Name: sperm collection of differential quality using density gradient centrifugation
Uploaded: 2018-11-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sperm Collection of Differential Quality Using Density Gradient Centrifugation at JoVE.com

Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) av University of Georgia.
1. vask med tradisjonelle sentrifugering
<ol><li>Forberede fosfat buffer løsning (PBS). Legge 8.0 g av NaCl, 0.2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4 og 0,24 g KH2PO4 800 mL destillert vann (dH2O). Justere pH 7,4 bruker 0,1 N HCl og få løsningen til 1 L bruker dH2O.</li>
	<li>Forberede motilitet buffer. Legge 6...

<ol>
	<li>Spargo, S. C., Hope, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+nomenclature+of+the+zona+pellucida+gene+family.">Evolution and nomenclature of the zona pellucida gene family.</a> Biology Reproduction. 68, 358-362 (2003).</li><li>Okamura, F., Nishiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+passage+of+spermatozoa+through+the+vitelline+membrane+in+the+domestic+fowl,+Gallus+gallus.">The passage of spermatozoa through the vitelline membrane in the domestic fowl, Gallus gallus.</a> Cell and Tissue Research. 188 (3), 497-508 (1978).</li><li>Henkel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+function+and+assisted+reproduction+technology.">Sperm function and assisted reproduction technology.</a> Reproductive Medicine and Biology. 4, 7-30 (2005).</li><li>Reddy, R. P., Bakst, M. R., Wishart, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+Insemination+of+broilers:+Economic+and+management+implications.">Artificial Insemination of broilers: Economic and management implications.</a> Proceedings of 1st International Symposium on Artificial Insemination of Poultry. Poultry Science Association. , 73-89 (1995).</li><li>Howarth, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Examination+for+Sperm+Capacitation+in+the+Fowl.">An Examination for Sperm Capacitation in the Fowl.</a> Biology of Reproduction. 3, 338-341 (1971).</li><li>Menkveld, R., Holleboom, C. A. G., Rhemrev, J. P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+and+significance+of+sperm+morphology.">Measurement and significance of sperm morphology.</a> Asian Journal of Andrology. 13, 59-68 (2011).</li><li>Kumaresan, A., Johannisson, A., Al-Essawe, E. M., Morrell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+viability,+reactive+oxygen+species,+and+DNA+fragmentation+index+combined+can+discriminate+between+above-+and+below-average+fertility+bulls.">Sperm viability, reactive oxygen species, and DNA fragmentation index combined can discriminate between above- and below-average fertility bulls.</a> Journal of Dairy Science. 100, 5824-5836 (2017).</li><li>Froman, D. P., McLean, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Objective+measurement+of+sperm+motility+based+upon+sperm+penetration+of+Accudenz.">Objective measurement of sperm motility based upon sperm penetration of Accudenz.</a> Poultry Science. 75, 776-784 (1996).</li><li>Zaneveld, L. J., De Jonge, C. J., Anderson, R. A., Mack, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+sperm+capacitation+and+the+acrosome+reaction.">Human sperm capacitation and the acrosome reaction.</a> Human Reproduction. 6 (9), 1265-1274 (1991).</li><li>Ahammad, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acrosome+reaction+of+fowl+sperm:+Evidence+for+shedding+of+acrosomal+cap+in+intact+form+to+release+acrosomal+enzyme.">Acrosome reaction of fowl sperm: Evidence for shedding of acrosomal cap in intact form to release acrosomal enzyme.</a> Poultry Science. 92 (3), 798-803 (2013).</li><li>Ahammad, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturational+changes+in+motility,+acrosomal+proteolytic+activity,+and+penetrability+of+the+inner+perivitelline+layer+of+fowl+sperm,+during+their+passage+through+the+male+genital+tract.">Maturational changes in motility, acrosomal proteolytic activity, and penetrability of the inner perivitelline layer of fowl sperm, during their passage through the male genital tract.</a> Theriogenology. 76 (6), 1100-1109 (2011).</li><li>Chalah, T., Brillard, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+assessment+of+fowl+sperm+viability+by+eosin-nigrosin+and+dual+fluorescence.">Comparison of assessment of fowl sperm viability by eosin-nigrosin and dual fluorescence.</a> Theriogenology. 50 (3), 487-493 (1998).</li><li>Aitken, R. J., West, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+relationship+between+reactive+oxygen+species+production+and+leukocyte+infiltration+in+fractions+of+human+semen+separated+on+Percoll+gradients.">Analysis of the relationship between reactive oxygen species production and leukocyte infiltration in fractions of human semen separated on Percoll gradients.