Name: behavioral and physiological analysis in a zebrafish model of epilepsy
Uploaded: 2021-10-19T13:00:00
Duration: 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Behavioral And Physiological Analysis In A Zebrafish Model Of Epilepsy at JoVE.com

Vi vil gerne takke personalet på ICM's elektrofysiologiplatform, hvor neurofysiologiforsøgene blev udført. Vi takker også Anca Marian for teknisk hjælp. SC blev støttet af Trampolin grant #21488. EK blev støttet af AFM Grant # 18469 og ERC Consolidator Grant (ALS-Networks). HC blev støttet af ph.d.-priser fra Fondation pour la Recherche Médicale (PLP20141031462) og ARSLA. For AD og RM blev dette arbejde støttet af tre bevillinger fra den rumænske nationale myndighed for videnskabelig forskning og innovation, CNCS-UEFISCDI (projektnumre PN-III-P4-ID-PCE-2016-0010, PN-III-P2-2.1-PED-2016-0007 og COFUND-NEURON-NMDAR-PSY), et tilskud fra EU's Horisont 2020 forsknings- og innovationsprogram – tilskudsaftale nr. 668863-SyBil-AA og et nationalt videnskabsfondstilskud NSF-IOS-1656830 finansieret af den amerikanske regering.

Forsøgsprocedurerne blev godkendt af de nationale og institutionelle etiske komitéer.
1. Forbigående knock-down af DEPDC5 Gene i Zebrafish Embryo
<ol><li>Udarbejdelse af værktøj:
	<ol>
<li>Forbered silicium elastomer-belagt injektion Petriskåle: Bland sættets bund- og hærdemiddel (se materialetabel)i et 10:1-forhold. Fyld en 35 mm Petriskål halvvejs med blandingen. Vent på, at silicium hærder, før du bruger det (dette kan tage flere dage).</li>
		<li>Klargør 1,2 mmol/L lageropløsninger af antisense morpholino oligonucleotider (AMO; se Materialetabel). Der tilsættes 250 μL sterilt vand til 300 nmolelyfiliseret AMO for at opnå en 1,2 mmol/L lageropløsning. Ved fuldstændig opløsning opvarmes hætteglassene i 5 min ved 65 °C. Vortex kort. Forsegl rørhætten med en plastikfilm (se Materialebord).</li>
		<li>Til kontrolredningsforsøg skal der udarbejdes et udtryk plasmid, der indeholder depdc5's menneskelige cDNA (se Materialetabel),der er klonet i pCS2-rygraden eller et lignende zebrafiskkompatibelt udtryk plasmid. Som en negativ kontrol blev en mutation, der forårsagede et tidligt stop codon (p.Arg487*), introduceret i cDNA.</li>
		<li>Tilbered embryovand: 0,06 g/L akvariesalt (se Materialetabel)i omvendt osmosevand + 0,5 mg/L methylenblåt.</li>
		<li>Dagen for injektionen forberedes mikroinjektionsborosilicate glasnåle ved hjælp af en puller (se Materialetabel). Fastlæg passende temperaturindstillinger på nåletrækkeren. Brug en 10 cm lang, 1/0,5 OD/ID mm borosilicat glas kapillær til at generere to ~ 5 cm kapillærer med tynde spidser med en længde på ca 1 cm.</li>
		<li>Hvis spidsen af nålene er meget fin, forhindrer udslyngning af opløsningen, bryde den allersidste ende af den tilspidsede spids ved hjælp af sammentrækninger under et mikroskop.</li>
		<li>Lige før injektionen skal du forberede de arbejdsløsninger, der er af AMOs. Forbered altid en frisk løsning for at sikre reproducerbarheden af resultaterne. Opvarm AMO-lagerglassene ved 65 °C i 5 min. Der fremstilles en 5 μL-injektionsprøve, der indeholder fast grønt farvestof (0,02 % endelig koncentration, se Materialetabel) og AMO fortyndet ved arbejdskoncentrationen i vand.</li>
		<li>Bestem arbejdskoncentrationen af AMO empirisk for hvert gen ved hjælp af en dosisresponskurve. Arbejdskoncentrationen repræsenterer en koncentration, hvor AMO er effektiv til at nedbryde genet uden at forårsage generel toksicitet, såsom grove morfologiske defekter. Typisk vil AMO-arbejdskoncentrationerne være i en rækkevidde på 0,2 mmol/L til 1 mmol/L (0,4 mmol/L blev bestemt som den effektive koncentration for denne undersøgelse18). Indsprøjt kontrol Mismatch morpholino i samme koncentration som den effektive AMO.</li>
		<li>Hvirvle rørene og centrifuge kort at bringe dråberne til bunden af rørene.</li>
		<li>Til redningsforsøg skal der forberedes en 5 μL-injektionsprøve med AMO fortyndet ved arbejdskoncentrationen og cDNA-udtrykket plasmid fortyndet i vand til en endelig koncentration, der skal bestemmes empirisk. For udtryk for DEPDC5 og den negative kontrolplasmid var 100 ng/μL effektiv til fænotypisk redning.</li>
	</ol></li>
	<li>Embryopræparat:
	<ol>
<li>Dagen før mikroinjektionen blev zebrafiskparingstanke sat op. Morgenen af injektionen, fjerne dividers at muliggøre gydning. Saml æggene i 100 mm Petriskåle fyldt med embryovand ved hjælp af en fin sigte. Indsprøjt inden for 20-30 minutter fra indsamling, mens æggene er på den ene celle fase.</li>
		<li>Vælg 60-80 æg med en plastik Pasteur pipette og arranger dem i siliciumbelagt petriskål til injektion. Siliciumoverfladen forhindrer æggene i at glide under injektionerne. Fjern det meste af embryovandet, så lige nok til at dække æggene halvvejs.</li>
	</ol></li>
	<li>Mikroinjections:<ol>
<li>Fyld en glasnål med injektionsopløsning. Anbring nålen lodret i et af de rør, der indeholder injektionsopløsningen, så den nederste ende af nålen rører ved opløsningen. Vent flere minutter, indtil den farvede injektionsopløsning stiger ved kapillaritet og er synlig på spidsen af nålen.</li>
		<li>Monter den fyldte nål på mikroinjektorens injektionshåndtag (se Materialetabel).</li>
		<li>Tænd for luftkompressoren, og juster trykindstillingen for at generere en injektionsvolumen på ~2 nL.</li>
		<li>For at beregne mængden af den injicerede opløsning skal du placere en dråbe mineralsk olie på et mikrotom dias. Indsprøjt den farveholdige opløsning ved hjælp af de indstillede tryk- og tidsparametre. Mål diameteren af den injicerede væskekugle, og beregn det samlede volumen ved hjælp af formlen Volume=4/3*π*(d/2)3, hvor d=den målte diameter af den injicerede bolus.</li>
		<li>Ved hjælp af en dissekere kikkert mikroskop med en 4X forstørrelse, injicere æggene i enkelt celle fase ved at passere gennem chorion og æggeblomme, og projicere opløsningen direkte i cellen.</li>
		<li>De injicerede embryoner opsamles i en 100 mm petriskål med embryovand, mærkes fadet og inkuberes ved 28 °C.</li>
		<li>Sørg for, at inkubatortemperaturen er stabil over tid, da embryonernes udviklingshastighed er termofølsom. For eksempel vil væksten blive accelereret ved højere temperaturer, og udviklingsstadiet er afgørende for korrekt vurdering af fænotypen24.</li>
