Name: behavioral and physiological analysis in a zebrafish model of epilepsy
Uploaded: 2021-10-19T13:00:00
Duration: 8 s
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हम आईसीएम इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्लेटफॉर्म के कर्मचारियों का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे जहां न्यूरोफिजियोलॉजी प्रयोग किए गए । हम तकनीकी मदद के लिए Anca मैरिएन को भी धन्यवाद देते हैं। SC को ट्रैम्पोलिन ग्रांट #21488 का समर्थन मिला । EK को एएफएम ग्रांट #18469 और ईआरसी कंसोलिडेटर ग्रांट (एएलएस-नेटवर्क्स) द्वारा समर्थित किया गया था । एचसी को पीएचडी पुरस्कारों द्वारा प्रियतम डालना ला रेचेचे मेडिडेल (पीएलपी20141031462) और एआरएसएलए से समर्थन मिला था। विज्ञापन और आरएम के लिए, इस काम को रोमानियाई राष्ट्रीय वैज्ञानिक अनुसंधान और नवाचार प्राधिकरण, सीएनसीएस-यूईएफआईएससीडीआई (परियोजना संख्या पीएन-III-P4-ID-PCE-2016-0010, पीएन-III-P2-2.1-PED-2016-0007, से तीन अनुदानों द्वारा समर्थित किया गया था। और COFUND-न्यूरॉन-एनएमदार-पीएसवाई), यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम द्वारा अनुदान - अनुदान समझौता संख्या 668863-सिबिल-एए, और एक राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन अनुदान एनएसएफ-आईओएस-1656830 अमेरिकी सरकार द्वारा वित्त पोषित।

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लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

