Name: behavioral and physiological analysis in a zebrafish model of epilepsy
Uploaded: 2021-10-19T13:00:00
Duration: 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Behavioral And Physiological Analysis In A Zebrafish Model Of Epilepsy at JoVE.com

Vi vil gjerne takke de ansatte i ICM elektrofysiologiplattformen der nevrofysiologieksperimentene ble utført. Vi takker også Anca Marian for teknisk hjelp. SC ble støttet av Trampoline Grant #21488. EK ble støttet av AFM Grant #18469 og ERC Consolidator Grant (ALS-Networks). HC ble støttet av PhD Awards fra Fondation pour la Recherche Médicale (PLP20141031462) og ARSLA. For AD og RM ble dette arbeidet støttet av tre tilskudd fra den rumenske nasjonale myndigheten for vitenskapelig forskning og innovasjon, CNCS-UEFISCDI (prosjektnummer PN-III-P4-ID-PCE-2016-0010, PN-III-P2-2.1-PED-2016-0007, og COFUND-NEURON-NMDAR-PSY), et stipend fra EUs forsknings- og innovasjonsprogram Horizon 2020 – tilskuddsavtale nr.

Eksperimentelle prosedyrer ble godkjent av nasjonale og institusjonelle etiske komiteer.
1. Forbigående nedslag av DEPDC5 Gen i sebrafiskembryo
<ol><li>Forberedelse av verktøy:
	<ol>
<li>Forbered silikon elastomerbelagte petri-retter: Bland bunnen og herdemiddelet til settet (se Materialbord) i forholdet 10:1. Fyll en 35 mm Petri-tallerken halvveis med blandingen. Vent til silisiumet herdes før du bruker det (dette kan ta flere dager).</li>
		<li>Forbered 1,2 mmol/l lagerløsninger av antisense morpholino oligonukleotider (AMO, se Materialtabell). Tilsett 250 μL sterilt vann til 300 nmole lyofilisert AMO for å få en 1,2 mmol/l lagerløsning. For fullstendig oppløsning, varm hetteglassene i 5 min ved 65 °C. Vortex kort. Forsegle rørhetten med en plastfilm (se Materialbord).</li>
		<li>For kontrollredningsforsøkene, lag et uttrykk plasmid som inneholder den menneskelige cDNA av DEPDC5 (se Tabell over materialer) klonet i pCS2 ryggraden eller en lignende sebrafisk-kompatibel uttrykk plasmid. Som en negativ kontroll ble en mutasjon som forårsaket en tidlig stoppkodon (p.Arg487*) introdusert i cDNA.</li>
		<li>Forbered embryovann: 0,06 g/l akvariumsalt (se Materialtabell) i omvendt osmosevann + 0,5 mg/L metylenblått.</li>
		<li>Dagen for injeksjonen, forberede mikroinjeksjon borosilikat glass nåler ved hjelp av en puller (se Tabell over materialer). Angi passende temperaturinnstillinger på nåletrekkeren. Bruk en 10 cm lang, 1/0,5 OD/ID mm borosilikatglasskapillær for å generere to ~5 cm kapillærer med tynne spisser med en lengde på ca. 1 cm.</li>
		<li>Hvis spissen av nålene er veldig fin, og forhindrer utkastelse av løsning, bryter du selve enden av den koniske spissen ved hjelp av tang under et mikroskop.</li>
		<li>Rett før injeksjon, forberede arbeidsløsningene til AMOer. Forbered alltid fersk løsning for å sikre reproduserbarheten av resultatene. Varm AMO-hetteglassene ved 65 °C i 5 minutter. Forbered en 5 μL injeksjonsprøve som inneholder Fast Green fargestoff (0,02% endelig konsentrasjon, se Tabell over materialer) og AMO fortynnet ved arbeidskonsentrasjonen i vann.</li>
		<li>Bestem arbeidskonsentrasjonen av AMO empirisk for hvert gen ved hjelp av en doseresponskurve. Arbeidskonsentrasjonen representerer en konsentrasjon der AMO er effektiv i å slå ned genet uten å forårsake generell toksisitet, for eksempel grove morfologiske defekter. Vanligvis vil AMO arbeidskonsentrasjoner være i et område på 0,2 mmol / l til 1 mmol / l (0,4 mmol / l ble bestemt som den effektive konsentrasjonen for denne studien18). Injiser kontrollen Mismatch morpholino i samme konsentrasjon som den effektive AMO.</li>
		<li>Virvel rørene og sentrifugen kort for å bringe dråpene til bunnen av rørene.</li>
