Name: sperm collection of differential quality using density gradient centrifugation
Uploaded: 2018-11-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sperm Collection of Differential Quality Using Density Gradient Centrifugation at JoVE.com

Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) av University of Georgia.
1. tvättning med traditionella centrifugering
<ol><li>Förbereda fosfatbuffertlösning (PBS). Tillsätt 8,0 g NaCl, 0,2 g kaliumklorid, 1,44 g av Na2HPO4 och 0.24 g KH2PO4 800 ml destillerat vatten (dH2O). Justera pH till 7,4 använder 0,1 N HCl och föra lösningen till 1 L med dH2O.</...

<ol>
	<li>Spargo, S. C., Hope, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+nomenclature+of+the+zona+pellucida+gene+family.">Evolution and nomenclature of the zona pellucida gene family.</a> Biology Reproduction. 68, 358-362 (2003).</li><li>Okamura, F., Nishiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+passage+of+spermatozoa+through+the+vitelline+membrane+in+the+domestic+fowl,+Gallus+gallus.">The passage of spermatozoa through the vitelline membrane in the domestic fowl, Gallus gallus.</a> Cell and Tissue Research. 188 (3), 497-508 (1978).</li><li>Henkel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+function+and+assisted+reproduction+technology.">Sperm function and assisted reproduction technology.</a> Reproductive Medicine and Biology. 4, 7-30 (2005).</li><li>Reddy, R. P., Bakst, M. R., Wishart, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+Insemination+of+broilers:+Economic+and+management+implications.">Artificial Insemination of broilers: Economic and management implications.</a> Proceedings of 1st International Symposium on Artificial Insemination of Poultry. Poultry Science Association. , 73-89 (1995).</li><li>Howarth, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Examination+for+Sperm+Capacitation+in+the+Fowl.">An Examination for Sperm Capacitation in the Fowl.</a> Biology of Reproduction. 3, 338-341 (1971).</li><li>Menkveld, R., Holleboom, C. A. G., Rhemrev, J. P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+and+significance+of+sperm+morphology.">Measurement and significance of sperm morphology.</a> Asian Journal of Andrology. 13, 59-68 (2011).</li><li>Kumaresan, A., Johannisson, A., Al-Essawe, E. M., Morrell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+viability,+reactive+oxygen+species,+and+DNA+fragmentation+index+combined+can+discriminate+between+above-+and+below-average+fertility+bulls.">Sperm viability, reactive oxygen species, and DNA fragmentation index combined can discriminate between above- and below-average fertility bulls.</a> Journal of Dairy Science. 100, 5824-5836 (2017).</li><li>Froman, D. P., McLean, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Objective+measurement+of+sperm+motility+based+upon+sperm+penetration+of+Accudenz.">Objective measurement of sperm motility based upon sperm penetration of Accudenz.</a> Poultry Science. 75, 776-784 (1996).</li><li>Zaneveld, L. J., De Jonge, C. J., Anderson, R. A., Mack, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+sperm+capacitation+and+the+acrosome+reaction.">Human sperm capacitation and the acrosome reaction.</a> Human Reproduction. 6 (9), 1265-1274 (1991).</li><li>Ahammad, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acrosome+reaction+of+fowl+sperm:+Evidence+for+shedding+of+acrosomal+cap+in+intact+form+to+release+acrosomal+enzyme.">Acrosome reaction of fowl sperm: Evidence for shedding of acrosomal cap in intact form to release acrosomal enzyme.</a> Poultry Science. 92 (3), 798-803 (2013).</li><li>Ahammad, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturational+changes+in+motility,+acrosomal+proteolytic+activity,+and+penetrability+of+the+inner+perivitelline+layer+of+fowl+sperm,+during+their+passage+through+the+male+genital+tract.">Maturational changes in motility, acrosomal proteolytic activity, and penetrability of the inner perivitelline layer of fowl sperm, during their passage through the male genital tract.</a> Theriogenology. 76 (6), 1100-1109 (2011).</li><li>Chalah, T., Brillard, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+assessment+of+fowl+sperm+viability+by+eosin-nigrosin+and+dual+fluorescence.">Comparison of assessment of fowl sperm viability by eosin-nigrosin and dual fluorescence.</a> Theriogenology. 50 (3), 487-493 (1998).</li><li>Aitken, R. J., West, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+relationship+between+reactive+oxygen+species+production+and+leukocyte+infiltration+in+fractions+of+human+semen+separated+on+Percoll+gradients.">Analysis of the relationship between reactive oxygen species production and leukocyte infiltration in fractions of human semen separated on Percoll gradients.</a> International Journal of Andrology. 