मिर्गी एक जटिल न्यूरोलॉजिकल बीमारी है, जिसमें कई तरह की इटियोलॉजी की विशेषता हैजो आनुवंशिक अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों25, 26,27के आगमन के साथ स्पष्ट होना शुरू हो रही है। बहुमुखी पशु मॉडल एक कुशल अनुवाद रणनीति के लिए आवश्यक हैं जो आनुवंशिक रूप से जुड़े मिर्गी के रोग तंत्र में दोनों अंतर्दृष्टि प्राप्त करेंगे, साथ ही इस स्थिति के विशिष्ट रूपों के लिए लक्षित उपचार भी होंगे। ज़ेब्राफ़िश मॉडल मिर्गी की प्रमुख विशेषताओं को पुन: उत्पन्न करने और मिर्गी रोधी दवा स्क्रीनिंग5,28के लिए विश्वसनीय रीडआउट प्रदान करने में बहुत प्रभावी रहे हैं। इन मॉडलों में आनुवांशिक रूप से संशोधित जेब्राफिश15,29,30,31 और न्यूरोफिजियोलॉजिकल विश्लेषण में सहज दौरे का पता लगाया जा सकता है28 ने मिर्गी जैसे व्यवहार के न्यूरोनल आधार की पुष्टि की है32,33. छोटे आकार के जेब्राफिश लार्वा सरल व्यवहार का स्वचालित पता लगाने का उपयोग करके 96-अच्छी प्रारूप में रासायनिक स्क्रीन के लिए उत्तरदायी हैं, जैसे सहज तैराकी, जो संभावित चिकित्सीय का तेजी से पता लगाने की अनुमति देता है।
यहां प्रस्तुत DEPDC5 नॉक-डाउन मॉडल को विकास के दौरान जीन अभिव्यक्ति को अवरुद्ध करने के लिए जेब्राफिश भ्रूण में एएमओ के इंजेक्शन द्वारा प्राप्त किया जाता है । यह मॉडल लार्वा विकास के विभिन्न समय बिंदुओं के दौरान कई कीस्टोन फेनोटाइपिक विशेषताएं प्रस्तुत करता है, जिसका उपयोग रासायनिक या आनुवंशिक स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल के दौरान चिकित्सा दक्षता के संकेतक के रूप में किया जा सकता है। AMO मध्यस्थता जीन नॉक-डाउन एक शक्तिशाली तकनीक है, जो रासायनिक रूप से प्रेरित जब्ती मॉडल पर लाभ प्रदर्शित करती है, क्योंकि यह विशेष रूप से ब्याज के जीन की अभिव्यक्ति को लक्षित करती है, इस प्रकार आनुवंशिक उत्परिवर्तन द्वारा ट्रिगर अंतर्निहित रोगजनक तंत्र की पहचान की अनुमति देती है। रासायनिक प्रेरकों, जो फिर भी दवा स्क्रीनिंग के लिए शक्तिशाली उपकरण हैं, कई सेलुलर रास्तों के माध्यम से कार्य कर सकते हैं जो हमेशा अध्ययन के तहत आनुवंशिक उत्परिवर्तन के लिए प्रासंगिक नहीं हो सकते हैं। जबकि AMO इंजेक्शन अपने आप में एक सरल तकनीक है जब प्रयोगकर्ता द्वारा महारत हासिल है, यह भी सीमाओं के एक नंबर प्रस्तुत करता है । इंजेक्शन एक सेल चरण भ्रूण पर किया जाना है; हमारे हाथों में, बाद के चरणों में इंजेक्शन ने फेनोटाइप की परिवर्तनशीलता को बहुत बढ़ा दिया। यह इंजेक्शन के लिए उपलब्ध समय को सीमित करता है; इसलिए, एक समय अनुक्रम में इंजेक्शन के लिए अंडे पैदा करने की रणनीति उपयोगी है। हम नियमित रूप से 4-5 क्रॉस का उपयोग करते हैं जो हम 15-20 मिनट के अंतराल पर खोलते हैं, जिससे अगले एक क्लच प्राप्त करने से पहले एक क्लच का इंजेक्शन लगता है। इसके अलावा, विभिन्न प्रयोगों के बीच एक ही समय बिंदुओं पर फेनोटाइप का आकलन करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए, क्योंकि विकास के पहले दिनों के दौरान टकसाली व्यवहार तेजी से विकसित होते हैं। एएमओ की मात्रा और एकाग्रता को भी सावधानीपूर्वक नियंत्रित किया जाना चाहिए, क्योंकि अत्यधिक मात्रा में इंजेक्शन लगाने के कारण सामान्य विषाक्तता विशिष्ट फेनोटाइप को मुखौटा करेगी। परिचय में प्रस्तुत विभिन्न नियंत्रण सही इंजेक्शन खुराक और इसी फेनोटाइप का निर्धारण करने के लिए आवश्यक हैं।
लार्वा ज़ेब्राफ़िश मस्तिष्क की फील्ड रिकॉर्डिंग वैश्विक न्यूरोनल गतिविधि34पर विभिन्न मस्तिष्क विकारों में शामिल आनुवंशिक उत्परिवर्तनों के हानिकारक प्रभावों की जांच करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है। इन प्रायोगिक परिस्थितियों में देखी गई क्षयारण घटनाएं विभिन्न मिर्गी की स्थितियों में औषधियों के विद्युत भौतिक प्रभावों का आकलन करने के लिए एक स्थापित विधि है15,35. हालांकि, इन प्रभावों का आकलन ज्यादातर मात्रात्मक रूप से गुणात्मक रूप से किया गया है, और विश्लेषण में एक अभिनेता के रूप में एक व्यक्तिपरक पर्यवेक्षक है । यहां, हम एक स्वचालित पता लगाने की रणनीति विकसित करते हैं जो निष्पक्ष रूप से depolarizations, उनके आयाम और अवधि की दर की मात्रा निर्धारित कर सकते हैं, और समय भर में इन मापदंडों की प्रगति का मूल्यांकन कर सकते हैं, या विभिन्न आनुवंशिक या फार्माकोलॉजिक हस्तक्षेपों के साथ ।
यहां प्रस्तुत प्रतिनिधि परिणाम 4-6 डीपीएफ जेब्राफिश में बेमेल नियंत्रण की तुलना में DEPDC5 नॉक-डाउन जेनेटिक मॉडल की अपेक्षित क्षेत्र गतिविधि को दिखाते हैं, पीटीजेड के आवेदन से पहले और बाद में मिर्गी की तरह विद्युतीकृत गतिविधि शुरू करने के लिए । इससे पहले, हमने डेपडीसी 5 नॉकडाउन कंडीशन18की बेसल गतिविधि में उल्लेखनीय वृद्धि दिखाई है। यहां, हम बताते हैं कि पीटीजेड, एक रासायनिक मिर्गी गतिविधि प्रेरक के लिए इन दो शर्तों की प्रतिक्रिया में समय में एक समान प्रक्षेपवक्र होता है, जो अपेक्षाकृत कम आवृत्ति, उच्च आयाम depolarization घटनाओं की अवधि के साथ शुरू होता है और उच्च आवृत्ति, कम आयाम depolarization घटनाओं की अवधि के साथ जारी रखता है। फ़ील्ड रिकॉर्डिंग घटनाओं में धीमी गतिशीलता होती है (ब्याज की आवृत्तियां 0.005-0.2एस-1की सीमा में होती हैं), इसलिए ब्याज की घटनाओं को अलग करने के लिए इस प्रोटोकॉल में कम-पास और उच्च-पास फ़िल्टर दोनों का उपयोग किया जाता है। कम आवृत्ति शोर को नष्ट करने के बाद, एक साधारण सीमा का उपयोग करके डीपोलराइजेशन घटनाओं का पता लगाया जाता है। चूंकि सिग्नल के आंकड़े डीपोलराइजेशन की घटनाओं की उपस्थिति से बहुत प्रभावित होते हैं, इसलिए हम इस सीमा को निर्धारित करने के लिए कुल संकेत के मानक विचलन का उपयोग नहीं कर सकते थे। डेटासेट में मानक विचलन के मूल्य की परिवर्तनशीलता मनाया रिकॉर्डिंग शोर के स्तर से अधिक था । इसलिए, निशान के दृश्य निरीक्षण के बाद, हमने 0.3 एमवी की दहलीज के एक निश्चित मूल्य का उपयोग किया, ताकि डीपोलराइजेशन गतिविधि के विभिन्न स्तरों से प्रेरित पूर्वाग्रह से बचा जा सके।
वर्णित प्रोटोकॉल मोटर व्यवहार और न्यूरोनल फील्ड गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए एक मानकीकृत और सरल विधि प्रदान करता है, एक्सपेरिमेंटल करंट क्लैंप वोल्टेज रिकॉर्डिंग के माध्यम से ऑप्टिक टेक्टम में डीपोलराइजेशन घटनाओं का स्वचालित पता लगाने के साथ, जेब्राफिश मॉडल में मिर्गी की तरह फेनोटाइप की विशेषता है।