		<li>For redningsforsøk, lag en 5 μL injeksjonsprøve med AMO fortynnet ved arbeidskonsentrasjonen og cDNA-uttrykket plasmid fortynnet i vann til en endelig konsentrasjon som skal bestemmes empirisk. For uttrykket av DEPDC5 og den negative kontrollplasmiden var 100 ng / μL effektiv for fenotypisk redning.</li>
	</ol></li>
	<li>Embryo forberedelse:
	<ol>
<li>Dagen før mikroinjeksjon, sett opp sebrafiskparringstanker. Morgenen av injeksjonen, fjern skilleveggene for å muliggjøre gyting. Samle eggene i 100 mm Petri retter fylt med embryovann ved hjelp av en fin sil. Injiser innen 20-30 min fra samlingen, mens eggene er på ett cellestadium.</li>
		<li>Velg 60-80 egg med en pasteurpipette i plast og ordne dem i den silisiumbelagte Petri-retten til injeksjon. Silisiumoverflaten vil forhindre at eggene glir under injeksjonene. Fjern det meste av embryovannet, og la det være akkurat nok til å dekke eggene halvveis.</li>
	</ol></li>
	<li>Mikroinjeksjoner:<ol>
<li>Fyll en glassnål med injeksjonsoppløsning. Plasser nålen vertikalt i et av rørene som inneholder injeksjonsoppløsningen, og sørg for at den nederste enden av nålen berører løsningen. Vent noen minutter til den fargede injeksjonsoppløsningen stiger av kapillæritet og er synlig på spissen av nålen.</li>
		<li>Monter den fylte kanylen på mikroinjektorens injiseringshåndtak (se Materialliste).</li>
		<li>Slå på luftkompressoren og juster trykkinnstillingen for å generere et injeksjonsvolum på ~ 2 nL.</li>
		<li>For å beregne volumet av den injiserte løsningen, plasser en dråpe mineralolje på en mikrotom lysbilde. Injiser den fargestoffholdige løsningen ved hjelp av de angitte trykk- og tidsparametrene. Mål diameteren på den injiserte væskesfæren og beregn det totale volumet ved hjelp av formelen Volume = 4/3 * π * (d / 2)3, hvor d = den målte diameteren til den injiserte bolusen.</li>
		<li>Ved hjelp av et dissekert kikkertmikroskop med en 4X forstørrelse, injiser eggene på enkeltcellestadiet ved å passere gjennom korionen og eggeplommen, og projisere løsningen direkte i cellen.</li>
		<li>Samle de injiserte embryoene i en 100 mm Petri-tallerken med embryovann, merk parabolen og inkuber dem ved 28 °C.</li>
		<li>Sørg for at inkubatortemperaturen er stabil over tid, da embryoutviklingshastigheten er termosensitiv. For eksempel vil veksten bli akselerert ved høyere temperaturer, og utviklingsstadiet er avgjørende for å vurdere fenotypen24riktig .</li>
		<li>Kontroller kvaliteten på eggene 6-8 timer etter injeksjon og fjern døde og unfertilized embryoer ved hjelp av en plast Pasteur pipette.</li>
		<li>Neste morgen teller og fjerner du døde embryoer i hver tallerken med en pasteurpipette i plast.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Atferdsanalyse
<ol><li>Global aktivitetsanalyse hos 28 hkf:
	<ol>
<li>Utfør testen ettermiddagen dagen etter mikroinjeksjon (28 hkf), og sørg for at tidspunktet på dagen testen utføres er konsekvent over eksperimenter for å utføre gyldig statistisk analyse som embryoutvikling er svært rask.</li>
		<li>Fyll en 35 mm tallerken (testfat) med embryovann og la den varme opp i inkubatoren (28 °C) i minst 15 minutter før du starter testen.</li>
		<li>Plasser et plastnettgitter (1,2x1,2 mm) kuttet i størrelse, på bunnen av testfatet.</li>
		<li>Få en annen eksperimentator til å randomisere rekkefølgen på testing av embryoene og masker navnene på forholdene som skal testes.</li>
		<li>Pass på at dødeligheten ikke endres mellom forholdene og sammenlignet med ikke-injiserte embryoer for å sikre fenotypens spesifisitet. Prosentandelen av døde embryoer under alle forhold skal ikke overstige 10-13%18.</li>
		<li>Plasser 10-12 embryoer fortsatt innenfor koret på plastnettet ved hjelp av en pasteurpipette i plast. Fyll testfatet med nok embryovann til å holde embryoene nedsenket, men ikke flytende. Om nødvendig, flytt embryoene med forsiktighet ved hjelp av en plastspiss for å plassere dem på rutenettet.</li>