		<li>Kontroller æggenes kvalitet 6-8 timer efter injektion og fjern døde og ubefrugtede embryoner ved hjælp af en plast pasteur pipette.</li>
		<li>Næste morgen, tælle og fjerne døde embryoner i hver skål med en plastik Pasteur pipette.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Adfærdsanalyse
<ol><li>Global aktivitetsanalyse på 28 hkf:
	<ol>
<li>Udfør testen om eftermiddagen dagen efter mikroinjektion (28 hkf), hvilket sikrer, at det tidspunkt på dagen, hvor testen udføres, er konsistent over eksperimenter for at udføre gyldig statistisk analyse, da embryonernes udvikling er meget hurtig.</li>
		<li>Fyld en 35 mm skål (prøveskål) med embryovand, og lad det varme op i inkubatoren (28 °C) i mindst 15 minutter, inden testen påbegyndes.</li>
		<li>Der placeres et plastnetgitter (1,2x1,2 mm), der er skåret i størrelse, i bunden af prøveskålen.</li>
		<li>Få en anden eksperimentator til at randomisere rækkefølgen af test af embryonerne og maskere navnene på de betingelser, der skal testes.</li>
		<li>Sørg for, at dødeligheden ikke ændrer sig mellem forholdene og sammenlignet med ikke-injicerede embryoner for at sikre fænotypens specificitet. Procentdelen af døde embryoner under alle forhold må ikke overstige 10-13%18.</li>
		<li>Placer 10-12 embryoner stadig inden for deres chorion på plastnet ved hjælp af en plastik Pasteur pipette. Fyld prøveskålen med nok fostervand til at holde embryonerne nedsænket, men ikke flydende. Hvis det er nødvendigt, skal du flytte embryonerne med omhu ved hjælp af en plastikspids for at placere dem på gitteret.</li>
		<li>Ved hjælp af et videokamera (se Materialetabel), der er fastgjort til et dissektionsmikroskop, skal du registrere den spontane spoleaktivitet i en defineret periode (10-20 min lange videoer er normalt tilstrækkelige til at opnå repræsentative prøver af aktivitetsudbrud til kvantificeringen)</li>
		<li>Returner embryonerne til deres respektive skål og læg dem tilbage i inkubatoren. Gentag eksperimentet med så mange embryoner som nødvendigt for hver tilstand (som bestemt af en 90% effektanalyse).</li>
		<li>Hvis du vil analysere den samlede spontane bevægelse, skal du bruge et ZebraLab-system (se Materialetabel). Upload den optagede video ved hjælp af aktivitetskvantificeringsmodulet og design sporingsarenaerne omkring hvert embryo efter behov. Indstil fryse- og burst-tærsklen til henholdsvis 10 og 50.</li>
		<li>Kør den automatiserede videoanalyse, som kvantificerer den samlede aktivitet inden for hver af de definerede arenaer, gendan derefter datasættet som et regneark og udfør analysen ved hjælp af en dataanalysesoftware.</li>
	</ol></li>
	<li>Touch-Evoked-Escape-Response (TEER) ved 48 hk:
	<ol>
<li>Udfør testen om morgenen to dage efter injektionen (48 timer efter befrugtningen).</li>
		<li>Mindst 2 timer før test, dechorionate embryonerne ved hjælp af fine sammentrækninger. Sørg for, at tidspunktet på dagen for dechorionation og adfærdstest er konsekvent over eksperimenter.</li>
		<li>Fyld en 130 mm skål (prøveskål) med fostervand, og lad det varme op i inkubatoren (28 °C) i mindst 15 minutter, inden testen påbegyndes.</li>
		<li>Tæl og fjern døde og morfologisk deforme larver. Registrer tallene for hver betingelse.</li>
		<li>Få en anden eksperimentator til at randomisere rækkefølgen og kodificere navnene på de betingelser, der skal testes.</li>
		<li>Monter kameraet (se Materialebord) over prøveskålen og sørg for, at hele testretten er inden for synsfeltet. Hvis du placerer en lineal inden for synsfeltet, kan der kalibreres en intern kalibrering for afstanden.</li>
		<li>Med en plastik Pasteur pipette, sætte et embryo i midten af test parabol og begynde optagelsen ved hjælp af en erhvervelse sats på 30 fps.</li>
		<li>Med en fin plastikspids skal du røre lidt på embryoets hale med en svirpbevægelse.</li>
		<li>Stop optagelsen, når larven har afsluttet sin bevægelse.</li>
		<li>Fjern embryoet fra prøveskålen, og læg det i en ny skål fyldt med embryovand. Gentag testen med så mange embryoner som nødvendigt for hver tilstand (som bestemt af en 90% effektanalyse).</li>
		<li>Returner embryonerne til deres oprindelige skål og læg dem tilbage i inkubatoren.</li>
		<li>Hvis du vil analysere parametrene for svømmeadfærden, skal du indlæse den optagede video til ImageJ-analysesoftware. Download og installer plugin til manuel sporing af ImageJ (se Materialetabel). Start plugin ved at vælge Værktøjer | Plugin | Manuel sporing i menuen .</li>
		<li>I dialogvinduet skal du introducere billedets kalibrerede skala. Hvis du medtager en lineal i kamerafeltet, konverteres cm til pixel.</li>
		<li>Vælg Tilføj spor og starte bane sporing ved at klikke på billedet af zebrafisk larve i den første ramme. Rammerne går automatisk frem med hvert punkt, der føjes til sporingen.</li>
		<li>Fortsæt med at spore bevægelsen indtil slutningen af svømmeepisoden.</li>
		<li>Vælg Slutspor i sporingsvinduet, hent X-Y-koordinaterne, og beregn den samlede afstand, hastighed og drejevinkel.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Elektrofysiologisk analyse
<ol><li>Reagens og værktøjsforberedelse:
	<ol>
<li>1% agarose i fostervand (se punkt 1.1.4). Væsken er agarose i mikrocentrifugrør, og opbevar disse på en varmeblok ved 42 °C for at forhindre, at der opstod hærdning.</li>
		<li>Indbered optagelsesopløsningen (i mmol/L): NaCl 134, KCl 2.9, CaCl2 2.1, MgCl2 1.2, glucose 10, HEPES 10, pH 7.8.</li>
		<li>Træk borosilicatglasmikpipetter med en spidsåbning på 1,5-2 μm (5-6 Mm2·kg·s −3· En−2 modstand) upoleret.</li>
	</ol></li>
	<li>Forberedelse af zebrafisk larver til elektrofysiologi:
	<ol>
<li>Placer fisken i en glasbundet petriskål (se Materialebord) og fjern overskydende ekstracellulære medier for at sikre, at fisken bringes så tæt på dækslet som muligt.</li>
		<li>Brug en plastik Pasteur pipette, tilsæt varm væske agarose på og omkring larven. Brug lige nok agarose til at dække fisken. Mens agarose hærder, skal du bruge fine sammenkædning til at orientere fisken i en lige position, ventral side ned, i midten af skålen.</li>
