יכולת להפרות נדרשים לקיים אינטראקציה עם תא רבייה נקבה כדי לוודא הפריה. ככזה, היכולת המפרה של תאי זרע בודדים הוא קריטי עבור רבייה מוצלחת. צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות ניצל במשך כמה עשורים כשיטה לשחזור מהיר, יעיל, אפקטיבי, וישימה מאוד לאסוף רק באיכות גבוהה הזרע כדי לשמש הטכנולוגיה סייעה הרבייה. הפרוטוקולים שאנו המתואר במסמך זה מתמקדים הניצול של הטכניקה הדרגתיות צנטריפוגה (PDGC) צפיפות Percoll רציף כדי לבודד שלוש אוכלוסיות נפרדות של זרע רוסטר מאת האיכות שלהם. הצלחנו לאסוף נמוך - בינוני, זרע באיכות גבוהה. אנו מתארים גם פרוטוקולים לשחזור שכרוכים הקובע פוטנציאל הפוריות של זרע על-ידי הערכת הכדאיות שלהם, ניידות, חדירות. אוסף של זרע על ידי איכות שלהם בטכניקה PDGC להיות שימושי במדויק, ביסודיות לאפיין זרע עם פוטנציאל דיפרנציאלית פוריות.

הטכניקה PDGC הביא הפרדה ברורה של שלוש שכבות של זרע על ידי מידת איכות על פני כל הפרמטרים. זרע מפריד לשכבה באיכות גבוהה להלן הפתרון צפיפות גבוהה יותר, שכבה באיכות בינונית בין פתרון צפיפות נמוכה יותר גבוה יותר ובין שכבה באיכות נמוכה מעל התמיסה צפיפות נמוכה יותר. ההבדלים באיכות...

Watch this Scientific Journal Video about Sperm Collection of Differential Quality Using Density Gradient Centrifugation at JoVE.com

Sperm Collection of Differential Quality Using Density Gradient Centrifugation

בנייר זה, אנו שואפים לתאר את הביצועים של הטכניקה צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות ויישומו בחקר הפיזיולוגיה של זרע.

אוסף זרע באיכות דיפרנציאלית בעזרת צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הפיזיולוגיה של הזרע, כגון הקובעים הכימיים של איכות הזרע. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת להפריד כמויות גדולות של מדגם לפי איכות, כמו גם הסתגלות בהשוואה לשיטות חלופיות. למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה ההבדלים באיכות הזרע, זה יכול להיות מיושם גם על דגימות אחרות כגון סוגי תאים מעורבים או רכיבים subcellular עם צפיפות שונה.כדי להתחיל, לעשות שני 3 מיליליטר דילול פרקול בשני צינורות נפרדים. במבחנה נקייה, לדלל 1 מיליליטר של דגימת זרע עם 2 מיליליטר של PBS. מזלבים אותו בעדינות כדי לערבב את הפתרון.הוסף 3 מיליליטר של מסיסות פרקול בצפיפות נמוכה יותר לצינור חרוט סטרילי. לאחר מכן, בזהירות pipette 3 מיליליטר של פתרון פרקול צפיפות גבוהה יותר מתחת לפתרון פרקול צפיפות נמוכה יותר. תוך הטיית הצינור חרוט בזווית של 45 מעלות, פיפטה 3 מיליליטר של מדגם הזרע מדולל על גבי שיפוע צפיפות פרקול.לאחר הכנת צינור ריק, צנטריפוגה שני הצינורות ב 1500 Gs במשך 20 דקות. לבטח כי שלוש שכבות נפרדות של זרע נוצרו באמבטיה לאחר צנטריפוגה. באמצעות פיפטה לאסוף את שלוש שכבות הזרע, החל בשכבה העליונה, ואחריו השכבה האמצעית, וכלה גלולה קשה בתחתית הצינור.מעבירים כל אחת מהשכבות לצינור מיקרו צנטריפוגה סטרילי. לדלל כל דגימות הזרע עם 1.5 מיליליטר של PBS צנטריפוגה הדגימות ב 1500 Gs במשך עשר דקות. לבסוף, לשפוך את supernatant ולהשבת את כדורי עם חיץ תנועתיות.בפרוטוקול זה, טכניקת הצנטריפוגה של צפיפות פרקול, או PDGC, שימשה להפרדת דגימת זרע לשלוש שכבות נפרדות. הזרע נפרד לשכבה איכותית מתחת לפתרון הצפיפות הגבוהה יותר, שכבה באיכות בינונית בין פתרונות הצפיפות הגבוהה והתחתון, ושכבה באיכות נמוכה מעל פתרון הצפיפות הנמוכה יותר. הבדלים אלה באיכות הזרע באים עדות על ידי הבדלים בכדאיות, ניידות וחדירה.בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי דגימות צריך להיות הביא לטמפרטורת החדר. ההצלחה של PDGC מסתמכת על הכנה זהירה של שיפוע, כמו גם אוסף זהיר של שכבות מבודדות. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך למחקר שלנו בתחום פרדיומיקה הזרע לחקור סמנים ביולוגיים של פוריות במיני עופות.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Biology

Unit 1

Introduction to Separation Methods

SCIENTISTS IN ACTION

Harvesting Sperm and Artificial Insemination of Mice

קצירת הזרע והזרעה מלאכותית של עכברים

Rodents of the genus Peromyscus (deer mice) are the most prevalent native North American mammals.  Peromyscus species are used in a wide range of research ...

DNA Extraction from 0.22 &mu;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

DNA Extraction from 0.22 ÃƒÅ½Ã‚Â¼M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

הפקת DNA של 0.22 מיקרומטר מסננים Sterivex ו כלוריד צסיום צפיפות צנטריפוגה Gradient

This method is used to extract high molecular weight genomic DNA from planktonic biomass concentrated on 0.22 &mu;M Sterivex filters that have been ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

In-vivo צנטריפוגה של עוברים תסיסנית

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates

הכנת Pyrophosphates אינוסיטול איכות

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the IÃƒâ€šÃ‚Â·Cryo Kit

הזרע עכבר cryopreservation ושחזור באמצעות · אני cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

נחישות של אינטראקציות חלבון ליגנד שימוש דיפרנציאל סריקת Fluorimetry

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

בידוד של המיטוכונדריה ללא פגע מן שרירי השלד על ידי דיפרנציאל צנטריפוגה מדידות Respirometry ברזולוציה גבוהה

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Avian Semen Collection by Cloacal Massage and Isolation of DNA from Sperm

אוסף העופות זרע על ידי עיסוי Cloacal ובידוד של ה-DNA של הזרע

Collection of semen may be useful for a wide range of applications including studies involving sperm quality, sperm telomere dynamics, and epigenetics. ...

Fish Sperm Assessment Using Software and Cooling Devices

הערכת זרע דגים באמצעות תוכנה, התקני קירור

For gamete quality evaluation, there are innovative, rapid, and quantitative techniques that can provide useful data for aquaculture. Computerized systems ...

Field Identification of Matricaria chamomilla using a Portable qPCR System

Field Identification of Matricaria chamomilla using a Portable qPCR System

זיהוי שדה של קמומילה מטריקריה באמצעות מערכת qPCR ניידת

Quality control in botanical products begins with the raw material supply. Traditionally, botanical identification is performed through morphological ...