</a> International Journal of Andrology. 13, 433-451 (1990).</li><li>Mortimer, D., Mortimer, S. T., Carrell, D., Aston, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Density+Gradient+Separation+of+Sperm+for+Artificial+Insemination.">Density Gradient Separation of Sperm for Artificial Insemination.</a> Spermatogenesis. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols. , 927 (2013).</li><li>Qingling, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+semen+by+density+gradient+centrifugation+selects+spermatozoa+with+longer+telomeres+for+assisted+reproduction+techniques.">Processing of semen by density gradient centrifugation selects spermatozoa with longer telomeres for assisted reproduction techniques.</a> Reproductive BioMedicine Online. 31, 44-50 (2015).</li><li>Moohan, J. M., Lindsay, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatozoa+selected+by+a+discontinuous+Percoll+density+gradient+exhibit+better+motion+characteristics,+more+hyperactivation,+and+longer+survival+than+direct+swim-up.">Spermatozoa selected by a discontinuous Percoll density gradient exhibit better motion characteristics, more hyperactivation, and longer survival than direct swim-up.</a> Fertility and Sterility. 64 (1), 160-165 (1995).</li><li>Paulson, J. D., Polakoski, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glass+wool+column+procedure+for+removing+extraneous+material+from+human+ejaculate.">A glass wool column procedure for removing extraneous material from human ejaculate.</a> Fertility and Sterility. 28, 178-181 (1977).</li><li>Ahammad, M. U., Chiaki, N., Tatemoto, H., Kawamoto, Y., Nakada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+the+swim-up+migration+sedimentation+technique+to+separate+viable+and+progressively+motile+fowl+spermatozoa.">Utilization of the swim-up migration sedimentation technique to separate viable and progressively motile fowl spermatozoa.</a> World's Poultry Science Association Proceedings. , (2010).</li><li>Lucena, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+motile+sperm+using+the+migration-sedimentation+technique+in+an+in+vitro+fertilization-embryo+transfer+programme.">Recovery of motile sperm using the migration-sedimentation technique in an in vitro fertilization-embryo transfer programme.</a> Human Reproduction. 4 (2), 163-165 (1989).</li><li>Henkel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+Processing+for+IVF.">Sperm Processing for IVF.</a> Clinical Embryology: A Practical Guide. , (2013).</li><li>Sherman, J., Paulson, D., Liu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+glass+wool+filtration+on+ultrastructure+of+human+spermatozoa.">Effect of glass wool filtration on ultrastructure of human spermatozoa.</a> Fertility and Sterility. 36, 643-647 (1981).</li><li>Freund, M., Carol, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+haemocytometer+counts+of+sperm+concentration+in+human+semen.">Factors affecting haemocytometer counts of sperm concentration in human semen.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 8, 149-155 (1964).</li><li>Bakst, M. R., Wishart, G. J., Brillard, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oviducal+sperm+selection,+transport+and+storage+in+poultry.">Oviducal sperm selection, transport and storage in poultry.</a> Poultry Science Review. 5, 117-143 (1994).</li><li>Ahammad, M. U., Okamoto, S., Kawamoto, Y., Nakada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+regular+fluid+secretion+from+the+uterus+of+laying+hens+on+the+longevity+and+fertilization+ability+of+fowl+sperm+in+the+oviduct.">The effects of regular fluid secretion from the uterus of laying hens on the longevity and fertilization ability of fowl sperm in the oviduct.</a> Poultry Science Journal. 1 (1), 13-22 (2013).</li><li>Ahammad, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturational+changes+in+the+survivability+and+fertility+of+fowl+sperm+during+their+passage+through+the+male+reproductive+tract.">Maturational changes in the survivability and fertility of fowl sperm during their passage through the male reproductive tract.</a> Animal Reproduction Science. 128 (1-4), 129-136 (2011).</li><li>Choi, K. H., Emery, D. A., Straub, D. E., Lee, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Percoll+process+can+improve+semen+quality+and+fertility+in+turkey+breeders.">Percoll process can improve semen quality and fertility in turkey breeders.</a> Asian-Australasian Journal of Animal Sciences. 12 (5), 702-707 (1999).</li><li>Chen, M. J., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+two+density+gradient+preparations+for+sperm+separation+for+medically+assisted+conception.">Comparative evaluation of two density gradient preparations for sperm separation for medically assisted conception.</a> Human Reproduction. 14 (3), 759-764 (1999).</li></ol>

