Name: sperm collection of differential quality using density gradient centrifugation
Uploaded: 2018-11-29T15:00:00
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Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) dell'Università di Georgia.
1. lavaggio utilizzando una centrifuga tradizionale
<ol><li>Preparare la soluzione tampone fosfato (PBS). Aggiungere 8,0 g di NaCl, 0,2 g di KCl, 1,44 g di Na2HPO4 e 0,24 g di KH2PO4 a 800 mL di acqua distillata (dH2O). Regolare il pH a 7.4 utilizzo 0,1 N HCl e portare la soluzione a 1 L utilizzo dH2</...

<ol>
	<li>Spargo, S. C., Hope, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+nomenclature+of+the+zona+pellucida+gene+family.">Evolution and nomenclature of the zona pellucida gene family.</a> Biology Reproduction. 68, 358-362 (2003).</li><li>Okamura, F., Nishiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+passage+of+spermatozoa+through+the+vitelline+membrane+in+the+domestic+fowl,+Gallus+gallus.">The passage of spermatozoa through the vitelline membrane in the domestic fowl, Gallus gallus.</a> Cell and Tissue Research. 188 (3), 497-508 (1978).</li><li>Henkel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+function+and+assisted+reproduction+technology.">Sperm function and assisted reproduction technology.</a> Reproductive Medicine and Biology. 4, 7-30 (2005).</li><li>Reddy, R. 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U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acrosome+reaction+of+fowl+sperm:+Evidence+for+shedding+of+acrosomal+cap+in+intact+form+to+release+acrosomal+enzyme.">Acrosome reaction of fowl sperm: Evidence for shedding of acrosomal cap in intact form to release acrosomal enzyme.</a> Poultry Science. 92 (3), 798-803 (2013).</li><li>Ahammad, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturational+changes+in+motility,+acrosomal+proteolytic+activity,+and+penetrability+of+the+inner+perivitelline+layer+of+fowl+sperm,+during+their+passage+through+the+male+genital+tract.">Maturational changes in motility, acrosomal proteolytic activity, and penetrability of the inner perivitelline layer of fowl sperm, during their passage through the male genital tract.</a> Theriogenology. 76 (6), 1100-1109 (2011).</li><li>Chalah, T., Brillard, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+assessment+of+fowl+sperm+viability+by+eosin-nigrosin+and+dual+fluorescence.">Comparison of assessment of fowl sperm viability by eosin-nigrosin and dual fluorescence.</a> Theriogenology. 50 (3), 487-493 (1998).</li><li>Aitken, R. J., West, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+relationship+between+reactive+oxygen+species+production+and+leukocyte+infiltration+in+fractions+of+human+semen+separated+on+Percoll+gradients.">Analysis of the relationship between reactive oxygen species production and leukocyte infiltration in fractions of human semen separated on Percoll gradients.</a> International Journal of Andrology. 13, 433-451 (1990).</li><li>Mortimer, D., Mortimer, S. T., Carrell, D., Aston, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Density+Gradient+Separation+of+Sperm+for+Artificial+Insemination.">Density Gradient Separation of Sperm for Artificial Insemination.</a> Spermatogenesis. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatozoa+selected+by+a+discontinuous+Percoll+density+gradient+exhibit+better+motion+characteristics,+more+hyperactivation,+and+longer+survival+than+direct+swim-up.">Spermatozoa selected by a discontinuous Percoll density gradient exhibit better motion characteristics, more hyperactivation, and longer survival than direct swim-up.</a> Fertility and Sterility. 64 (1), 160-165 (1995).</li><li>Paulson, J. D., Polakoski, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glass+wool+column+procedure+for+removing+extraneous+material+from+human+ejaculate.">A glass wool column procedure for removing extraneous material from human ejaculate.</a> Fertility and Sterility. 28, 178-181 (1977).</li><li>Ahammad, M. U., Chiaki, N., Tatemoto, H., Kawamoto, Y., Nakada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+the+swim-up+migration+sedimentation+technique+to+separate+viable+and+progressively+motile+fowl+spermatozoa.">Utilization of the swim-up migration sedimentation technique to separate viable and progressively motile fowl spermatozoa.</a> World's Poultry Science Association Proceedings. , (2010).</li><li>Lucena, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+motile+sperm+using+the+migration-sedimentation+technique+in+an+in+vitro+fertilization-embryo+transfer+programme.">Recovery of motile sperm using the migration-sedimentation technique in an in vitro fertilization-embryo transfer programme.</a> Human Reproduction. 4 (2), 163-165 (1989).</li><li>Henkel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+Processing+for+IVF.">Sperm Processing for IVF.</a> Clinical Embryology: A Practical Guide. , (2013).</li><li>Sherman, J., Paulson, D., Liu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+glass+wool+filtration+on+ultrastructure+of+human+spermatozoa.">Effect of glass wool filtration on ultrastructure of human spermatozoa.</a> Fertility and Sterility. 36, 643-647 (1981).</li><li>Freund, M., Carol, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+haemocytometer+counts+of+sperm+concentration+in+human+semen.">Factors affecting haemocytometer counts of sperm concentration in human semen.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 8, 149-155 (1964).</li><li>Bakst, M. R., Wishart, G. J., Brillard, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oviducal+sperm+selection,+transport+and+storage+in+poultry.">Oviducal sperm selection, transport and storage in poultry.</a> Poultry Science Review. 5, 117-143 (1994).</li><li>Ahammad, M. U., Okamoto, S., Kawamoto, Y., Nakada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+regular+fluid+secretion+from+the+uterus+of+laying+hens+on+the+longevity+and+fertilization+ability+of+fowl+sperm+in+the+oviduct.">The effects of regular fluid secretion from the uterus of laying hens on the longevity and fertilization ability of fowl sperm in the oviduct.</a> Poultry Science Journal. 1 (1), 13-22 (2013).</li><li>Ahammad, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturational+changes+in+the+survivability+and+fertility+of+fowl+sperm+during+their+passage+through+the+male+reproductive+tract.">Maturational changes in the survivability and fertility of fowl sperm during their passage through the male reproductive tract.</a> Animal Reproduction Science. 128 (1-4), 129-136 (2011).</li><li>Choi, K. H., Emery, D. A., Straub, D. E., Lee, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Percoll+process+can+improve+semen+quality+and+fertility+in+turkey+breeders.">Percoll process can improve semen quality and fertility in turkey breeders.</a> Asian-Australasian Journal of Animal Sciences. 12 (5), 702-707 (1999).</li><li>Chen, M. J., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+two+density+gradient+preparations+for+sperm+separation+for+medically+assisted+conception.">Comparative evaluation of two density gradient preparations for sperm separation for medically assisted conception.</a> Human Reproduction. 14 (3), 759-764 (1999).</li></ol>