		<li>Der tilsættes 2 gtL af optagelsesopløsningen, der indeholder 10 μM Pancuroniumbromid (se Materialetabel) for at blokere neuromuskulær transmission. Tilsætning af paralyzeren er nødvendig for at eliminere genstande på grund af små bevægelser under optagelserne.</li>
	</ol></li>
	<li>Elektrofysiologisk optagelse
	<ol>
<li>Fyld mikropipetten med optagelsesopløsningen.</li>
		<li>Med plasteret klemme forstærker (se Tabel af materialer)i spænding klemme konfiguration, måle elektrode modstand i badet for at bekræfte den korrekte værdi.</li>
		<li>Ved hjælp af et 20x-mål skal du placere larvens hoved i det centrale synsfelt og sænke mikropipetten for at nå registreringspositionen i hjernen inden for det optiske tectum.</li>
		<li>Skift plasterklemmeforstærkeren til den aktuelle klemme, og fastgør holdestrømmen til 0 mA.</li>
		<li>Ved hjælp af et low-pass filter på 1 kHz, en anskaffelseshastighed på 1 kHz og en digital gevinst på 10, registrere spontan aktivitet i 60 min til bestemmelse af baseline aktivitetsniveauer.</li>
		<li>Efter 1 h basisregistrering tilsættes 200 μL pentylentetrazol (PTZ, se materialetabel)opløsning 300 mmol/L til badet for en endelig koncentration på 20 mmol/L PTZ.</li>
		<li>Registrer neuronal aktivitet i PTZ i yderligere 120 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Bestemmelse af afpolariseringshændelse
	<ol>
<li>Feltoptagelseshændelser har meget langsom dynamik (interessefrekvenser ligger i intervallet 0,005-0,2 s-1). Filtrer derfor signalet med et lavt gennemløb (Butterworth 5. ordre LPF ved 100 s-1) for at undgå aliasing. Delsal de registrerede spændingsdata fra anskaffelsesrammen (i dette tilfælde 1 ks-1) ned til 250 s-1 (RAW SIGNAL).</li>
		<li>Hvis du vil identificere tidsstempletter for hver depolariseringshændelse, skal du bruge et DETE-SIGNAL, som er en højpasfiltreret version af det optagede signal (Butterworth 1. ordre HPF ved 0,01 s-1).</li>
		<li>Ved at eliminere lavfrekvente komponenter kan påvisning af depolariseringshændelser udføres ved hjælp af en simpel for tærskelmetode. Brug en fast tærskel for støjfjernelse og hændelsesregistrering (der blev brugt 0,3 mV til denne undersøgelse).</li>
		<li>Karakterisere afpolariseringshændelsen med en række tærskler, der forekommer med tidsintervaller mindre end 4 s. Beregn starten og slutningen af depolariseringshændelsen som bestemt ud fra fortløbende sekvenser af tærskelovergange. Hændelser, der er kortere end 40 ms, kan kasseres som støj.</li>
		<li>Beregn amplituden af hændelserne i det ufiltrerede (RAW SIGNAL) for at eliminere fejl på grund af effekten af lavpasfiltrering på toppen af hændelsen. Vælg afpolariseringsbølgen fra det rå signal ved hjælp af de tidsstempletter, der er bestemt i det filtrerede signal. Mål amplituden som forskellen mellem maksimums- og minimumsværdierne for den bølge, der er valgt ud fra råsignalet. BEMÆRK: Scriptfilerne til at udføre trin 3.4 — Bestemmelse af afpolariseringshændelse — og for at hente figur 1 leveres som supplerende fil, der er vedhæftet denne artikel.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Kabashi, E., Champagne, N., Brustein, E., Drapeau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+the+swim+of+things:+Recent+insights+to+neurogenetic+disorders+from+zebrafish.">In the swim of things: Recent insights to neurogenetic disorders from zebrafish.</a> Trends in Genetics. 26 (8), 373-381 (2010).</li><li>Baxendale, S., van Eeden, F., Wilkinson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Power+of+Zebrafish+in+personalised+medicine.">The Power of Zebrafish in personalised medicine.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. , (2017).</li><li>Baraban, S. C., Taylor, M. R., Castro, P. A., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pentylenetetrazole+induced+changes+in+zebrafish+behavior,+neural+activity+and+c-fos+expression.">Pentylenetetrazole induced changes in zebrafish behavior, neural activity and c-fos expression.</a> Neuroscience. , (2005).</li><li>Cunliffe, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+zebrafish+toolkit+for+investigating+the+pathobiology+of+epilepsy+and+identifying+new+treatments+for+epileptic+seizures.">Building a zebrafish toolkit for investigating the pathobiology of epilepsy and identifying new treatments for epileptic seizures.</a> Journal of Neuroscience Methods. , (2016).</li><li>Griffin, A., Krasniak, C., Baraban, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+epilepsy+treatment+through+personalized+genetic+zebrafish+models.">Advancing epilepsy treatment through personalized genetic zebrafish models.</a> Progress in Brain Research. , (2016).</li><li>Griffin, A., Hamling, K. R., Knupp, K., Hong, S. G., Lee, L. P., Baraban, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clemizole+and+modulators+of+serotonin+signalling+suppress+seizures+in+Dravet+syndrome.">Clemizole and modulators of serotonin signalling suppress seizures in Dravet syndrome.</a> Brain. , (2017).</li><li>Orellana-Paucar, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+from+zebrafish+and+mouse+models+on+the+activity+and+safety+of+ar-turmerone+as+a+potential+drug+candidate+for+the+treatment+of+epilepsy.">Insights from zebrafish and mouse models on the activity and safety of ar-turmerone as a potential drug candidate for the treatment of epilepsy.</a> PLoS ONE. , (2013).</li><li>Baxendale, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+compounds+with+anti-convulsant+properties+in+a+zebrafish+model+of+epileptic+seizures.">Identification of compounds with anti-convulsant properties in a zebrafish model of epileptic seizures.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. , (2012).</li><li>Bar-Peled, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tumor+suppressor+complex+with+GAP+activity+for+the+Rag+GTPases+that+signal+amino+acid+sufficiency+to+mTORC1.">A tumor suppressor complex with GAP activity for the Rag GTPases that signal amino acid sufficiency to mTORC1.</a> Science. 340 (6136), 1100-1106 (2013).</li><li>Ishida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+DEPDC5+cause+autosomal+dominant+focal+epilepsies.">Mutations of DEPDC5 cause autosomal dominant focal epilepsies.</a> Nature Genetics. , (2013).</li><li>Dibbens, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+DEPDC5+cause+familial+focal+epilepsy+with+variable+foci.">Mutations in DEPDC5 cause familial focal epilepsy with variable foci.