13, 433-451 (1990).</li><li>Mortimer, D., Mortimer, S. T., Carrell, D., Aston, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Density+Gradient+Separation+of+Sperm+for+Artificial+Insemination.">Density Gradient Separation of Sperm for Artificial Insemination.</a> Spermatogenesis. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols. , 927 (2013).</li><li>Qingling, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+semen+by+density+gradient+centrifugation+selects+spermatozoa+with+longer+telomeres+for+assisted+reproduction+techniques.">Processing of semen by density gradient centrifugation selects spermatozoa with longer telomeres for assisted reproduction techniques.</a> Reproductive BioMedicine Online. 31, 44-50 (2015).</li><li>Moohan, J. M., Lindsay, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatozoa+selected+by+a+discontinuous+Percoll+density+gradient+exhibit+better+motion+characteristics,+more+hyperactivation,+and+longer+survival+than+direct+swim-up.">Spermatozoa selected by a discontinuous Percoll density gradient exhibit better motion characteristics, more hyperactivation, and longer survival than direct swim-up.</a> Fertility and Sterility. 64 (1), 160-165 (1995).</li><li>Paulson, J. D., Polakoski, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glass+wool+column+procedure+for+removing+extraneous+material+from+human+ejaculate.">A glass wool column procedure for removing extraneous material from human ejaculate.</a> Fertility and Sterility. 28, 178-181 (1977).</li><li>Ahammad, M. U., Chiaki, N., Tatemoto, H., Kawamoto, Y., Nakada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+the+swim-up+migration+sedimentation+technique+to+separate+viable+and+progressively+motile+fowl+spermatozoa.">Utilization of the swim-up migration sedimentation technique to separate viable and progressively motile fowl spermatozoa.</a> World's Poultry Science Association Proceedings. , (2010).</li><li>Lucena, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+motile+sperm+using+the+migration-sedimentation+technique+in+an+in+vitro+fertilization-embryo+transfer+programme.">Recovery of motile sperm using the migration-sedimentation technique in an in vitro fertilization-embryo transfer programme.</a> Human Reproduction. 4 (2), 163-165 (1989).</li><li>Henkel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+Processing+for+IVF.">Sperm Processing for IVF.</a> Clinical Embryology: A Practical Guide. , (2013).</li><li>Sherman, J., Paulson, D., Liu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+glass+wool+filtration+on+ultrastructure+of+human+spermatozoa.">Effect of glass wool filtration on ultrastructure of human spermatozoa.</a> Fertility and Sterility. 36, 643-647 (1981).</li><li>Freund, M., Carol, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+haemocytometer+counts+of+sperm+concentration+in+human+semen.">Factors affecting haemocytometer counts of sperm concentration in human semen.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 8, 149-155 (1964).</li><li>Bakst, M. R., Wishart, G. J., Brillard, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oviducal+sperm+selection,+transport+and+storage+in+poultry.">Oviducal sperm selection, transport and storage in poultry.</a> Poultry Science Review. 5, 117-143 (1994).</li><li>Ahammad, M. U., Okamoto, S., Kawamoto, Y., Nakada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+regular+fluid+secretion+from+the+uterus+of+laying+hens+on+the+longevity+and+fertilization+ability+of+fowl+sperm+in+the+oviduct.">The effects of regular fluid secretion from the uterus of laying hens on the longevity and fertilization ability of fowl sperm in the oviduct.</a> Poultry Science Journal. 1 (1), 13-22 (2013).</li><li>Ahammad, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturational+changes+in+the+survivability+and+fertility+of+fowl+sperm+during+their+passage+through+the+male+reproductive+tract.">Maturational changes in the survivability and fertility of fowl sperm during their passage through the male reproductive tract.</a> Animal Reproduction Science. 128 (1-4), 129-136 (2011).</li><li>Choi, K. H., Emery, D. A., Straub, D. E., Lee, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Percoll+process+can+improve+semen+quality+and+fertility+in+turkey+breeders.">Percoll process can improve semen quality and fertility in turkey breeders.</a> Asian-Australasian Journal of Animal Sciences. 12 (5), 702-707 (1999).</li><li>Chen, M. J., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+two+density+gradient+preparations+for+sperm+separation+for+medically+assisted+conception.">Comparative evaluation of two density gradient preparations for sperm separation for medically assisted conception.</a> Human Reproduction. 14 (3), 759-764 (1999).</li></ol>