विकास के शुरुआती चरणों में अपने छोटे आकार, अस्पष्ट विकास और पारदर्शिता के कारण, ज़ेब्राफ़िश मानव रोगों को हृदय, कैंसर या तंत्रिका संबंधी विकारों के रूप में विविध मॉडलिंग के लिए एक मूल्यवान कशेरुकी जीव के रूप में उभरा है1,2। ज़ेब्राफ़िश एक कशेरुकी के फायदों को जोड़ती है, जिसमें अंग वास्तुकला और आनुवंशिक कोड का उच्च संरक्षण शामिल है, छोटे आकार और सरल मॉडल जीवों के आनुवंशिक हेरफेर में आसानी के साथ, इसलिए मौलिक अध्ययन और अनुवादात्मक अनुप्रयोगों दोनों को सुविधाजनक बनाता है। विशेष रूप से, सेलुलर प्रक्रियाओं के व्यवहार और फ्लोरोसेंट मार्कर की उच्च-थ्रूपुट स्वचालित स्क्रीनिंग के लिए इसकी उत्तरदायीता ने ज़ेब्राफिश को मिर्गी अनुसंधान के लिए एक विशेष रूप से आकर्षक मॉडल बना दिया है। यह मिर्गी3,4,5 के रासायनिक प्रेरित और/या आनुवंशिक मॉडल की विशेषता वाले प्रकाशनों की संख्या के अंतिम दशक में उच्च वृद्धि से प्रदर्शित किया गया है और हाल ही में, इन मॉडलों6,7,8 में रासायनिक स्क्रीन से प्राप्त आशाजनक चिकित्सा विज्ञान की रिपोर्ट ।
DEPDC5 GATOR1 परिसर का सदस्य है, जो mTOR सिग्नलिंग9 का एक नकारात्मक नियामक है। डेपडीसी 5 जीन में उत्परिवर्तन पहली बार 2013 में ऑटोसोमल प्रमुख फोकल मिर्गी10,11से पीड़ित प्रोबैंड में खोजे गए हैं और इसके बाद से फोकल मिर्गी अभिव्यक्तियों और फोकल कॉर्टिकल डिस्प्लेसिया12से जुड़े कई नैदानिक स्थितियों में सूचित किया गया है। रिपोर्ट किए गए अधिकांश उत्परिवर्तनों से जीन12के नुकसान का कारण बनने की भविष्यवाणी की गई है, और इसे औपचारिक रूप से कई डेपडीसी 5 उत्परिवर्तित टेपों के लिए प्रदर्शित किया गया था, जिन्हें बकवास मध्यस्थता एमआरएनएक्षय 12, 13द्वारा लक्षित कियागयाहै। समझौते में, एंटीसेंस मॉर्फ ओलिगोनियो ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स (एएमओ) का उपयोग करके जेब्राफिश में जीन ऑर्थोलॉग की दस्तक के परिणामस्वरूप कई विशेषताएं होती हैं जो इस जीव में मिर्गी के मॉडल के लिए आम हैं, जिसमें अतिसक्रियता, पहिया की तरह तैराकी, सहज दौरे और बढ़ी हुई न्यूरोनलगतिविधि14,15, 16,17,18शामिल हैं। दिलचस्प बात यह है कि एमटीआर सिग्नलिंग के अवरोधक रैपामाइसिन के साथ उपचार ने इस मॉडल18की व्यवहार विशेषताओं को उलट दिया, इस परिकल्पना का समर्थन करते हुए कि डेपडीसी 5 हानि-कार्य mTOR मार्ग9, 19के गलतीकरण के कारण मिर्गी को ट्रिगर कर सकता है।
मॉर्फोलिनो संशोधन को ले जाने वाले एंटीसेंस ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स का उपयोग करके वीवो में जीन अभिव्यक्ति की क्षणिक दस्तक सी/श्नान आधारित तकनीकों के बराबर विशिष्ट जीन की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक अमूल्य उपकरण रहा है । हाल ही में, AMO आधारित रणनीतियों को भी नैदानिक अनुप्रयोगों पाया गया है, एक पहले AMO चिकित्सा २०१६20में Duchenne पेशी शोष के उपचार के लिए एफडीए अनुमोदन प्राप्त करने के साथ । हालांकि यह बताया गया था कि जेब्राफिश में तीव्र एएमओ-आधारित जीन नॉक-डाउन का फेनोटाइप हमेशा संविलियन नॉक आउट मॉडल21के साथ सहसंबंधित नहीं होता है, यह कम से कम कुछ उदाहरणों में संविलियन आनुवंशिक संशोधनों द्वारा पैदा किए गए प्रतिपूरक तंत्र के कारण हो सकताहै। हालांकि, AMO-प्रेरित फेनोटाइप की विशिष्टता का मुद्दा एक निर्विवाद चिंता का विषय है जिसे इसतकनीकका उपयोग करके अध्ययनों में लगन से संबोधित किया जाना चाहिए । AMO-आधारित नॉक-डाउन फेनोटाइप की विशिष्टता सुनिश्चित करने के लिए, कई प्रमुख नियंत्रण आवश्यक हैं। इनमें एक खुराक-प्रतिक्रिया वक्र शामिल है जो जीन नॉक-डाउन के लिए प्रभावी एएमओ की सबसे कम खुराक के चयन की अनुमति देता है, आनुवंशिक सामग्री की अधिकता की शुरूआत के कारण समग्र विषाक्तता से बचता है। एक बेमेल AMO का उपयोग जो जीनोम में किसी विशेष क्षेत्र को लक्षित नहीं करता है, एक उपयुक्त खुराक स्थापित करने और एक विशिष्ट फेनोटाइप की पहचान करने के लिए भी आवश्यक है। एक दूसरा AMO जो एक ही जीन के एक अलग क्षेत्र को लक्षित करता है, जैसे कि एक स्प्लिस-अवरुद्ध AMO, इस बात की पुष्टि करने के लिए आवश्यक है कि फेनोटाइप लक्ष्य जीन के नॉक-डाउन के कारण है । जीन के सीडीएनए के साथ नॉक-डाउन फेनोटाइप का बचाव, या तो मानव ऑर्थोलॉग या जेब्राफिश जीन का एक कोडन-संशोधित संस्करण जिसे एएमओ द्वारा लक्षित नहीं किया जा सकता है, फेनोटाइप विशिष्टता के पक्ष में एक मजबूत तर्क प्रदान करता है। एक ही सीडीएनए के साथ बचाव की कमी जिसमें नुकसान-फ़ंक्शन म्यूटेशन (जैसे कि शुरुआती स्टॉप कोडन की शुरुआत) इस दिशा में एक और सबूत है।