</a> Nature Genetics. , (2013).</li><li>Baulac, S., Weckhuysen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DEPDC5-Related Epilepsy. GeneReviews®. , (1993).</li><li>Picard, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DEPDC5+mutations+in+families+presenting+as+autosomal+dominant+nocturnal+frontal+lobe+epilepsy.">DEPDC5 mutations in families presenting as autosomal dominant nocturnal frontal lobe epilepsy.</a> Neurology. , (2014).</li><li>Teng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+zebrafish+lgi1a+results+in+abnormal+development,+brain+defects+and+a+seizure-like+behavioral+phenotype.">Knockdown of zebrafish lgi1a results in abnormal development, brain defects and a seizure-like behavioral phenotype.</a> Human Molecular Genetics. , (2010).</li><li>Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+in+Scn1a+zebrafish+mutant+identifies+clemizole+as+a+potential+Dravet+syndrome+treatment.">Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment.</a> Nature Communications. , (2013).</li><li>Suls, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+loss-of-function+mutations+in+CHD2+cause+a+fever-sensitive+myoclonic+epileptic+encephalopathy+sharing+features+with+dravet+syndrome.">De novo loss-of-function mutations in CHD2 cause a fever-sensitive myoclonic epileptic encephalopathy sharing features with dravet syndrome.</a> American Journal of Human Genetics. , (2013).</li><li>Grone, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epilepsy,+behavioral+abnormalities,+and+physiological+comorbidities+in+syntaxin-binding+protein+1+(STXBP1)+mutant+zebrafish.">Epilepsy, behavioral abnormalities, and physiological comorbidities in syntaxin-binding protein 1 (STXBP1) mutant zebrafish.</a> PLoS ONE. , (2016).</li><li>de Calbiac, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DEPDC5+knockdown+causes+mTOR-dependent+motor+hyperactivity+in+zebrafish.">DEPDC5 knockdown causes mTOR-dependent motor hyperactivity in zebrafish.</a> Annals of Clinical and Translational Neurology. , (2018).</li><li>Panchaud, N., P&#233;li-Gulli, M. P., De Virgilio, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acid+deprivation+inhibits+TORC1+through+a+GTPase-activating+protein+complex+for+the+Rag+family+GTPase+Gtr1.">Amino acid deprivation inhibits TORC1 through a GTPase-activating protein complex for the Rag family GTPase Gtr1.</a> Science Signaling. , (2013).</li><li>Lim, K. R. Q., Maruyama, R., Yokota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eteplirsen+in+the+treatment+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Eteplirsen in the treatment of Duchenne muscular dystrophy.</a> Drug Design, Development and Therapy. , (2017).</li><li>Kok, F. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+genetic+screening+reveals+poor+correlation+between+morpholino-induced+and+mutant+phenotypes+in+zebrafish.">Reverse genetic screening reveals poor correlation between morpholino-induced and mutant phenotypes in zebrafish.</a> Developmental Cell. , (2015).</li><li>Rossi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+compensation+induced+by+deleterious+mutations+but+not+gene+knockdowns.">Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns.</a> Nature. , (2015).</li><li>Stainier, D. Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+morpholino+use+in+zebrafish.">Guidelines for morpholino use in zebrafish.</a> PLoS Genetics. , (2017).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental dynamics an official public. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>M&#248;ller, R. S., Dahl, H. A., Helbig, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+next+generation+sequencing+to+epilepsy+genetics.">The contribution of next generation sequencing to epilepsy genetics.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. , (2015).</li><li>Allen, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+mutations+in+epileptic+encephalopathies.">De novo mutations in epileptic encephalopathies.</a> Nature. , (2013).</li><li>Dunn, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+sequencing+methods+for+diagnosis+of+epilepsy+syndromes.">Next generation sequencing methods for diagnosis of epilepsy syndromes.</a> Frontiers in Genetics. , (2018).</li><li>Grone, B. P., Baraban, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+in+epilepsy+research:+Legacies+and+new+directions.">Animal models in epilepsy research: Legacies and new directions.</a> Nature Neuroscience. , (2015).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+characterization+of+an+antisense+knockdown+zebrafish+model+of+Dravet+syndrome:+Inhibition+of+epileptic+seizures+by+the+serotonin+agonist+fenfluramine.">Pharmacological characterization of an antisense knockdown zebrafish model of Dravet syndrome: Inhibition of epileptic seizures by the serotonin agonist fenfluramine.</a> PLoS ONE. , (2015).</li><li>Swaminathan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-canonical+mTOR-Independent+Role+of+DEPDC5+in+Regulating+GABAergic+Network+Development.">Non-canonical mTOR-Independent Role of DEPDC5 in Regulating GABAergic Network Development.</a> Current Biology. , (2018).</li><li>Samarut, &. #. 2. 0. 1. ;., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#947;-Aminobutyric+acid+receptor+alpha+1+subunit+loss+of+function+causes+genetic+generalized+epilepsy+by+impairing+inhibitory+network+neurodevelopment.">&#947;-Aminobutyric acid receptor alpha 1 subunit loss of function causes genetic generalized epilepsy by impairing inhibitory network neurodevelopment.</a> Epilepsia. , 2061-2074 (2018).</li><li>Turrini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+mapping+of+neuronal+activity+during+seizures+in+zebrafish.">Optical mapping of neuronal activity during seizures in zebrafish.</a> Scientific Reports. , (2017).</li><li>Rosch, R. E., Hunter, P. R., Baldeweg, T., Friston, K. J., Meyer, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+and+dynamic+causal+modelling+reveal+brain-wide+changes+in+effective+connectivity+and+synaptic+dynamics+during+epileptic+seizures.">Calcium imaging and dynamic causal modelling reveal brain-wide changes in effective connectivity and synaptic dynamics during epileptic seizures.