Fertilitet inte bara bestämmer lönsamheten för animalisk produktion men fungerar också som ett sätt att naturligt urval av arter för existens. En spermie ultimata funktion är att befrukta en äggcell. I äggledaren av en kvinnlig väljer endast de starkaste spermierna för att säkerställa befruktning av en äggcell23,24. In vitro studier har också visat en nära korrelation mellan kvalitativa spermier drag och befruktning framgång<sup class="x...

Hos ryggradsdjur genomgår manliga könsceller intensiv selektiv tryck; reproduktiv konditionen av en manlig är därför avgörande för att uppnå framgångsrik befruktning. Hanar av någon viss ryggradsdjur arter måste kunna producera spermier i stora mängder och av tillräcklig kvalitet för att tillgodose behovet för befruktning. Spermier celler, som har både en spermier huvudet och en flagellen, är de mest polariserade cellerna i kroppen. De är också mycket heterogen i kvaliteten på spermierna (levande och döda, morfologiskt normala och onormala och orörlig, låg mobil och hög mobil), som avslöjas genom den stora variationen i reproduktiv effektivitet av hanarna. Ju större andelen högkvalitativa spermier, färre till antalet parningar som krävs för att framgångsrikt befrukta en äggcell. Men för att uppnå fertilitet, morfologiskt normala spermier lita på framåtdrivande krafter genereras av deras flagella att nå platsen för befruktning samt att penetrera zona pellucida1 (ZP; i fråga om däggdjur) eller inre perivitelline lager2 (IPVL; i fråga om fåglar och reptiler) av det ägget efter naturlig parning eller artificiell insemination (AI). Att fastställa spermier kvalitet är nödvändigt för användning i assisterad befruktning3 (konst) och urval av avel hanar som ska användas i AI program4. Däremot, framgången för konst enbart förlitar sig på noggrann utvärdering av spermiernas kvalitet. Ett antal laboratorietester har utvecklats för att fastställa funktionella egenskaper hos spermier. De viktigaste parametrarna är spermiernas morfologi, livskraft, rörlighet, capacitation (aviär spermier inte kräver capacitation5), akrosomen reaktion (AR; exocytos och frisläppandet av ett proteolytiskt enzym från akrosomen av spermier huvudet), sperma penetration av ZP eller IPVL och gödsling6,7,8,9,10,11. Åtgärder för fertilitet ensam ger inte en korrekt utvärdering av en spermie befolkningen11gödsla förmåga. Åtgärder av de flera händelser som leder till befruktningen av ett ägg möjliggöra en lämplig representation av enskilda spermatocyter7prestanda.
Den metod som utvecklats för att mäta spermier funktion är primärt artspecifika. Exempelvis i aviär spermier är livskraft, mobilitet och genomträngningen av IPVL de vanligaste parametrarna som används för att bedöma spermier kvalitet8,11,12. Antalet levande spermier i ejakulatet spelar en avgörande roll för överlevnaden av spermier eftersom förekomsten av ett stort antal döda spermier i sädesvätskan påverkar kvaliteten på sperma. Detta förbättrar produktionen av reaktiva syreradikaler i sädesvätskan och orsakar oxidativa skador på levande spermier13. Spermier rörlighet, kapacitet för flagellar rörelse av aviär sperma mot motstånd vid kroppstemperatur, är känd för att spela en direkt roll att föra om gödsling8. Det är väletablerat att mobilitet är positivt korrelerad med fertilitet och är därför en primär faktor för fertilitet8. En mobil spermier måste dock också ha förmåga att genomgå en AR och att penetrera IPVL11. IPVL penetration analyser beaktas för varje spermier som deltar i processen befruktning11.
I tillämpningen av ART, är ejakulat vanligtvis bearbetas för att maximera koncentrationen av hög kvalitet spermier och minimera koncentrationen av låg kvalitet spermier. Efter samlingen av sperma, kan andelen högkvalitativa spermier berikas genom sperma avskiljandetillvägagångssätt vanligen används i både industrins och praxis. Många av dessa förfaranden har utvecklats, alla med respektive fördelar och begränsningar, men alla utnyttja de heterogena karaktären av spermier att samla endast spermier med hög gödning förmåga. Dessa förfaranden omfatta metoder för migrering av spermier, följsamhet kolumn filtrering och täthet lutning centrifugering (DGC)14,15,16,17,18,19 , 20. bland de tillgängliga teknikerna, DGC har befunnits vara mycket enkel, repeterbara, kostnadseffektiv och effektiv isolera den maximala mängden högkvalitativa spermier för användning i konst med målet att maximera chansen för befruktning14 , 15. Dessutom DGC är inte skadliga för spermier cellmembranet. Däremot spermier migreringsmetoder samla endast gradvis mobila spermier18,19, men mängden sperma som samlats in är mycket låg, vilket gör den ineffektiva i att samla in stora mängder spermier18, 20. följsamhet kolumn filtrering är mycket effektiv i filtrering mycket rörliga spermier från sperma17; men tenderar det att vara skadliga för spermier membran20,21.