यहां, हम एक ज़ेब्राफ़िश DEPDC5 हानि के कार्य मॉडल और 28 और 48 घंटे पोस्ट निषेचन (एचपीएफ) पर व्यवहार फेनोटाइपिंग के लिए प्रोटोकॉल पैदा करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। 28 एचपीएफ में, DEPDC5 हानि-समारोह समग्र अतिसक्रियता का कारण बनता है, जैसा कि कोरियो के भीतर भ्रूण के उन्नत कुंडल और हिल आंदोलनों का सबूत है। प्रति भ्रूण समग्र गतिविधि की मात्रा निर्धारित करने के लिए इस स्तर पर एक स्वचालित गति का पता लगाने प्रणाली का उपयोग किया जा सकता है। ४८ एचपीएफ में, जेब्राफिश प्रदर्शनी टकसाली स्पर्श के जवाब में तैराकी बच । DEPDC5की डाउनरेगेटेड अभिव्यक्ति के साथ जेब्राफिश में, तैराकी का प्रक्षेपवक्र नियंत्रण की तुलना में काफी अधिक कष्टमय है, मछली इस जीव3,4में अन्य रिपोर्ट किए गए मिर्गी मॉडल के समान पैटर्न की तरह "कॉर्क-स्क्रू" या "टर्न-व्हील" का प्रदर्शन करती है। इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग 4-6 दिनों के बाद निषेचन (डीपीएफ) के बीच जेब्राफिश लार्वा में ऑप्टिक टेक्टम में प्राप्त की गई थी और DEPDC5 नॉक-डाउन जानवरों में न्यूरोनल गतिविधि में एक आधारभूत वृद्धि दिखाते हैं। इस मॉडल का लाभ यह है कि यह विभिन्न समय बिंदुओं पर कई फेनोटाइपिक विशेषताएं प्रस्तुत करता है, जो विकास के दौरान दवा चिकित्सा की प्रभावकारिता की निगरानी और आकलन में उपयोगी हो सकते हैं।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:751px;" width="750">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:197px;">Agarose</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich, France</td>
			<td style="width:84px;">A9539</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aquarium salt&#160;</td>
			<td>Instant Ocean, Blacksburg, VA</td>
			<td>SS15-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass with filament</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF100-50-10</td>
			<td>OD: 1,5mm, ID: 0,5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Depdc5-atg antisense morpholino</td>
			<td>GeneTools, OR, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>sequence 5&#8217;- TGCCTTCATGGTGACCGTCATTTTA -3&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Depdc5-mis antisense morpholino</td>
			<td>GeneTools, OR, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>sequence 5&#8217;- TGCgTTgATcGTGACCcTgATTTTA -3&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Depdc5-splice antisense morpholino</td>
			<td>GeneTools, OR, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>sequence 5&#8217;- ACATTCCTGTTTCACCATAGATGAT -3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digitizer</td>
			<td>Molecular Devices, CA, USA</td>
			<td>Digidata 1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fast Green Dye</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td>F7258</td>
			<td>Stock solution of 0.2%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass-bottom petri dishes</td>
			<td>Ibidi, Germany</td>
			<td>81218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td>68270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Grasshopper 2 camera</td>
			<td style="width:163px;">FLIR, BC, Canada</td>
			<td>GRAS-03K2M-C</td>
			<td>formerly Point Grey Research</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human wild-type DEPDC5 cDNA</td>
			<td>Dharmacon, France</td>
			<td>NM_001242897.1</td>
			<td>&#160;Accession: BC144291 Clone ID 905</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ software</td>
			<td>NIH, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td>P9333&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matlab software</td>
			<td>MathWorks, MA, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td>S7653&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td>71687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pancuronium bromide&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Alomone Labs</td>
			<td style="width:84px;">P-130</td>
			<td style="width:307px;">Stock solution of 60mM in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parafilm</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td>P7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Patch clamp amplifier</td>
			<td>Molecular Devices, CA, USA</td>
			<td>MultiClamp 700B</td>
			<td>Computer-controled patch clamp amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pClamp10 acquisition software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pentylenetetrazol (PTZ)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td>P6500</td>
			<td>Stock solution of 300mM (dissolved in recording solution)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipette puller</td>
			<td>Narishige, Japan</td>
			<td>PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pneumatic PicoPump&#160;</td>
			<td>WPI, France</td>
			<td>PV 820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sylgard 184 kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich Intl.</td>
			<td>761036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transfer plastic pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td>Z350605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zebralab</td>
			<td>Viewpoint, France</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