</a> PLoS Computational Biology. , (2018).</li><li>Baraban, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forebrain+Electrophysiological+Recording+in+Larval+Zebrafish.">Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2013).</li><li>Afrikanova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+the+Zebrafish+Pentylenetetrazol+Seizure+Model:+Locomotor+versus+Electrographic+Responses+to+Antiepileptic+Drugs.">Validation of the Zebrafish Pentylenetetrazol Seizure Model: Locomotor versus Electrographic Responses to Antiepileptic Drugs.</a> PLoS ONE. , (2013).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Epilepsi er en kompleks neurologisk sygdom, der byder på en bred vifte af ætiologier, der begynder at blive belyst med fremkomsten af genetisk sekventering teknologier25,26,27. Alsidige dyremodeller er afgørende for en effektiv translationel strategi, der vil give både indsigt i de patologiske mekanismer af genetisk forbundne epilepsier, samt målrettede behandlinger for de forskellige former for denne tilstand. Zebrafisk modeller har været meget effektive til at reproducere store træk ved epilepsi og giver pålidelige udlæsninger til anti-epileptisk lægemiddelscreening5,28. Spontane anfald kan påvises i genetisk modificerede zebrafisk15,29,30,31 og neurofysiologiske analyser i disse modeller28 har bekræftet det neuronale grundlag for den epileptiske-lignende adfærd32,33. Små zebrafisk larver er modtagelige for kemiske skærme i 96-brønds format ved hjælp af automatiseret påvisning af enkel adfærd, såsom spontan svømning, som giver mulighed for hurtig påvisning af potentielle terapier.
DEPDC5 knock-down modellen, der præsenteres her, opnås ved injektion af AMO i zebrafiskembrynet for at blokere genekspression under udvikling. Denne model præsenterer flere keystone fænotypiske funktioner i løbet af forskellige tidspunkter af larve udvikling, som kan bruges som indikatorer for terapi effektivitet under en kemisk eller genetisk screening protokol. Den AMO-medierede gen knock-down er en kraftfuld teknik, der viser fordele i forhold til kemisk inducerede beslaglæggelsesmodeller, da det specifikt er rettet mod ekspressionen af et interessegen, hvilket gør det muligt at identificere de underliggende patogene mekanismer udløst af en genetisk mutation. Kemiske inducere, som ikke desto mindre er potente værktøjer til lægemiddelscreeninger, kan fungere gennem flere cellulære veje, der måske ikke altid er relevante for den genetiske mutation, der undersøges. Mens AMO injektion er i sig selv en simpel teknik, når mestres af experimenter, det præsenterer også en række begrænsninger. Injektionerne skal udføres på et celletrin embryo; i vores hænder øgede injektioner på senere stadier i høj grad fænotypens variabilitet. Dette begrænser den tid, der er til rådighed til injektion. Derfor er en strategi for at generere æg til injektion i en tidssekvens nyttig. Vi bruger rutinemæssigt 4-5 kors, som vi åbner med 15-20 minutters mellemrum, så injektion af en kobling, før vi får den næste. Endvidere skal man sørge for at vurdere fænotypen på samme tid punkter mellem forskellige eksperimenter, som stereotype adfærd udvikler sig hurtigt i løbet af de første dage af udviklingen. Mængden og koncentrationen af AMOs skal også kontrolleres omhyggeligt, da generel toksicitet på grund af injektion af store mængder vil maskere den specifikke fænotype. De forskellige kontroller, der præsenteres i indledningen, er afgørende for at bestemme den rigtige injektionsdosis og den tilsvarende fænotype.
Feltoptagelser af larve zebrafiskhjernen er et nyttigt værktøj til at undersøge de skadelige virkninger af genetiske mutationer, der er involveret i forskellige hjernesygdomme på den globale neuronale aktivitet34. Depolariseringshændelser, der ses under disse eksperimentelle forhold , er en etableret metode til vurdering af elektrofysiologiske virkninger af lægemidler under forskellige epileptiske tilstande15,35. Vurderingen af disse virkninger er imidlertid for det meste sket kvalitativt snarere end kvantitativt og har en subjektiv observatør som aktør i analysen. Her udvikler vi en automatisk detektionsstrategi, der objektivt kan kvantificere hastigheden af depolariseringer, deres amplitud og varighed, og kan evaluere udviklingen af disse parametre over tid eller med forskellige genetiske eller farmakologiske interventioner.
De repræsentative resultater, der præsenteres her, viser depdc5's forventede feltaktivitet i DEPDC5-knock-down genetisk model i forhold til en Mismatch-kontrol i 4-6 dpf zebrafisk før og efter anvendelsen af PTZ til at indføre epileptiform-lignende elektrikeraktivitet. Tidligere har vi vist en betydelig stigning i den basale aktivitet i DEPDC5 knockdown tilstand18. Her viser vi, at reaktionen af disse to betingelser til PTZ, en kemisk epileptiform aktivitet inducer, har en lignende bane i tide, begyndende med en periode med relativt lav frekvens, høj amplitude depolarization begivenheder og fortsætter med en periode med højere frekvens, lavere amplitude depolarization begivenheder. Feltregistreringshændelser har langsom dynamik (interessefrekvenser ligger i intervallet 0,005-0,2 s-1), derfor bruges både low-pass og high-pass filtre i denne protokol til at isolere interessehændelser. Efter at have elimineret lavfrekvent støj udføres påvisning af depolariseringshændelser ved hjælp af en simpel tærskel. Da statistikken for signalet er stærkt påvirket af tilstedeværelsen af depolariseringshændelser, kunne vi ikke bruge standardafvigelsen af det samlede signal til at bestemme denne tærskel. Variationen af værdien af standardafvigelsen på tværs af datasæt var større end de observerede registreringsstøjniveauer. Derfor brugte vi efter visuel inspektion af sporene en fast værdi af tærsklen på 0,3 mV for at undgå biasing forårsaget af forskellige niveauer af depolariseringsaktivitet.
Den beskrevne protokol giver en standardiseret og enkel metode til evaluering af motorisk adfærd og neuronal feltaktivitet, via ekstracellulær strømspændingsregistrering kombineret med automatisk påvisning af depolariseringshændelser i det optiske tectum, for at karakterisere epileptiformlignende fænotyper i zebrafiskmodeller.