		<li>Bruk et videokamera (se Materialfortegnelse) festet til et disseksjonsmikroskop, ta opp den spontane spoleaktiviteten i en definert tidsperiode (10-20 min lange videoer er vanligvis tilstrekkelig til å få representative prøver av aktivitetsutbrudd for kvantifiseringen)</li>
		<li>Returner embryoene til deres respektive tallerken og legg dem tilbake i inkubatoren. Gjenta eksperimentet med så mange embryoer som nødvendig for hver tilstand (som bestemt av en 90% kraftanalyse).</li>
		<li>Hvis du vil analysere total spontan bevegelse, bruker du et ZebraLab-system (se Materialfortegnelse). Bruk aktivitets kvantifiseringsmodulen, last opp den innspilte videoen og design sporingsarenaene rundt hvert embryo etter behov. Sett fryse- og burst-terskelen til henholdsvis 10 og 50.</li>
		<li>Kjør den automatiserte videoanalysen, som kvantifiserer total aktivitet på hver av de definerte arenaene, og gjenopprett deretter datasettet som et regneark og utfør analysen ved hjelp av en dataanalyseprogramvare.</li>
	</ol></li>
	<li>Touch-Evoked-Escape-Response (TEER) ved 48 hkf:
	<ol>
<li>Utfør testen om morgenen to dager etter injeksjonen (48 timer etter befruktningen).</li>
		<li>Minst 2 timer før testing, dechorionate embryoene ved hjelp av fine tang. Forsikre deg om at tiden på dagen for dechorionation og atferdstesten er konsekvent over eksperimenter.</li>
		<li>Fyll en 130 mm tallerken (testfat) med embryovann og la den varme opp i inkubatoren (28 °C) i minst 15 minutter før du starter testen.</li>
		<li>Tell og fjern døde og morfologisk deformerte larver. Registrer tallene for hver betingelse.</li>
		<li>Få en annen eksperimentator til å randomisere rekkefølgen og kodifisere navnene på forholdene som skal testes.</li>
		<li>Monter kameraet (se Materialbord) over testretten, og pass på at hele testretten er innenfor synsfeltet. Plassering av en linjal innenfor synsfeltet gir en intern kalibrering for avstand.</li>
		<li>Med en plast Pasteur pipette, legg et embryo i midten av testfatet og begynn innspillingen ved hjelp av en oppkjøpsgrad på 30 fps.</li>
		<li>Med en fin plastspiss, berør litt halen av embryoet med en flikkbevegelse.</li>
		<li>Stopp opptaket når larven har avsluttet bevegelsen.</li>
		<li>Fjern embryoet fra testretten og legg det i en ny tallerken fylt med embryovann. Gjenta testen med så mange embryoer som nødvendig for hver tilstand (som bestemt av en 90% kraftanalyse).</li>
		<li>Returner embryoene til den opprinnelige parabolen og legg dem tilbake i inkubatoren.</li>
		<li>For å analysere parametrene for svømmeatferden, last inn den innspilte videoen til ImageJ-analyseprogramvaren. Last ned og installer plugin-modulen manuell sporing av ImageJ (se Tabell over materialer). Start plugin-modulen ved å velge Verktøy | Plugin-| Manuell sporing i menyen.</li>
		<li>I dialogvinduet introduserer du den kalibrerte skalaen for bildet. Hvis du inkluderer en linjal i kamerafeltet, blir det enklere å konvertere cm til piksler.</li>
		<li>Velg Legg til spor og start banesporingen ved å klikke på bildet av sebrafisklarven i den første rammen. Rammene går automatisk frem med hvert punkt som legges til sporingen.</li>
		<li>Fortsett å spore bevegelsen til slutten av svømmeepisoden.</li>
		<li>Velg Avslutt spor i sporingsvindu, hent X-Y-koordinatene og beregn total avstand, hastighet og dreievinkel.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Elektrofysiologisk analyse
<ol><li>Reagens og verktøyforberedelse:
	<ol>
<li>Forbered 1% agarose i embryovann (se pkt. 1.1.4). Aliquot væsken agarose i mikrocentrifuge rør og holde disse på en varmeblokk ved 42 °C for å hindre at agarose herdes.</li>