I DGC tekniken är den vanligaste substraten för att generera täthetlutningen Percoll, som består av kolloidal kiseldioxid partiklar belagd i polyvinylpryrolidone. Percoll täthet lutning centrifugering (PDGC) kan antingen vara kontinuerliga eller diskontinuerliga men en diskontinuerlig toning används oftast för hög kapacitet isolering mycket rörliga spermier13,16,20. I en diskontinuerlig lutning flyter lägre densitet media ovanför högre densitet media, skapa en övertoning som ökar i densitet från toppen till botten av ett koniskt rör. Detta skapar gränser i gränssnittet mellan de två medierna med olika densitet. Effektiviteten i PDGC härleds från två faktorer: 1) framåtdrivande möjligheten för enskilda spermier och 2) spermier celler med hög strukturell integritet tendens att ha en ökad täthet. Spermier med högre rörlighet är bättre på att korsa från lägre densitet media och tränga in i en högre densitet media. Lägre rörlighet spermier är mer benägna att fastna vid gränsen skapad av gränssnittet mellan media med olika densitet. Spermier med hög strukturell integritet och rörlighet tenderar att ha en högre densitet än döda, onormal eller låg mobila sädesceller. När centrifugalkraften används i PDGC, underlättar detta rörligheten för spermier med olika densiteter för att deras respektive plats i övertoningen.
I allmän praxis, efter PDGC utförs, mjuk pelleten spermier med hög fertilitet potentiella längst ned på den koniska rör samlas, och resten ignoreras. En underutnyttjad fördelen med denna teknik är dock dess förmåga att separera sädesceller i flera grupper baserat på skillnaderna i kvalitet. För forskningsändamål möjliggör separation av spermier av grad av kvalitet utnyttja PDGC tekniken studie av spermiernas kvalitet som det avser den fysiologiska, metabolomiska och proteomiska skillnader. Här, siktar vi på att i detalj hur denna teknik kan användas för att avgränsa sperma kvalitet, liksom demonstrera dessa skillnader i kvalitet, med hjälp av tidigare fastställda eosin-nigrosin vitala färgning för livskraft, Accudenz assay för rörlighet och sperma-IPVL interaktion-analysen för genomtränglighet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:824px;" width="825">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Accudenz</td>
			<td style="width:323px;">Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY, USA</td>
			<td style="width:119px;">AN7050</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Percoll&#160;</td>
			<td style="width:323px;">Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:119px;">P7828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Schiff&#8217;s reagent</td>
			<td style="width:323px;">Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:119px;">3952016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TES</td>
			<td style="width:323px;">Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:119px;">T1375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Eosin Y</td>
			<td style="width:323px;">Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:119px;">E4009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nigrosin</td>
			<td style="width:323px;">Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA</td>
			<td align="right" style="width:119px;">198285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ST 40R Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:323px;">Thermo Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td align="right" style="width:119px;">75004524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DU 530 Life Sciences UV/Vis Spectrophotometer</td>
			<td style="width:323px;">Beckman Coulter, Brea, CA, USA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>No catalogue is found</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Olympus IX 71 Inverted Fluorescence and Phase Contrast Microscope</td>
			<td style="width:323px;">Olympus America Inc., PA, USA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>No catalogue is found</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sperm collection of differential quality using density gradient centrifugation