På grund af sin lille størrelse, oviparous udvikling og gennemsigtighed på tidlige stadier af udviklingen, zebrafisk har vist sig som en værdifuld hvirveldyr organisme til modellering af menneskelige sygdomme så forskellige som hjerte-kar-, kræft eller neurologiske lidelser1,2. Zebrafisk kombinerer fordelene ved et hvirveldyr, herunder høj bevarelse af organarkitektur og genetisk kode, med den lille størrelse og lethed af genetisk manipulation af enklere modelorganismer, hvilket letter både grundlæggende undersøgelser og translationelle anvendelser. Især dens amenability til high-throughput automatiseret screening af adfærd og fluorescerende markører af cellulære processer har gjort zebrafisk en særlig attraktiv model for epilepsi forskning. Dette er blevet påvist ved en høj stigning i det sidste årti af antallet af publikationer med kemisk inducerede og / eller genetiske modeller af epilepsi3,4,5 og for nylig rapporter om lovende terapier fremstillet fra kemiske skærme i disse modeller6,7,8.
DEPDC5 er medlem af GATOR1-komplekset, en negativ regulator af mTOR-signalering9. Mutationer i DEPDC5-genet er første gang blevet opdaget i 2013 i probands, der lider af autosomal dominerende fokal epilepsi10,11, og er siden blevet rapporteret i en række kliniske tilstande forbundet med fokale epileptiske manifestationer og fokal kortikale dysplasi12. Langt de fleste rapporterede mutationer forventes at forårsage tab af funktion af genet12, og dette blev formelt påvist for en række DEPDC5 muterede udskrifter, som er målrettet af nonsens medieret mRNA henfald12,13. I enighed resulterer nedslidning af genortologen hos zebrafisk ved hjælp af antisense morpholino oligonucleoides (AMOs) i en række funktioner, der er fælles for epileptiske modeller i denne organisme, herunder hyperaktivitet, svinghjullignende svømning, spontane anfald og forbedret neuronal aktivitet14,15,16,17,18. Interessant, behandling med rapamycin, en hæmmer af mTOR signalering, vendt adfærdsmæssige funktioner i denne model18, understøtter hypotesen om, at DEPDC5 tab-of-funktion kan udløse epilepsi på grund af en fejlregulering af mTOR vej9,19.
Forbigående knock-down af genekspression in vivo ved hjælp af antisense oligonukleoider bærer morpholino modifikation har været et uvurderligt redskab til at studere den rolle, specifikke gener, på lige fod med si / shRNA-baserede teknikker. For nylig har AMO-baserede strategier også fundet kliniske anvendelser, med en første AMO-behandling, der modtager FDA-godkendelse til behandling af Duchenne muskelatrofi i 201620. Selv om det blev rapporteret, at i zebrafisk kan fænotypen af akut AMO-baseret gen knock-down ikke altid korrelere med de konstituerende knock-out-modeller21, men dette kan i det mindste i nogle tilfælde skyldes kompenserende mekanismer, der er forårsaget af konstituerende genetiske modifikationer22. Spørgsmålet om specificitet af AMO-induceret fænotype er imidlertid en ubestridelig bekymring, der skal behandles omhyggeligt i undersøgelser ved hjælp af denne teknologi23. For at sikre specificiteten af den AMO-baserede knock-down fænotype er flere nøglekontroller nødvendige. Disse omfatter en dosis-respons kurve, der gør det muligt at vælge den laveste dosis af AMO effektiv til gen knock-down, undgå samlede toksicitet på grund af indførelsen af et overskud af genetisk materiale. Brugen af en Mismatch AMO, der ikke er rettet mod et bestemt område i genomet, er også nødvendig for at fastsætte en passende dosis og identificere en bestemt fænotype. En anden AMO, der er rettet mod en anden region af samme gen, såsom en splejs-blokerende AMO, er nødvendig for at bekræfte, at fænotypen skyldes knock-down af målgenet. Redning af knock-down fænotype med cDNA af genet, enten den menneskelige ortolog eller en codon-modificeret version af zebrafisk genet, der ikke kan målrettes af AMO, giver et stærkt argument til fordel for fænotype specificitet. Manglende redning med den samme cDNA, der indeholder tab af funktion mutationer (såsom indførelsen af en tidlig stop codons) er et yderligere bevis i denne retning.
Her præsenterer vi en metode til at generere en zebrafisk DEPDC5 tab-of-funktion model og protokollen for adfærdsmæssige phenotyping på 28 og 48 timer efter befrugtning (HPF). Ved 28 hk forårsager DEPDC5 tab af funktion samlet hyperaktivitet, som det fremgår af forbedrede opspolings- og trækninger af embryonerne i chorionen. Et automatiseret bevægelsesdetekteringssystem kan på nuværende tidspunkt bruges til at kvantificere den samlede aktivitet pr. embryo. Med en 48 hk udviser zebrafisk stereotype flugtsvømning som reaktion på berøring. I zebrafisk med nedreguleret udtryk for DEPDC5er svømmebane betydeligt mere tortuous end i kontroller, fisken udviser et "korkskrue" eller "turn-wheel" lignende mønster, svarende til andre rapporterede epilepsimodeller i denne organisme3,4. Elektrofysiologiske optagelser blev opnået i den optiske tectum i zebrafisk larver mellem 4-6 dage efter befrugtning (dpf) og viser en baseline stigning i neuronal aktivitet i DEPDC5 knock-down dyr. Fordelen ved denne model er, at det præsenterer flere fænotypiske funktioner på forskellige tidspunkter, hvilket kan være nyttigt til overvågning og vurdering af effekten af lægemiddelbehandlinger under udvikling.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:751px;" width="750">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:197px;">Agarose</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich, France</td>
			<td style="width:84px;">A9539</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aquarium salt&#160;</td>
			<td>Instant Ocean, Blacksburg, VA</td>
			<td>SS15-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass with filament</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF100-50-10</td>
			<td>OD: 1,5mm, ID: 0,5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Depdc5-atg antisense morpholino</td>
			<td>GeneTools, OR, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>sequence 5&#8217;- TGCCTTCATGGTGACCGTCATTTTA -3&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Depdc5-mis antisense morpholino</td>
			<td>GeneTools, OR, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>sequence 5&#8217;- TGCgTTgATcGTGACCcTgATTTTA -3&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Depdc5-splice antisense morpholino</td>
			<td>GeneTools, OR, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>sequence 5&#8217;- ACATTCCTGTTTCACCATAGATGAT -3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digitizer</td>
			<td>Molecular Devices, CA, USA</td>
			<td>Digidata 1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fast Green Dye</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td>F7258</td>
			<td>Stock solution of 0.2%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass-bottom petri dishes</td>
			<td>Ibidi, Germany</td>
			<td>81218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td>68270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Grasshopper 2 camera</td>
			<td style="width:163px;">FLIR, BC, Canada</td>
			<td>GRAS-03K2M-C</td>
			<td>formerly Point Grey Research</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human wild-type DEPDC5 cDNA</td>
			<td>Dharmacon, France</td>
			<td>NM_001242897.1</td>
			<td>&#160;Accession: BC144291 Clone ID 905</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ software</td>
			<td>NIH, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td>P9333&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matlab software</td>
			<td>MathWorks, MA, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td>S7653&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td>71687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pancuronium bromide&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Alomone Labs</td>
			<td style="width:84px;">P-130</td>
			<td style="width:307px;">Stock solution of 60mM in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parafilm</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td>P7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Patch clamp amplifier</td>
			<td>Molecular Devices, CA, USA</td>
			<td>MultiClamp 700B</td>
			<td>Computer-controled patch clamp amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pClamp10 acquisition software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pentylenetetrazol (PTZ)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td>P6500</td>
			<td>Stock solution of 300mM (dissolved in recording solution)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipette puller</td>
			<td>Narishige, Japan</td>
			<td>PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pneumatic PicoPump&#160;</td>
			<td>WPI, France</td>
			<td>PV 820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sylgard 184 kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich Intl.</td>
			<td>761036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transfer plastic pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td>Z350605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zebralab</td>
			<td>Viewpoint, France</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