Fruktbarhet ikke bare bestemmer lønnsomheten i dyr produksjonen, men også fungerer som en naturlig utvalg av arter for eksistens. Den ultimate funksjonen til en sperm celle er å befrukte egget. Oviduct en kvinne velger bare de fittest sperm slik befruktning av egget23,24. In vitro studier har også avdekket en nær sammenheng mellom kvalitativ sædceller egenskaper og gjødsling, suksess,4,,11...

I virveldyr gjennomgå mannlige gameter intens seleksjonspress; Derfor er reproduktive fitness om menn avgjørende for å oppnå vellykket befruktning. Menn av Alle virveldyr artene må kunne produsere sædceller i store mengder og av tilstrekkelig kvalitet for å møte behovene til befruktning. Sædceller, har både en sædceller hode og en flagell, er de mest polarisert cellene i kroppen. De er også svært heterogen i kvaliteten på sæden (levende og døde morphologically normale og unormale og immobile, lav mobile og høy mobil), som er avdekket gjennom variasjonen i reproduktive effektiviteten av menn. Jo større andel av høy kvalitet sperm, mengde parring må vellykket gjødsle ovum. Men for å oppnå fruktbarhet, morphologically normal sædceller stole på propulsive styrker generert av deres flagella å komme til stedet for befruktning så vel som å trenge gjennom zona pellucida1 (ZP; i pattedyr) eller indre perivitelline Lag2 (IPVL, fugler og reptiler) av egget etter naturlig mating eller kunstig insemination (AI). Bestemme sperm kvalitet er nødvendig for bruk i assistert reproduktive teknologier3 (ART) og utvalg av avl menn i AI programmer4. Derimot, avhengig suksess for kunst utelukkende av nøyaktig vurdering av kvaliteten. En rekke laboratorietester er utviklet for å fastslå funksjonelle egenskaper av sæd. De viktigste parameterne er sperm morfologi, levedyktighet, mobilitet, capacitation (avian sperm krever ikke capacitation5), acrosome reaksjon (AR; exocytosis og utgivelsen av et proteolytisk enzym fra acrosome av sæden hodet), sperm penetrasjon ZP eller IPVL, og gjødsling6,7,8,9,10,11. Tiltak av fruktbarhet alene gi ikke en nøyaktig vurdering av gjødslende evnen til en sæd befolkningen11. Tiltak av flere hendelser som førte til befruktning av et egg gir en riktig representasjon av ytelsen til enkelte spermatocytes7.
Metodene som er utviklet for å måle sperm funksjon er primært artsspesifikke. For eksempel i avian sperm er levedyktighet, mobilitet og penetrasjonen av IPVL de vanligste parameterne brukes til å vurdere sperm kvalitet8,11,12. Antall levende sædceller i ejakulere spiller en avgjørende rolle for overlevelse av spermier fordi tilstedeværelsen av et stort antall døde sperm i sæd påvirker kvaliteten på sæden. Dette øker produksjonen av reaktive oksygen arter i sæd til oksidative skader den levende sædceller13. Sperm mobilitet, kapasiteten for flagellar flytting av avian sæd mot motstand ved kroppstemperatur, er kjent for å spille en direkte rolle i å bringe om befruktning8. Det er godt etablert at mobilitet er positivt korrelert med fruktbarhet og er derfor en primær determinant av fruktbarhet8. En mobil sperm må imidlertid også ha muligheten til å gjennomgå en AR og trenge IPVL11. IPVL penetrasjon analyser ta hensyn til alle sædcellene som deltar i prosessen med befruktning11.
Anvendelsen av kunst, er ejakulerer vanligvis behandlet for å maksimere konsentrasjonen av høy kvalitet sperm og minimere konsentrasjon av lav kvalitet sperm. Etter samling av sæd, kan andelen av høy kvalitet sperm bli beriket gjennom sperm separasjon prosedyrer brukt i både industri og forskning. Mange av disse prosedyrer har blitt utviklet, med respektive fordeler og begrensninger, men alle utnytte heterogene natur sædcellene å samle bare sperm med høy gjødslende evne. Disse prosedyrene omfatter sperm overføringsmetoder, tilslutning kolonnen filtrering og tetthet gradert sentrifugering (DGC)14,15,16,17,18,19 , 20. blant de tilgjengelige teknikkene, DGC er funnet for å være svært enkel, repeterbare, kostnadseffektiv og effektiv hjelpe maksimale høykvalitets sæd til bruk i kunst med mål om å maksimere sjansen for befruktning14 , 15. I tillegg DGC er ikke skadelig for sperm celle membran. Derimot sperm overføringsmetoder samle bare gradvis mobile sperm18,19, men mengden av sæd samlet er svært lav, noe som gjør det ineffektivt å samle inn store mengder sæd18, 20. tilslutning kolonnen filtrering er svært effektiv i filtrering ultramobile sperm fra sæd17; men pleier det å være skadelig for sperm membraner20,21.