		<li>Forbered opptaksløsningen (i mmol/L): NaCl 134, KCl 2.9, CaCl2 2.1, MgCl2 1.2, glukose 10, HEPES 10, pH 7.8.</li>
		<li>Trekk borosilikatglassmikropipetter med en spissåpning på 1,5-2 μm (5-6 mm2·kg·s−3· En-2 motstand) upolert.</li>
	</ol></li>
	<li>Forberedelse av sebrafisk larver for elektrofysiologi:
	<ol>
<li>Legg fisken i en petriskål med glassbunn (se Materialbord) og fjern overflødige ekstracellulære medier for å sikre at fisken bringes så nær dekselslippet som mulig.</li>
		<li>Bruk en plast Pasteur pipette, tilsett varm væske agarose på og rundt larven. Bruk akkurat nok agarose til å dekke fisken. Mens agarose herdes, bruk fine tang for å orientere fisken i en rett posisjon, ventral side ned, i midten av parabolen.</li>
		<li>Tilsett 2 ml av opptaksløsningen som inneholder 10 μM Pancuroniumbromid (se Materialfortegnelse) for å blokkere nevromuskulær overføring. Tilsetningen av lammer er nødvendig for å eliminere gjenstander på grunn av små bevegelser under opptakene.</li>
	</ol></li>
	<li>Elektrofysiologisk opptak
	<ol>
<li>Fyll mikropipetten med opptaksløsning.</li>
		<li>Med patchklemmeforsterkeren (se Materialtabell) i spenningsklemmekonfigurasjon måler du elektrodemotstanden i badekaret for å bekrefte riktig verdi.</li>
		<li>Bruk et 20x mål, plasser larvens hode i det sentrale synsfeltet og senk mikropipetten for å nå opptaksposisjonen i hjernen, innenfor det optiske tectum.</li>
		<li>Sett patchklemmeforsterkeren til strømklemmen og fest holdestrømmen til 0 mA.</li>
		<li>Ved hjelp av et low-pass filter på 1 kHz, en anskaffelsesrate på 1 kHz og en digital gevinst på 10, registrere spontan aktivitet i 60 min for å bestemme baseline aktivitetsnivåer.</li>
		<li>Etter 1 t basislinjeopptak, tilsett 200 μL pentylenetetrazol (PTZ, se Materialtabell) løsning 300 mmol/L i badekaret for en endelig konsentrasjon på 20 mmol/L PTZ.</li>
		<li>Registrer nevronaktiviteten i PTZ i ytterligere 120 minutter.</li>
	</ol></li>
	<li>Bestemmelse av depolariseringshendelse
	<ol>
<li>Feltregistreringshendelser har svært langsom dynamikk (frekvenser av interesse er i området 0,005-0,2 s-1). Filtrer derfor signalet med lav pass (Butterworth 5. rekkefølge LPF ved 100 s-1) for å unngå aliasing. Del opp de registrerte spenningsdataene fra anskaffelsesrammen (i dette tilfellet 1 ks-1) ned til 250 s-1 (RAW SIGNAL).</li>
		<li>Hvis du vil identifisere tidsstemplene for hver depolariseringshendelse, bruker du et DETECTION SIGNAL, som er en filtrert versjon av det innspilte signalet (Butterworth 1. rekkefølge HPF ved 0,01 s-1).</li>
		<li>Ved å eliminere lavfrekvente komponenter kan deteksjon av depolariseringshendelser utføres ved hjelp av en enkel terskelmetode. Bruk en fast terskel for støyeliminering og hendelsesdeteksjon (0,3 mV ble brukt for denne studien).</li>
		<li>Karakterisere depolariseringshendelsen ved hjelp av en rekke terskler som forekommer ved tidsintervaller som er mindre enn 4 s. Beregn starten og slutten på depolariseringshendelsen som bestemt fra påfølgende sekvenser av terskeloverganger. Hendelser som er kortere enn 40 ms, kan forkastes som støy.</li>
		<li>Beregn amplituden for hendelsene i det ufiltrerte (RAW SIGNAL) for å eliminere feil på grunn av effekten av lavpassfiltrering på toppen av hendelsen. Velg depolariseringsbølgen fra råsignalet ved hjelp av tidsstemplene som er bestemt i det filtrerte signalet. Mål amplituden som forskjellen mellom maksimums- og minimumsverdiene for bølgeløpet som er valgt fra råsignalet. MERK: Skriptfilene som skal utføre hendelsesbestemmelsen trinn 3.4 – Bestemmelse av depolarisering – og for å få tak i figur 1, leveres de som tilleggsfil som er vedlagt denne artikkelen.