behavioral and physiological analysis in a zebrafish model of epilepsy

Epilepsi repræsenterer en af de mest almindelige neurologiske lidelser, der påvirker en anslået 50 millioner mennesker på verdensplan. Nylige fremskridt inden for genetisk forskning har afsløret et stort spektrum af gener impliceret i forskellige former for epilepsi, der fremhæver den heterogene karakter af denne lidelse. Passende dyremodeller er afgørende for at undersøge de patologiske mekanismer, der udløses af genetiske mutationer, der er impliceret i epilepsi, og for at udvikle specialiserede, målrettede behandlinger. I de senere år har zebrafisk vist sig som en værdifuld hvirveldyr organisme til modellering epilepsi, med brug af både genetisk manipulation og eksponering for kendte epileptogenice lægemidler, såsom pentylentetrazol (PTZ), at identificere nye anti-epileptiske therapeutics. Skadelige mutationer i mTOR regulator DEPDC5 har været forbundet med forskellige former for fokal epilepsi og knock-down af zebrafisk ortolog forårsager hyperaktivitet forbundet med spontane beslaglæggelse-lignende episoder, samt forbedret elektrografisk aktivitet og karakteristisk svinghjul svømning. Her beskrev vi den metode, der er involveret i at generere DEPDC5-tabsmodellen og illustrere protokollen til vurdering af motoraktivitet ved 28 og 48 timer efter befrugtning (HPF), samt en metode til registrering af feltaktivitet i zebrafiskoptisk tectum. En illustration af virkningen af det epileptogenice lægemiddel PTZ på neuronal aktivitet over tid er også forudsat.

Figur 1 viser repræsentative spænding spor af 4-6 dpf zebrafisk larve larve ekstracellulære felt optagelser i tilfælde af to genetiske tilstande: Mismatch kontrol og DEPDC5 knock-down. I den oprindelige periode af optagelsen viser DEPDC5 knock-down en højere forekomst af spontane hændelser, mens Mismatch-kontrolelementet viser meget få udsving. Disse aktivitetsmønstre er repræsentative for den betydelige stigning i neuronal aktivitet på grund af depdc5'sfunktionstab , da vi tidligere har rapporteret18. Efter PTZ-programmet viser både Mismatch control og DEPDC5 knock-down et øget antal afpolariseringshændelser. I den første periode efter PTZ-ansøgning (10-60 min) observeres en hastighed på 0,8 hændelser pr. minut i både Mismatch control og DEPDC5 knock-down, hvor de fleste hændelser er af høj amplitude (>1 mV). I sidstnævnte responsperiode (60- 120 min efter PTZ ansøgning), stiger hastigheden af depolarisering begivenheder til omkring 1 begivenhed pr min, og de fleste af begivenhederne er af lav amplitude (≤1 mV).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58837/58837fig1.jpg"> Figur 1: Eksempel spor af feltoptagelser i zebrafisk larver hjernen. (A) Oversigt over 180 min optagelse for en Mismatch kontrol larve og en DEPDC5 Knock-down. Først blev spontan baseline aktivitet registreret, så PTZ blev anvendt i bad (rød bar). (B) Peri-stimulus tid histogrammer af depolarisering begivenheder for Mismatch kontrol og DEPDC5 knock-down. Begivenhederne blev klassificeret som høj amplitud (>1 mV - blå) og lav amplitud (≤1 mV - sort). (C-E) Eksempel på spor af de forskellige perioder af optagelsen: (C) spontan aktivitet, (D) Høj amplitude hændelser i den første periode efter PTZ ansøgning, (E) Lav amplitude begivenheder i sidstnævnte periode efter PTZ ansøgning. Bemærk, at de scriptfiler, der skal hentes disse tal,leveres som supplerende fil . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58837/58837fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Supplerende fil: Scriptfiler til trin 3.4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58837/Supplementary_File.zip" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Behavioral And Physiological Analysis In A Zebrafish Model Of Epilepsy at JoVE.com

Behavioral And Physiological Analysis In A Zebrafish Model Of Epilepsy

Her præsenterer vi en protokol for udvikling og karakterisering af en zebrafisk model af epilepsi som følge af den forbigående hæmning af DEPDC5-genet.

Adfærdsmæssige og fysiologiske analyse i en zebrafisk model af epilepsi

Epilepsy represents one of the most common neurological disorders, affecting an estimated 50 million people worldwide. Recent advances in genetic research ...