behavioral and physiological analysis in a zebrafish model of epilepsy

मिर्गी सबसे आम न्यूरोलॉजिकल विकारों में से एक का प्रतिनिधित्व करता है, जो दुनिया भर में अनुमानित 50 मिलियन लोगों को प्रभावित करता है। आनुवंशिक अनुसंधान में हाल ही में प्रगति मिर्गी के विभिन्न रूपों में फंसाया जीन के एक बड़े स्पेक्ट्रम का पर्दाफाश किया है, इस विकार की विषम प्रकृति पर प्रकाश डाला । मिर्गी में फंसा आनुवंशिक उत्परिवर्तनों द्वारा ट्रिगर किए गए रोग तंत्र की जांच करने और विशेष, लक्षित उपचारों के विकास के लिए उपयुक्त पशु मॉडल आवश्यक हैं। हाल के वर्षों में, जेब्राफिश मिर्गी मॉडलिंग के लिए एक मूल्यवान कशेरुकी जीव के रूप में उभरा है, दोनों आनुवंशिक हेरफेर और ज्ञात मिर्गी दवाओं के संपर्क के साथ, जैसे पेंटीलेनटेट्राजोल (पीटीजेड), उपन्यास विरोधी मिर्गी चिकित्सा की पहचान करने के लिए । mTOR नियामक DEPDC5 में हानिकारक उत्परिवर्तन फोकल मिर्गी के विभिन्न रूपों के साथ जुड़े रहे हैं और जेब्राफिश ऑर्थोलॉग के नॉक-डाउन सहज जब्ती जैसे एपिसोड से जुड़ी अतिसक्रियता का कारण बनता है, साथ ही बढ़ी हुई विद्युत गतिविधि और विशेषता बारी पहिया तैराकी। यहां, हमने डेपडीसी 5 हानि-कार्य मॉडल उत्पन्न करने में शामिल विधि का वर्णन किया और 28 और 48 एच पोस्ट निषेचन (एचपीएफ) में मोटर गतिविधि का आकलन करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन किया, साथ ही जेब्राफिश ऑप्टिक टेक्टम में फील्ड गतिविधि रिकॉर्ड करने के लिए एक विधि। समय के साथ न्यूरोनल गतिविधि पर मिर्गी की दवा पीटीजेड के प्रभाव का एक उदाहरण भी प्रदान किया जाता है।