I DGC teknikken er mest brukte underlaget for å generere tetthet graderingen Percoll, som består av kolloidal silika partikler belagt i polyvinylpryrolidone. Percoll tetthet gradert sentrifugering (PDGC) kan enten være kontinuerlig eller usammenhengende men usammenhengende graderinger brukes vanligvis for høy avkastning isolering av svært mobile sperm13,16,20. I en usammenhengende gradering flyter lavere tetthet media over høyere tetthet medier, lage en gradering som øker tetthet fra toppen til bunnen av en konisk rør. Dette skaper grenser på grensesnittet mellom to media av ulik tetthet. Effektiviteten av PDGC er avledet fra to faktorer: 1) propulsive evne til individuelle sperm celler og 2) tendensen av sædceller med høy strukturelle integritet å ha en økt tetthet. Spermier med høyere mobilitet er bedre i stand til å krysse fra lavere tetthet media og trenge inn i en høyere tetthet media. Lavere mobilitet sæd er mer sannsynlig å bli fanget på grensen laget av grensesnittet mellom media av ulik tetthet. Sædceller med høy strukturelle integritet og mobilitet pleier å ha en høyere tetthet enn døde, unormal eller lav mobile sædceller. Når sentrifugalkraften brukes i PDGC, forenkler dette flytting av sæd med forskjellige tettheter til sitt respektive i forløpningen.
I generell fremgangsmåte når PDGC er utført, den myke pellet av spermier med høy fruktbarhet potensielle nederst konisk røret samles og resten er forkastet. Men er en underutnyttet fordel av denne teknikken dens evne til å skille sædceller i flere grupper basert på kvalitet forskjellene. Til forskningsformål tillater separasjon av sæd ved grad av kvalitet utnytte PDGC teknikken studie av kvaliteten som gjelder fysiologiske, metabolomic og proteomic forskjeller. Her, ønsker vi å detalj hvordan denne teknikken kan brukes til å skille sperm kvalitet, i tillegg til å vise disse forskjellene i kvalitet, bruk av tidligere etablert eosin-nigrosin viktig flekker for levedyktigheten Accudenz analysen for mobilitet og sperm-IPVL samhandling analysen for penetrability.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:824px;" width="825">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Accudenz</td>
			<td style="width:323px;">Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY, USA</td>
			<td style="width:119px;">AN7050</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Percoll&#160;</td>
			<td style="width:323px;">Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:119px;">P7828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Schiff&#8217;s reagent</td>
			<td style="width:323px;">Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:119px;">3952016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TES</td>
			<td style="width:323px;">Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:119px;">T1375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Eosin Y</td>
			<td style="width:323px;">Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:119px;">E4009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nigrosin</td>
			<td style="width:323px;">Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA</td>
			<td align="right" style="width:119px;">198285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ST 40R Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:323px;">Thermo Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td align="right" style="width:119px;">75004524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DU 530 Life Sciences UV/Vis Spectrophotometer</td>
			<td style="width:323px;">Beckman Coulter, Brea, CA, USA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>No catalogue is found</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Olympus IX 71 Inverted Fluorescence and Phase Contrast Microscope</td>
			<td style="width:323px;">Olympus America Inc., PA, USA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>No catalogue is found</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sperm collection of differential quality using density gradient centrifugation