I sexuell reproduktion, en manliga könsceller eller spermie säkringar med en kvinnlig könscell att åstadkomma befruktning. Dock krävs ett stort antal spermier med gödsling förmåga att interagera med en kvinnlig könscell att säkerställa befruktning. Som sådan, är gödsla förmågan av enskilda spermier avgörande för framgångsrik fortplantningen. Densitet gradient centrifugering har använts i flera decennier som en reproducerbar, snabb, effektiv, effektiv och extremt anpassningsbart metod att samla endast högkvalitativa spermier ska användas i assisterad reproduktiv teknologi. De protokoll som vi beskrivs häri fokusera på utnyttjandet av diskontinuerlig Percoll täthet lutning centrifugering (PDGC) tekniken att isolera tre distinkta populationer av tupp spermier av deras kvalitet. Vi kunde samla in låg-, medel- och hög kvalitet spermier. Vi beskriver också reproducerbara protokoll som medför avgörande fertilitet potential av spermier genom att bedöma deras livskraft, rörlighet och genomtränglighet. Insamling av sperma av kvaliteten med PDGC teknik skulle vara användbart för att korrekt och noggrant karakterisera spermier med differentiell fertilitet potentiella.

PDGC tekniken resulterade i distinkt avskiljande av tre lager av sperma av graden av kvalitet över alla parametrar. Spermier separerar i ett högkvalitativt lager under den högsta densitet lösningen, en medelhög kvalitet lager mellan det högre och lägre densitet lösning och en låg kvalitet lager ovanför lägre densitet lösningen. Dessa skillnader i kvalitet är framgår av tydliga skillnader i livskraft (figur 4), rörlighet (fi...

Watch this Scientific Journal Video about Sperm Collection of Differential Quality Using Density Gradient Centrifugation at JoVE.com

Sperm Collection of Differential Quality Using Density Gradient Centrifugation

I detta papper, vi strävar efter att beskriva utförandet av täthet lutning centrifugering tekniken och dess tillämpning i spermier fysiologi forskning.

Spermier samling av differentiell kvalitet med hjälp av täthet lutning centrifugering