चित्रा 1 दो आनुवंशिक स्थितियों के मामले में 4-6 डीपीएफ जेब्राफिश लार्वा असाधारण क्षेत्र रिकॉर्डिंग के प्रतिनिधि वोल्टेज निशान दिखाता है: बेमेल नियंत्रण और DEPDC5 नॉक-डाउन। रिकॉर्डिंग की बेसलाइन अवधि में, DEPDC5 नॉक-डाउन सहज घटनाओं की एक उच्च घटना को दर्शाता है, जबकि बेमेल नियंत्रण बहुत कम उतार-चढ़ाव प्रदर्शित करता है। ये गतिविधि पैटर्न डेपडीसी 5के नुकसान के कारण न्यूरोनल गतिविधि में उल्लेखनीय वृद्धि के प्रतिनिधि हैं, जैसा कि हमने पहले18रिपोर्ट किया है। पीटीजेड आवेदन के बाद, बेमेल नियंत्रण और DEPDC5 नॉक-डाउन दोनों ही डीपोलराइजेशन की घटनाओं की बढ़ी हुई संख्या दिखाते हैं। पीटीजेड आवेदन (10 - 60 मिनट) के बाद पहली अवधि के दौरान, बेमेल नियंत्रण और डेपडीसी 5 नॉक-डाउन दोनों में प्रति मिनट 0.8 घटनाओं की दर देखी जाती है, जहां अधिकांश घटनाएं उच्च आयाम (>1 एमवी) की होती हैं। उत्तरार्द्ध प्रतिक्रिया अवधि (पीटीजेड आवेदन के बाद 60 - 120 मिनट) के दौरान, डीपोलराइजेशन घटनाओं की दर प्रति मिनट लगभग 1 घटना तक बढ़ जाती है, और अधिकांश घटनाएं कम आयाम (≤1 एमवी) की होती हैं।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58837/58837fig1.jpg"> चित्रा 1:जेब्राफिश लार्वा मस्तिष्क में क्षेत्र रिकॉर्डिंग के उदाहरण निशान। (A)बेमेल नियंत्रण लार्वा और एक DEPDC5 नॉक-डाउन के लिए 180 मिनट रिकॉर्डिंग का अवलोकन। सबसे पहले, सहज बेसलाइन गतिविधि दर्ज की गई थी, फिर पीटीजेड को स्नान (लाल पट्टी) में लागू किया गया था। (ख)पेरी-उत्तेजना समय बेमेल नियंत्रण और DEPDC5 नॉक-डाउन के लिए depolarization घटनाओं के हिस्टोग्राम । घटनाओं को उच्च आयाम (>1 एमवी - नीला) और कम आयाम (≤1 एमवी - काला) के रूप में वर्गीकृत किया गया था। (C-E) रिकॉर्डिंग की विभिन्न अवधियों के उदाहरण निशान:(सी)सहज गतिविधि,(डी)पीटीजेड आवेदन के बाद पहली अवधि के दौरान उच्च आयाम घटनाओं,(ई)पीटीजेड आवेदन के बाद बाद की अवधि के दौरान कम आयाम घटनाओं । ध्यान दें कि इन आंकड़ों को प्राप्त करने के लिए स्क्रिप्ट फ़ाइलें अनुपूरक फाइलके रूप में प्रदान की जाती हैं । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58837/58837fig1large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
अनुपूरक फ़ाइल: चरण 3.4 के लिए स्क्रिप्ट फ़ाइलें। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58837/Supplementary_File.zip" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>

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Behavioral And Physiological Analysis In A Zebrafish Model Of Epilepsy

यहां, हम DEPDC5 जीन के क्षणिक अवरोध के परिणामस्वरूप मिर्गी के एक ज़ेब्राफ़िश मॉडल के विकास और लक्षण वर्णन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।

मिर्गी के एक ज़ेब्राफ़िश मॉडल में व्यवहार और शारीरिक विश्लेषण

Epilepsy represents one of the most common neurological disorders, affecting an estimated 50 million people worldwide. Recent advances in genetic research ...