Denne protokol giver en hurtig måde at evaluere virkningerne af knock down af WC5-genet, som er den mest almindelige årsag til fokal epilepsi. Den største fordel ved denne teknik er, at vi kan bruge den til at vurdere epilepsi, som fænotype ved hjælp af både adfærdsmæssige og fysiologiske funktioner på forskellige udviklingsstadier. En dag før mikroindsprøjtningen skal zebrafiskparingtankene sættes op.Om morgenen af injektionen skal du fjerne skillevæggene for at muliggøre gydning. Brug en fin sigte til at overføre æggene til 100 millimeter Petri retter, fyldt med embryo vand. Brug en plastik Pasteur pipet, Pick 60 til 80 æg, og arrangere æggene i en silikone belagt petriskål til injektionen.vi flytter det meste af vandet og efterlader lige nok til at dække æggene halvvejs. Placer en glasnål lodret i et rør injektionsopløsning. Lad den farvede opløsning fylde røret ved kapillær handling over en periode på flere minutter.Når injektionsopløsningen er synlig i nålespidsen, monteres nålen på mikroinjektorens sprøjtehåndtag og aktiveres for luftkompressoren. Juster trykindstillingen for at generere et injektionsvolumen på to nanoliter. Og at placere æggene under et dissekerende kikkertmikroskop, med en fire gange forstørrelse.Sæt nålespidsen gennem chorionen og æggeblommen af enkelttrinsfostre for at injicere opløsningen direkte i hver celle. Overfør derefter de injicerede embryoner til en mærket 100 millimeter petriskål af embryovand, og læg pladen i en 28 grader Celsius inkubator. 28 timer efter befrugtning placeres et plast 1,2 ved 1,2 millimeter mesh gitter i bunden af testskålen.Brug en plast Pasteur pipette til at placere 10 til 12 embryoner i deres chorions på plastnet. Fyld fadet med nok embryovand til at holde embryoet nedsænket, men ikke flydende, forsigtigt flytte embryonerne med en plastikspids på plads på nettet efter behov. Derefter skal du ved hjælp af et videokamera, der er fastgjort til et dissektionsmikroskop, optage den spontane spoleaktivitet i 10 til 20 minutter.For at analysere den samlede spontane bevægelse skal du bruge aktivitetskvantificeringsmodulet i et Zebra-laboratoriesystem til at uploade den optagede video og designe sporingsarenaerne omkring hvert embryo efter behov. Indstil fryse- og bursttærsklerne til henholdsvis 10 og 50. Og når den automatiserede videoanalyse, som kvantificerer den samlede aktivitet inde i hver af de definerede arenaer.Gendan derefter datasættet som et regneark for at udføre analysen ved hjælp af den relevante dataanalysesoftware. 46 timer efter befrugtning, bruge fine sammentak til at dechorionere embryoner, og fylde en 130 millimeter test skål med embryovand. Mindst 15 minutter før resten opvarmes testskålen i en 28 grader Celsius inkubator.For at udføre en touch fremkaldt flugt respons test, skal du bruge en plastik Pasteur pipette til at placere et embryo i midten af test parabol, under kameraet. Begynd optagelsen ved hjælp af en anskaffelseshastighed på 30 billeder i sekundet. Brug en fin plastikspids, rør lidt ved embryoets hale med en svirpbevægelse.Standsning af optagelsen, når larven har afsluttet sin bevægelse. Overfør derefter embryoet til en ny holdeskål fyldt med ferskvandsvand, og gentag testen med så mange embryoner som nødvendigt for hver eksperimentel tilstand. For at forberede Zebrafisken til elektrofysiologisk analyse skal du placere en, fire til seks dage efter befrugtningsfisk i en glasbund petriskål.Fjern overskydende, ekstra sømand medium for at sikre, at fisken vil være så tæt på bunden af fadet som muligt. Brug en Plastic pasteur pipette til at tilføje nok varme flydende agros til at dække larven. Mens agros hardnes, bruge fine knoer til at orientere fisken ventral side ned i midten af fadet.Derefter tilsættes to milliliter optagelsesopløsning, der indeholder 10 mikromolar pancuroniumbromid til skålen for at blokere neuromuskulær transmission. Derefter fyldes en mikropipetting med optagelsesopløsning, og brug en patch clamp forstærker i spænding klemme konfiguration, for at måle elektrode modstand i badet for at bekræfte dens korrekte værdi. Ved hjælp af et 20x-mål skal du placere larvens hoved i det centrale synsfelt og sænke mikropipeten for at nå optagelsespositionen inden for det optiske tectum.kontakt patch clamp forstærkeren til den aktuelle klemme konfiguration og fastgør holdestrømmen til nul milliamp. Ved hjælp af et lavpasfilter på en kilohertz og anskaffelsesrate på en kilohertz og en digital gevinst på 10 registrere fiskens spontane aktivitet i 60 minutter for at bestemme baselineaktivitetsniveauet. Ved afslutningen af basisregistreringen, ved 143 mikroliter af en 300 millimolar per liter pentylentetrazolopløsning til badet, for en endelig koncentration på 20 millimolar pr. Liter.Registrer dyrets neuronale aktivitet i pentylentetrazolopløsning i yderligere 120 minutter. I registreringsperiodens basisperiode viser zebrafisk fire til seks dage efter befrugtning af epileptiske modeller en højere forekomst af spontane hændelser, mens mismatchkontrolfisk udviser meget få udsving. Efter pentylentetrazol ansøgning, både mismatch kontrol og epileptiske modeller zebra fisk udviser et øget antal dybe polarisering begivenheder.I den første periode efter anvendelse af pentylentetrazol observeres en hastighed på 0,8 hændelser i minuttet i både mismatchkontrol og nedsenning af dyr, for hvilke de fleste hændelser er af høj amplitud. I den sidste responsperiode. Antallet af depolariseringshændelser stiger til omkring en begivenhed i minuttet.Og de fleste af begivenhederne er af lav amplitude. Når du udfører knock down, er det meget vigtigt at etablere den korrekte dosis af morfoliner ved hjælp af en dosis respons kurve og til at udføre kontrol for at undgå de uspecifikke toksiciteter. Dette skub til at gøre det muligt for flere downstream undersøgelser, herunder afprøvning af virkningerne af genetiske eller kemiske modifikatorer.Og Zebrafish adfærd og neurale aktiviteter aktivitet for at forstå de udviklingsmæssige virkninger af DC fem mutationer.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A General Method for Evaluating Incubation of Sucrose Craving in Rats

En generel metode til evaluering Inkubation af Saccharose Savner hos rotter

For someone on a food-restricted diet, food craving in response to food-paired cues may serve as a key behavioral transition point between abstinence and ...

A Lightweight, Headphones-based System for Manipulating Auditory Feedback in Songbirds

Et let, Hovedtelefoner-baseret system til at manipulere Auditiv Feedback i Songbirds

Experimental manipulations of sensory feedback during complex behavior have provided valuable insights into the computations underlying motor control and ...

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish

Forhjerne Elektrofysiologiske Optagelse i Larvernes zebrafisk

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked ...

Recording and Analysis of Circadian Rhythms in Running-wheel Activity in Rodents

When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, ...

Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

Automatiserede High-throughput Behavioral Analyser i zebrafisk Larver

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

Funktionel analyse af larve Fodring Circuit i Drosophila</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

The Power of Interstimulus Interval for the Assessment of Temporal Processing in Rodents

Kraften i Interstimulus Interval for vurdering af tidsmæssige forarbejdes i Rodents

Temporal processing deficits have been implicated as a potential elemental dimension of higher-level cognitive processes, commonly observed in ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

Ballistisk mærkning af pyramideformede neuroner i hjerneskiver og i primærcellekultur

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...

A Rat Model of EcoHIV Brain Infection

En rottemodel af EcoHIV-hjerneinfektion

It has been well studied that the EcoHIV infected mouse model is of significant utility in investigating HIV associated neurological complications. ...