I seksuell reproduksjon, en mannlig Kjønnscelle eller sperm celle sikringer med en kvinnelig Kjønnscelle å få befruktning. Et stort antall sædceller med gjødsling evne kreves imidlertid å samhandle med en kvinnelig Kjønnscelle å sikre befruktning. Slik er gjødslende evne til individuelle sædceller avgjørende for vellykket reproduksjon. Tetthet gradert sentrifugering blitt benyttet i flere tiår som reproduserbare, rask, effektiv og ekstremt fleksibel metode for å samle inn bare høy kvalitet sperm i Assistert befruktning. Protokollene vi beskrevet her fokus på utnyttelse av usammenhengende Percoll tetthet gradert sentrifugering (PDGC) teknikken å isolere tre forskjellige populasjoner av hane sæd ved sin kvalitet. Vi kunne samle lite, middels og høy kvalitet sperm. Vi beskriver også reproduserbar protokoller som innebærer avgjørende fruktbarhet potensialet av sæd ved å vurdere deres levedyktighet, mobilitet og penetrability. Samling av sæd av kvaliteten bruke PDGC teknikken ville være nyttig å nøyaktig og grundig karakterisere sperm med differensial fruktbarhet potensielle.

PDGC teknikken resulterte i forskjellige separasjon av tre lag av sæd ved grad av kvalitet over alle parametere. Sperm skiller til høy kvalitet lag under høyere tetthet løsningen, et middels kvalitet lag mellom høyere og lavere tetthet løsning og en lav kvalitet lag over lavere tetthet løsningen. Disse forskjellene i kvalitet er dokumentert av klare forskjeller i levedyktighet (Figur 4), transportabel (figur 5) og penetrab...

Watch this Scientific Journal Video about Sperm Collection of Differential Quality Using Density Gradient Centrifugation at JoVE.com

Sperm Collection of Differential Quality Using Density Gradient Centrifugation

I dette papiret, vi tar sikte på å beskrive tetthet gradert sentrifugering teknikken og dens anvendelse i sperm fysiologi forskning.