Fertilità non solo determina la redditività della produzione animale, ma anche agisce come un mezzo della selezione naturale delle specie per l'esistenza. La funzione di una cellula di sperma è quella di fecondare un ovulo. Nell'ovidotto di una femmina seleziona solo quegli spermatozoi più adatti al fine di garantire la fecondazione dell'ovulo23,24. Studi in vitro hanno rivelato inoltre una stretta correlazione tra tratti qualitativi degli spermatozo...

Nei vertebrati, gameti maschili sottoposti a forte pressione selettiva; pertanto la fitness riproduttiva di un maschio è fondamentale per il raggiungimento di fecondazione. I maschi di qualsiasi specie di vertebrati determinato devono essere in grado di produrre spermatozoi in grandi quantità e di qualità sufficiente per soddisfare le esigenze di fecondazione. Spermatozoi, avendo sia una testa di sperma e un flagello, sono le cellule più polarizzate nel corpo. Essi sono anche molto eterogenei nella qualità dello sperma (bassa dal vivo e morto, morfologicamente normale e anormale e immobile, mobile e alta mobile), che si rivela attraverso la variazione larga nella efficienza riproduttiva dei maschi. Maggiore è la percentuale degli spermatozoi di qualità, minore è il numero di accoppiamenti per fecondare con successo l'ovulo necessaria. Tuttavia, per ottenere la fertilità, spermatozoi morfologicamente normali si basano su forze propulsive generate da loro flagelli per raggiungere il sito di fecondazione anche da penetrare la zona pellucida1 (ZP; nel caso di mammiferi) o interno perivitellino strato2 (IPVL; nel caso di uccelli e rettili) dell'ovulo dopo accoppiamento naturale o inseminazione artificiale (AI). Determinazione dello sperma è necessaria per l'utilizzo in riproduzione assistita3 (arte) qualità e selezione di maschi di allevamento da utilizzarsi in AI programmi4. D'altra parte, il successo dell'arte si basa esclusivamente sulla valutazione accurata della qualità dello sperma. Un numero di prove di laboratorio è stato sviluppato per determinare le caratteristiche funzionali degli spermatozoi. I parametri più importanti sono la morfologia degli spermatozoi, viabilità, mobilità, capacitazione (aviaria sperma non richiedono capacitazione5), reazione acrosomiale (AR; esocitosi e rilascio di un enzima proteolitico da acrosomiale della testa degli spermatozoi), sperma penetrazione di ZP o IPVL e la fecondazione6,7,8,9,10,11. Misure della fertilità da solo non forniscono una valutazione accurata della capacità fecondante di una popolazione di sperma11. Misure di diversi eventi che portarono alla fecondazione di un uovo consentono un'adeguata rappresentazione delle prestazioni dei singoli spermatociti7.
La metodologia sviluppata per misurare la funzione dello sperma è principalmente specie-specifica. Ad esempio, nello sperma aviaria, vitalità, la mobilità e la penetrazione di IPVL sono i più comuni parametri utilizzati per valutare la qualità di sperma8,11,12. Il numero di live spermatozoi nell'eiaculato gioca un ruolo cruciale per la sopravvivenza degli spermatozoi perché la presenza di un gran numero di morti degli spermatozoi nel liquido seminale influisce la qualità dello sperma. Questo aumenta la produzione di specie reattive dell'ossigeno nel liquido seminale e provoca danno ossidativo al sperma in tensione13. Mobilità dello sperma, la capacità di movimento flagellare di aviaria sperma contro resistenza a temperatura corporea, è conosciuto per svolgere un ruolo diretto nel portare su fecondazione8. È affermato che la mobilità è correlato positivamente con la fertilità e dunque, è un determinante primario di fertilità8. Tuttavia, un spermatozoi mobili anche devono avere la capacità di subire un AR e di penetrare il IPVL11. Saggi di penetrazione IPVL tengano conto per ogni spermatozoo che partecipa al processo di fertilizzazione11.
L'applicazione dell'arte, eiaculare è solitamente trattati al fine di massimizzare la concentrazione degli spermatozoi di qualità e ridurre al minimo la concentrazione di spermatozoi di bassa qualità. Dopo la raccolta dello sperma, la percentuale degli spermatozoi di qualità può essere arricchita attraverso procedure di separazione degli spermatozoi comunemente usate nelle pratiche di ricerca e industria. Molte di queste procedure sono state sviluppate, tutte con i rispettivi vantaggi e limitazioni, ma tutti utilizzano la natura eterogenea di sperma per raccogliere solo gli spermatozoi con alta capacità fecondante. Queste procedure includono metodi di migrazione dello sperma, filtrazione di colonna di aderenza e densità mediante centrifugazione in gradiente (DGC)14,15,16,17,18,19 , 20. tra le tecniche disponibili, DGC è stato trovato per essere molto semplice, ripetibile, conveniente ed efficiente nell'isolare la quantità massima di sperma di alta qualità per uso nell'arte con l'obiettivo di massimizzare le possibilità di fecondazione14 , 15. Inoltre, DGC non è pregiudizievole alla membrana delle cellule dello sperma. Al contrario, metodi di migrazione dello sperma raccolgono lo sperma solo progressivamente mobile18,19, ma la quantità di sperma raccolto è molto bassa, che lo rende inefficiente nella raccolta di grandi volumi di sperma18, 20. aderenza colonna filtrazione è molto efficiente nel filtraggio altamente mobili spermatozoi dal liquido seminale17; Tuttavia, tende ad essere pregiudizievole a sperma membrane20,21.