यह प्रोटोकॉल WC5 जीन के नॉक डाउन के प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए एक तेजी से तरीका प्रदान करता है, जो फोकल मिर्गी का सबसे आम कारण है। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि हम इसका उपयोग मिर्गी का आकलन करने के लिए कर सकते हैं, जैसे विकास के विभिन्न चरणों में व्यवहार और शारीरिक दोनों विशेषताओं का उपयोग करके फेनोटाइप। माइक्रो इंजेक्शन से एक दिन पहले जेब्राफिश संभोग टैंक स्थापित करें।इंजेक्शन की सुबह, डिवाइडर को हटा दें ताकि स्पॉन सक्षम हो सके। अंडे को 100 मिलीमीटर पेट्री व्यंजनों में स्थानांतरित करने के लिए एक बारीक चलनी का उपयोग करें, जिसमें भ्रूण का पानी भरा हुआ है। एक प्लास्टिक पाश्चर पिपेट का उपयोग करना, 60 से 80 अंडे चुनें, और इंजेक्शन के लिए सिलिकॉन लेपित पेट्री डिश में अंडे की व्यवस्था करें।हम पानी के सबसे कदम, बस अंडे आधे रास्ते को कवर करने के लिए पर्याप्त छोड़ । एक गिलास सुई को इंजेक्शन समाधान की ट्यूब में खड़ी रखें। रंगीन समाधान को कई मिनटों की अवधि में केशिका कार्रवाई द्वारा ट्यूब को भरने की अनुमति दें।जब इंजेक्शन समाधान सुई की नोक में दिखाई देता है, तो सुई को माइक्रो इंजेक्टर के इंजेक्शन हैंडल पर माउंट करें, और हवा कंप्रेसर चालू करें। दो नैनोलीटर इंजेक्शन की मात्रा उत्पन्न करने के लिए दबाव सेटिंग को समायोजित करें। और अंडे को विच्छेदन दूरबीन माइक्रोस्कोप के नीचे रखने के लिए, चार गुना आवर्धन के साथ।प्रत्येक कोशिका के भीतर सीधे समाधान इंजेक्ट करने के लिए कोरियोन और एकल चरण भ्रूण की जर्दी के माध्यम से सुई टिप डालें। फिर इंजेक्शन भ्रूण भ्रूण पानी के एक लेबल १०० मिलीमीटर पेट्री पकवान में स्थानांतरित, और एक 28 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में थाली जगह है । निषेचन के बाद 28 घंटे, परीक्षण पकवान के नीचे 1.2 मिलीमीटर जाल ग्रिड द्वारा एक प्लास्टिक 1.2 रखें।प्लास्टिक के जाल पर अपने कोशन के भीतर 10 से 12 भ्रूण रखने के लिए प्लास्टिक पाश्चर पिपेट का उपयोग करें। भ्रूण को जलमग्न रखने के लिए पर्याप्त भ्रूण के पानी के साथ पकवान भरें, लेकिन तैरते नहीं हैं, ध्यान से आवश्यक के रूप में ग्रिड पर स्थिति में एक प्लास्टिक टिप के साथ भ्रूण चलती है । फिर, विच्छेदन माइक्रोस्कोप से जुड़े वीडियो कैमरे का उपयोग करके, सहज कॉइलिंग गतिविधि को 10 से 20 मिनट तक रिकॉर्ड करें।कुल सहज आंदोलन का विश्लेषण करने के लिए, रिकॉर्ड किए गए वीडियो को अपलोड करने और प्रत्येक भ्रूण के चारों ओर ट्रैकिंग एरेनास को उपयुक्त के रूप में डिजाइन करने के लिए ज़ेबरा लैब सिस्टम में गतिविधि क्वांटिफिकेशन मॉड्यूल का उपयोग करें। फ्रीज और फट थ्रेसहोल्ड क्रमशः 10 और 50 के लिए सेट करें। और जब स्वचालित वीडियो विश्लेषण, जो प्रत्येक परिभाषित एरेनास के अंदर कुल गतिविधि की मात्रा निर्धारित करता है।फिर उचित डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके विश्लेषण करने के लिए स्प्रेडशीट के रूप में सेट किए गए डेटा को पुनर्प्राप्त करें। निषेचन के बाद 46 घंटे, भ्रूण को डिकोरीनेट करने के लिए ठीक संदंश का उपयोग करें, और भ्रूण के पानी के साथ 130 मिलीमीटर परीक्षण पकवान भरें। आराम से कम से कम 15 मिनट पहले, टेस्ट डिश को 28 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में गर्म करें।एक स्पर्श पैदा एस्केप रिस्पांस टेस्ट करने के लिए, कैमरे के नीचे परीक्षण पकवान के केंद्र में एक भ्रूण रखने के लिए एक प्लास्टिक पाश्चर पिपेट का उपयोग करें। प्रति सेकंड 30 फ्रेम की अधिग्रहण दर का उपयोग करके रिकॉर्डिंग शुरू करें। एक ठीक प्लास्टिक टिप का उपयोग करना, थोड़ा एक झटका गति के साथ भ्रूण की पूंछ को छूने ।रिकॉर्डिंग को रोकना, जब लार्वा ने अपना आंदोलन समाप्त कर दिया है। फिर, ताजा भ्रूण के पानी से भरे एक नए होल्डिंग डिश में भ्रूण को स्थानांतरित करें, और प्रत्येक प्रयोगात्मक स्थिति के लिए आवश्यक के रूप में कई भ्रूण के साथ परीक्षण दोहराएं। इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल एनालिसिस के लिए जेब्रा फिश तैयार करने के लिए एक ग्लास बॉटम पेट्री डिश में एक, चार से छह दिन बाद फर्टिलाइजेशन फिश रखें ।किसी भी अतिरिक्त, अतिरिक्त नाविक माध्यम को हटा दें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि मछली यथासंभव पकवान के नीचे के करीब होगी। लार्वा को कवर करने के लिए पर्याप्त गर्म तरल एग्रो जोड़ने के लिए प्लास्टिक पाश्चर पिपेट का उपयोग करें। जबकि एग्रोस हार्डनेस, डिश के केंद्र में मछली वेंट्रल साइड को नीचे उन्मुख करने के लिए ठीक संदंश का उपयोग करें।फिर न्यूरोमस्कुलर ट्रांसमिशन को ब्लॉक करने के लिए डिश में 10 माइक्रोमोलर पैनक्यूरोनियम ब्रोमाइड युक्त रिकॉर्डिंग समाधान के दो मिलीलीटर जोड़ें। इसके बाद, रिकॉर्डिंग समाधान के साथ एक माइक्रोपिपेटिंग भरें, और इसके सही मूल्य की पुष्टि करने के लिए स्नान में इलेक्ट्रोड प्रतिरोध को मापने के लिए वोल्टेज क्लैंप कॉन्फ़िगरेशन में पैच क्लैंप एम्पलीफायर का उपयोग करें। 20x उद्देश्य का उपयोग करके, देखने के केंद्रीय क्षेत्र में लार्वा के सिर की स्थिति, और ऑप्टिक टेक्टम के भीतर रिकॉर्डिंग स्थिति तक पहुंचने के लिए माइक्रोपिपेट को कम करें।पैच क्लैंप एम्पलीफायर को वर्तमान क्लैंप कॉन्फ़िगरेशन में स्विच करें और होल्डिंग करंट को शून्य मिलीएम्प पर ठीक करें। एक किलोहर्ट्ज के कम पास फिल्टर का उपयोग करना, और एक किलोहर्ट्ज की अधिग्रहण दर, और 10 का डिजिटल लाभ, बेसलाइन गतिविधि के स्तर को निर्धारित करने के लिए 60 मिनट के लिए मछली की सहज गतिविधि रिकॉर्ड करता है। बेसलाइन रिकॉर्डिंग के अंत में, स्नान के लिए 300 मिलीमोलर प्रति लीटर पेंटीलेनटेट्राजोल समाधान के 143 माइक्रोलीटर पर, प्रति लीटर 20 मिलीमोलर की अंतिम एकाग्रता के लिए।पेंटीलेनटेट्राजोल समाधान में जानवर की न्यूरोनल गतिविधि को एक और 120 मिनट के लिए रिकॉर्ड करें। रिकॉर्डिंग की बेसलाइन अवधि के दौरान, चार से छह दिनों के बाद निषेचन मिर्गी मॉडल ज़ेबरा मछली सहज घटनाओं की एक उच्च घटना का प्रदर्शन, जबकि बेमेल नियंत्रण मछली बहुत कम उतार चढ़ाव प्रदर्शन । पेंटीलेनटेट्राजोल आवेदन के बाद, बेमेल नियंत्रण और मिर्गी मॉडल दोनों जेब्रा मछली गहरे ध्रुवीकरण की घटनाओं की संख्या में वृद्धि का प्रदर्शन करते हैं।पेंटीलेनटेट्राजोल आवेदन के बाद पहली अवधि के दौरान, बेमेल नियंत्रण दोनों में प्रति मिनट 0.8 घटनाओं की दर देखी जाती है और जानवरों को नीचे गिरा दिया जाता है जिसके लिए अधिकांश घटनाएं उच्च आयाम की होती हैं। बाद की प्रतिक्रिया अवधि के दौरान। depolarization घटनाओं की दर प्रति मिनट के आसपास एक घटना के लिए बढ़ जाती है ।और घटनाओं के बहुमत एक कम आयाम के हैं । जब दस्तक नीचे प्रदर्शन करते हैं, तो खुराक प्रतिक्रिया वक्र का उपयोग करके मॉर्फोलिनोस की सही खुराक स्थापित करना और गैर-विशिष्ट विषाक्तता से बचने के लिए नियंत्रण करना बहुत महत्वपूर्ण है। यह धक्का आनुवंशिक या रासायनिक संशोधक के प्रभावों का परीक्षण सहित कई डाउनस्ट्रीम अध्ययनों को सक्षम करने के लिए।और डीसी पांच म्यूटेशन के विकासात्मक प्रभावों को समझने के लिए जेब्राफिश व्यवहार और तंत्रिका गतिविधियों गतिविधि।