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor inom området spermier fysiologi, såsom den kemiska determinates av spermier kvalitet. Den största fördelen med denna teknik är att det är förmågan att separera stora mängder prov efter kvalitet, samt anpassningsförmåga jämfört med alternativa metoder. Även om denna metod kan ge insikt i skillnaderna i spermiekvalitet, kan den också tillämpas på andra prover såsom blandade celltyper eller subcellulära komponenter med olika tätheter.Till att börja med gör två 3 milliliter Percoll utspädningar i två separata rör. I ett rent provrör späds 1 milliliter spermaprov med 2 milliliter PBS. Rör den försiktigt för att blanda lösningen.Tillsätt 3 milliliter av den lägre densiteten Percoll sollution till ett sterilt koniskt rör. Därefter försiktigt pipettera 3 milliliter av den högre densiteten Percoll lösning under den lägre densiteten Percoll lösning. Medan du lutar det koniska röret i 45 graders vinkel, pipetter 3 milliliter av det utspädda spermaprovet ovanpå Percoll densitet gradient.Efter att ha förberett ett tomt rör, centrifug båda rören vid 1500 Gs i 20 minuter. Försäkra att tre distinkta lager av sperma har bildats i badkaret efter centrifugeringen. Med hjälp av en pipett samla de tre skikten av sperma, börjar med det översta lagret, följt av det mellersta lagret, och slutar med den hårda pelleten i botten av röret.Överför vart och ett av skikten till ett sterilt mikrocentrifugrör. Späd vart och ett av spermaproverna med 1,5 milliliter PBS och centrifugerna proverna vid 1500 Gs i tio minuter. Slutligen häll av supernatanten och rekonstruera pellets med motilitetsbuffert.I detta protokoll användes Percoll densitet gradient centrifugation teknik, eller PDGC, för att separera ett spermaprov i tre distinkta lager. Spermier separerar till ett skikt av hög kvalitet under den högre densitetslösningen, ett lager av medelhög kvalitet mellan de högre och lägre densitetslösningarna och ett lågkvalitetsskikt ovanför lösningen med lägre densitet. Dessa skillnader i spermiekvalitet framgår av skillnader i lönsamhet, rörlighet, och penenerbarhet.Medan du försöker detta förfarande, Det är viktigt att komma ihåg att prover måste bringas till rumstemperatur. Framgången för PDGC är beroende av noggrann förberedelse av gradienten samt noggrann insamling av de isolerade skikten. Efter dets utveckling banade denna teknik vägen för vår forskning inom spermieperdiomik för att utforska bio markörer för fertilitet hos fågelarter.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Biology

Unit 1

Introduction to Separation Methods

SCIENTISTS IN ACTION

Harvesting Sperm and Artificial Insemination of Mice

Skörd sperma och artificiell insemination av Möss

Rodents of the genus Peromyscus (deer mice) are the most prevalent native North American mammals.  Peromyscus species are used in a wide range of research ...

DNA Extraction from 0.22 &mu;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

DNA Extraction from 0.22 ÃƒÅ½Ã‚Â¼M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

DNA-extraktion från 0,22 mikroM Sterivex Filter och cesiumklorid densitetsgradient Centrifugering

This method is used to extract high molecular weight genomic DNA from planktonic biomass concentrated on 0.22 &mu;M Sterivex filters that have been ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

In vivo Centrifugering av Drosophila embryon

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates

Beredning av kvalitet Inositol Pyrophosphates

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the IÃƒâ€šÃ‚Â·Cryo Kit

Mus Spermier Frysförvaring and Recovery med I · Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

Fastställande av protein-ligand interaktioner Använda Differential Scanning fluorimetri

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Isolering av Intakt Mitokondrier från skelettmuskulatur genom differentialcentrifugering för Högupplösta respirometri Mätningar

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Avian Semen Collection by Cloacal Massage and Isolation of DNA from Sperm

Aviär seminstation av Svabbprover Massage och isolering av DNA från spermier

Collection of semen may be useful for a wide range of applications including studies involving sperm quality, sperm telomere dynamics, and epigenetics. ...

Fish Sperm Assessment Using Software and Cooling Devices

Fisk spermier bedömning använder programvara och kylanordningar

For gamete quality evaluation, there are innovative, rapid, and quantitative techniques that can provide useful data for aquaculture. Computerized systems ...

Field Identification of Matricaria chamomilla using a Portable qPCR System

Field Identification of Matricaria chamomilla using a Portable qPCR System

Fält Identifiering av Matricaria chamomilla med hjälp av en Bärbar qPCR System

Quality control in botanical products begins with the raw material supply. Traditionally, botanical identification is performed through morphological ...