Sæd samling av differensial kvalitet bruker tetthet gradert sentrifugering

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål innen sperm fysiologi, for eksempel de kjemiske determinater av sædkvalitet. Den største fordelen med denne teknikken er at den er evnen til å skille store mengder utvalg etter kvalitet, samt tilpasningsevne sammenlignet med alternative metoder. Selv om denne metoden kan gi innsikt i forskjellene i sperm kvalitet, Det kan også brukes på andre prøver som blandede celletyper eller subcellulære komponenter med forskjellige tettheter.Til å begynne, lage to 3 milliliter Percoll fortynninger i to separate rør. I et rent testrør, fortynne 1 milliliter sædprøve med 2 milliliter PBS. Rør den forsiktig for å blande løsningen.Tilsett 3 milliliter av den nedre tettheten Percoll sollution til et sterilt konisk rør. Deretter, nøye pipette 3 milliliter av høyere tetthet Percoll løsning under lavere tetthet Percoll løsning. Mens du vipper konisk rør i en 45 graders vinkel, pipette 3 milliliter av fortynnet sæd prøven på toppen av Percoll tetthet gradient.Etter å ha forberedt et tomt rør, sentrifuger begge rørene ved 1500 Gs i 20 minutter. Forsikre deg om at tre forskjellige lag sæd har dannet seg i karet etter sentrifugering. Ved hjelp av en pipette samle de tre lagene av sæd, starter med det øverste laget, etterfulgt av det midterste laget, og slutter med den harde pellet nederst på røret.Overfør hvert av lagene til et sterilt mikrosentrigerrør. Fortynn hver av sædprøvene med 1,5 milliliter PBS og sentrifuge prøvene ved 1500 Gs i ti minutter. Til slutt, hell av supernatant og rekonstituer pellets med motilitetbuffer.I denne protokollen ble Percoll tetthetsgradient sentrifugeringsteknikken, eller PDGC, brukt til å skille en sædprøve i tre forskjellige lag. Sperm skiller seg inn i et lag av høy kvalitet under den høyere tetthetsløsningen, et middels kvalitetslag mellom de høyere og lavere tetthetsløsningene, og et lag av lav kvalitet over løsningen med lavere tetthet. Disse forskjellene i sperm kvalitet er dokumentert av forskjeller i levedyktighet, mobilitet, og penetrerbarhet.Mens du prøver denne prosedyren, er det viktig å huske at prøver må bringes til romtemperatur. Suksessen til PDGC er avhengig av nøye fremstilling av gradienten, samt forsiktig innsamling av de isolerte lagene. Etter utviklingen banet denne teknikken vei for vår forskning innen spermperdiomikk for å utforske biomarkører for fruktbarhet i fuglearter.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Biology

Unit 1

Introduction to Separation Methods

SCIENTISTS IN ACTION

Harvesting Sperm and Artificial Insemination of Mice

Rodents of the genus Peromyscus (deer mice) are the most prevalent native North American mammals.  Peromyscus species are used in a wide range of research ...

DNA Extraction from 0.22 &mu;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

DNA Extraction from 0.22 ÃƒÅ½Ã‚Â¼M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

This method is used to extract high molecular weight genomic DNA from planktonic biomass concentrated on 0.22 &mu;M Sterivex filters that have been ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the IÃƒâ€šÃ‚Â·Cryo Kit

Mus Sperm Kryokonservering og Recovery bruke I · Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

Bestemmelse av protein-ligand interaksjoner Bruke Differential Scanning Fluorimetry

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Isolering av Intakt Mitokondrier fra Skeletal Muscle av differensialsentrifugering for høy oppløsning respirometri Målinger

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Avian Semen Collection by Cloacal Massage and Isolation of DNA from Sperm

Avian Semen samling av Cloacal massasje og isolering av DNA fra Sperm

Collection of semen may be useful for a wide range of applications including studies involving sperm quality, sperm telomere dynamics, and epigenetics. ...

Fish Sperm Assessment Using Software and Cooling Devices

Fisk Sperm vurdering ved hjelp av programvare og kjøling enheter

For gamete quality evaluation, there are innovative, rapid, and quantitative techniques that can provide useful data for aquaculture. Computerized systems ...

Field Identification of Matricaria chamomilla using a Portable qPCR System

Field Identification of Matricaria chamomilla using a Portable qPCR System

Feltidentifikasjon av Matricaria-kamille ved hjelp av et bærbart qPCR-system

Quality control in botanical products begins with the raw material supply. Traditionally, botanical identification is performed through morphological ...