Nella tecnica del DGC, il substrato più comunemente usato per generare il gradiente di densità è Percoll, che consiste di particelle di silice colloidale rivestite in polyvinylpryrolidone. Percoll centrifugazione in gradiente di densità (PDGC) può essere continuo o discontinuo ma una pendenza discontinua è più comunemente usata per l'isolamento ad alto rendimento di spermatozoi mobili altamente13,16,20. In un gradiente discontinuo, media densità inferiore galleggia sopra supporti di densità superiori, creando un gradiente che aumenta di densità dall'alto verso il basso di un tubo conico. Questo crea confini all'interfaccia fra i due mezzi di diversa densità. L'efficienza di PDGC è derivato da due fattori: 1) la capacità propulsiva di singole cellule dello sperma e 2) la tendenza delle cellule dello sperma con alta integrità strutturale ad avere una densità aumentata. Spermatozoi con maggiore mobilità sono meglio in grado di attraversare dal supporto di densità bassa e penetrare in una più alta densità media. Bassa mobilità spermatozoi sono più probabili di diventare intrappolati al confine creato dall'interfaccia tra media di differenti densità. Spermatozoi con elevata integrità strutturale e mobilità tendono ad avere una più alta densità che morti, anormali o basse spermatozoi mobili. Quando la forza centrifuga è applicato in PDGC, questo facilita il movimento degli spermatozoi con densità differenti al loro posto rispettivo della sfumatura.
Nella pratica generale, dopo PDGC viene eseguita, il morbido pellet di spermatozoi con elevata fertilità potenziale nella parte inferiore del tubo conico è raccolti, e il resto viene scartato. Tuttavia, un vantaggio sottoutilizzato di questa tecnica è la sua capacità di separare spermatozoi in diversi gruppi in base alle differenze qualitative. Per scopi di ricerca, separazione degli spermatozoi dal grado di qualità utilizzando la tecnica PDGC permette per lo studio della qualità dello sperma per quanto concerne le differenze fisiologiche, di metabolomica e proteomica. Qui, ci proponiamo di dettaglio come questa tecnica può essere utilizzata per separare lo sperma di qualità, nonché di dimostrare queste differenze in termini di qualità, utilizzando il precedentemente stabilito eosina-Nigrosina colorazione vitale per la redditività, analisi Accudenz per la mobilità e sperma-IPVL dosaggio di interazione per la penetrabilità.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:824px;" width="825">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Accudenz</td>
			<td style="width:323px;">Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY, USA</td>
			<td style="width:119px;">AN7050</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Percoll&#160;</td>
			<td style="width:323px;">Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:119px;">P7828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Schiff&#8217;s reagent</td>
			<td style="width:323px;">Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:119px;">3952016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TES</td>
			<td style="width:323px;">Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:119px;">T1375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Eosin Y</td>
			<td style="width:323px;">Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:119px;">E4009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nigrosin</td>
			<td style="width:323px;">Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA</td>
			<td align="right" style="width:119px;">198285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ST 40R Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:323px;">Thermo Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td align="right" style="width:119px;">75004524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DU 530 Life Sciences UV/Vis Spectrophotometer</td>
			<td style="width:323px;">Beckman Coulter, Brea, CA, USA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>No catalogue is found</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Olympus IX 71 Inverted Fluorescence and Phase Contrast Microscope</td>
			<td style="width:323px;">Olympus America Inc., PA, USA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>No catalogue is found</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sperm collection of differential quality using density gradient centrifugation