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A General Method for Evaluating Incubation of Sucrose Craving in Rats

चूहे में Sucrose तरस के ऊष्मायन का मूल्यांकन करने के लिए एक सामान्य विधि

For someone on a food-restricted diet, food craving in response to food-paired cues may serve as a key behavioral transition point between abstinence and ...

A Lightweight, Headphones-based System for Manipulating Auditory Feedback in Songbirds

Songbirds में श्रवण प्रतिक्रिया से छेड़छाड़ करने के लिए एक हल्के, Headphones आधारित प्रणाली

Experimental manipulations of sensory feedback during complex behavior have provided valuable insights into the computations underlying motor control and ...

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish

अग्रमस्तिष्क लारवल Zebrafish में electrophysiological रिकॉर्डिंग

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked ...

Recording and Analysis of Circadian Rhythms in Running-wheel Activity in Rodents

और कृन्तकों में गतिविधि पहिया चल रहा है में circadian लय का विश्लेषण रिकॉर्डिंग

When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, ...

Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

Zebrafish लार्वा में स्वचालित उच्च throughput व्यवहार विश्लेषण

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

में लारवल दूध पिलाने सर्किट का कार्य विश्लेषण ड्रोसोफिला</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

The Power of Interstimulus Interval for the Assessment of Temporal Processing in Rodents

Rodents में लौकिक प्रसंस्करण के मूल्यांकन के लिए Interstimulus अंतराल की शक्ति

Temporal processing deficits have been implicated as a potential elemental dimension of higher-level cognitive processes, commonly observed in ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

मस्तिष्क स्लाइस में और प्राथमिक सेल संस्कृति में पिरामिड न्यूरॉन्स की बैलिस्टिक लेबलिंग

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...

A Rat Model of EcoHIV Brain Infection

EcoHIV मस्तिष्क संक्रमण का एक चूहा मॉडल

It has been well studied that the EcoHIV infected mouse model is of significant utility in investigating HIV associated neurological complications. ...