Nella riproduzione sessuale, un gamete maschile o spermatozoo si fonde con un gamete femminile per portare sulla fertilizzazione. Tuttavia, un gran numero di spermatozoi con capacità fecondante è necessario interagire con un gamete femminile per garantire la fecondazione. Come tale, la capacità fecondante degli spermatozoi individuale è fondamentale per riproduzione riuscita. Centrifugazione in gradiente di densità è stata utilizzata per diversi decenni come un metodo riproducibile, veloce, efficiente, efficace ed estremamente adattabile per raccogliere solo alta qualità sperma per essere utilizzato in riproduzione assistita. I protocolli che abbiamo descritto nel presente documento si concentrano sull'utilizzazione della tecnica di centrifugazione su gradiente (PDGC) di densità Percoll discontinua per isolare tre distinte popolazioni di sperma Gallo per la loro qualità. Siamo stati in grado di raccogliere basso, medio e alta qualità sperma. Descriviamo anche protocolli riproducibile che comportano determinante potenziale di fertilità dello sperma di valutazione della loro vitalità, la mobilità e la penetrabilità. Raccolta dello sperma per la loro qualità tecnica PDGC sarebbe utile per accuratamente e caratterizzare accuratamente sperma con differenziale fertilità potenziale.

La tecnica PDGC ha provocato la separazione dei tre strati di sperma distinti da grado di qualità attraverso tutti i parametri. Lo sperma si separa in un livello di alta qualità sotto la soluzione di densità superiore, uno strato di qualità media tra il superiore e inferiore densità soluzione e un livello di bassa qualità sopra la soluzione di densità inferiore. Queste differenze di qualità sono evidenziate mediante chiare differenze di redditività (Figura 4<...

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Sperm Collection of Differential Quality Using Density Gradient Centrifugation

In questa carta, ci proponiamo di descrivere le prestazioni della tecnica di centrifugazione su gradiente di densità e la sua applicazione nella ricerca di fisiologia di sperma.

Raccolta di sperma di qualità differenziale mediante centrifugazione in gradiente di densità

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della fisiologia dello sperma, come i determinati chimici della qualità dello sperma. Il vantaggio principale di questa tecnica è la sua capacità di separare grandi quantità di campione per qualità, così come l'adattabilità rispetto a metodi alternativi. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle differenze nella qualità dello sperma, può anche essere applicato ad altri campioni come tipi di cellule miste o componenti subcellulari con densità diverse.Per iniziare, fare due diluizioni Percoll da 3 millilitri in due tubi separati. In una provetta pulita, diluire 1 millilitro di campione di sperma con 2 millilitri di PBS. Tubazione delicatamente per mescolare la soluzione.Aggiungere 3 millilitri della solluizione Percoll a bassa densità a un tubo conico sterile. Quindi, pipettare con cura 3 millilitri della soluzione Percoll ad alta densità sotto la soluzione Percoll a densità inferiore. Mentre si inclina il tubo conico con un angolo di 45 gradi, pipettare 3 millilitri del campione di sperma diluito sopra il gradiente di densità di Percoll.Dopo aver preparato un tubo vuoto, centrifuga entrambi i tubi a 1500 G per 20 minuti. Assicurarsi che tre distinti strati di sperma si siano formati nella vasca dopo la centrifugazione. Utilizzando una pipetta raccogliere i tre strati di sperma, iniziando con lo strato superiore, seguito dallo strato intermedio, e terminando con il pellet duro nella parte inferiore del tubo.Trasferire ciascuno degli strati in un tubo di micro centrifuga sterile. Diluire ciascuno dei campioni di sperma con 1,5 millilitri di PBS e centrifugare i campioni a 1500 G per dieci minuti. Infine, versare il supernatante e ricostituire i pellet con tampone di motilità.In questo protocollo, la tecnica di centrifugazione del gradiente di densità percoll, o PDGC, è stata utilizzata per separare un campione di sperma in tre strati distinti. Lo sperma si separa in uno strato di alta qualità al di sotto della soluzione a densità più elevata, uno strato di media qualità tra le soluzioni a densità superiore e inferiore e uno strato di bassa qualità sopra la soluzione a densità inferiore. Queste differenze nella qualità degli spermatozoi sono evidenziate da differenze di vitalità, mobilità e penetrabilità.Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che i campioni devono essere portati a temperatura ambiente. Il successo del PDGC dipende da un'attenta preparazione del gradiente e da un'attenta raccolta degli strati isolati. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada alla nostra ricerca nel campo della perdiomica degli spermatozoi per esplorare bio marcatori di fertilità nelle specie aviari.

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Unit 1

Introduction to Separation Methods

SCIENTISTS IN ACTION

Harvesting Sperm and Artificial Insemination of Mice

Lo sperma raccolto e l&#39;inseminazione artificiale di topi

Rodents of the genus Peromyscus (deer mice) are the most prevalent native North American mammals.  Peromyscus species are used in a wide range of research ...

Ricerca

Biologia

DNA Extraction from 0.22 &mu;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

DNA Extraction from 0.22 ÃƒÅ½Ã‚Â¼M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

Estrazione del DNA da 0,22 Filtri mM Sterivex e cloruro di Cesio densità centrifugazione gradiente

This method is used to extract high molecular weight genomic DNA from planktonic biomass concentrated on 0.22 &mu;M Sterivex filters that have been ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

In vivo centrifugazione di embrioni di Drosophila

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates

Preparazione di Qualità pirofosfati Inositolo

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the IÃƒâ€šÃ‚Â·Cryo Kit

Crioconservazione del mouse Sperm and Recovery utilizzando il Kit · I Cryo

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

Determinazione delle interazioni proteina-ligando Utilizzo scansione differenziale Fluorimetria

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

L&#39;isolamento di mitocondri intatti dal muscolo scheletrico mediante centrifugazione differenziale per alta risoluzione respirometria Misure

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Avian Semen Collection by Cloacal Massage and Isolation of DNA from Sperm

Raccolta dello sperma aviaria Cloacal massaggi e isolamento di DNA da sperma

Collection of semen may be useful for a wide range of applications including studies involving sperm quality, sperm telomere dynamics, and epigenetics. ...

Fish Sperm Assessment Using Software and Cooling Devices

Valutazione di sperma di pesce utilizzando Software e dispositivi di raffreddamento

For gamete quality evaluation, there are innovative, rapid, and quantitative techniques that can provide useful data for aquaculture. Computerized systems ...

Field Identification of Matricaria chamomilla using a Portable qPCR System

Field Identification of Matricaria chamomilla using a Portable qPCR System

Identificazione sul campo della camomillia Matricaria utilizzando un sistema qPCR portatile

Quality control in botanical products begins with the raw material supply. Traditionally, botanical identification is performed through morphological ...