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Kabashi, E., Champagne, N., Brustein, E., Drapeau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+the+swim+of+things:+Recent+insights+to+neurogenetic+disorders+from+zebrafish.">In the swim of things: Recent insights to neurogenetic disorders from zebrafish.</a> Trends in Genetics. 26 (8), 373-381 (2010).</li><li>Baxendale, S., van Eeden, F., Wilkinson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Power+of+Zebrafish+in+personalised+medicine.">The Power of Zebrafish in personalised medicine.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. , (2017).</li><li>Baraban, S. C., Taylor, M. R., Castro, P. A., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pentylenetetrazole+induced+changes+in+zebrafish+behavior,+neural+activity+and+c-fos+expression.">Pentylenetetrazole induced changes in zebrafish behavior, neural activity and c-fos expression.</a> Neuroscience. , (2005).</li><li>Cunliffe, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+zebrafish+toolkit+for+investigating+the+pathobiology+of+epilepsy+and+identifying+new+treatments+for+epileptic+seizures.">Building a zebrafish toolkit for investigating the pathobiology of epilepsy and identifying new treatments for epileptic seizures.</a> Journal of Neuroscience Methods. , (2016).</li><li>Griffin, A., Krasniak, C., Baraban, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+epilepsy+treatment+through+personalized+genetic+zebrafish+models.">Advancing epilepsy treatment through personalized genetic zebrafish models.</a> Progress in Brain Research. , (2016).</li><li>Griffin, A., Hamling, K. R., Knupp, K., Hong, S. G., Lee, L. P., Baraban, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clemizole+and+modulators+of+serotonin+signalling+suppress+seizures+in+Dravet+syndrome.">Clemizole and modulators of serotonin signalling suppress seizures in Dravet syndrome.</a> Brain. , (2017).</li><li>Orellana-Paucar, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+from+zebrafish+and+mouse+models+on+the+activity+and+safety+of+ar-turmerone+as+a+potential+drug+candidate+for+the+treatment+of+epilepsy.">Insights from zebrafish and mouse models on the activity and safety of ar-turmerone as a potential drug candidate for the treatment of epilepsy.</a> PLoS ONE. , (2013).</li><li>Baxendale, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+compounds+with+anti-convulsant+properties+in+a+zebrafish+model+of+epileptic+seizures.">Identification of compounds with anti-convulsant properties in a zebrafish model of epileptic seizures.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. , (2012).</li><li>Bar-Peled, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tumor+suppressor+complex+with+GAP+activity+for+the+Rag+GTPases+that+signal+amino+acid+sufficiency+to+mTORC1.">A tumor suppressor complex with GAP activity for the Rag GTPases that signal amino acid sufficiency to mTORC1.</a> Science. 340 (6136), 1100-1106 (2013).</li><li>Ishida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+DEPDC5+cause+autosomal+dominant+focal+epilepsies.">Mutations of DEPDC5 cause autosomal dominant focal epilepsies.</a> Nature Genetics. , (2013).</li><li>Dibbens, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+DEPDC5+cause+familial+focal+epilepsy+with+variable+foci.">Mutations in DEPDC5 cause familial focal epilepsy with variable foci.</a> Nature Genetics. , (2013).</li><li>Baulac, S., Weckhuysen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DEPDC5-Related Epilepsy. GeneReviews®. , (1993).</li><li>Picard, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DEPDC5+mutations+in+families+presenting+as+autosomal+dominant+nocturnal+frontal+lobe+epilepsy.">DEPDC5 mutations in families presenting as autosomal dominant nocturnal frontal lobe epilepsy.</a> Neurology. , (2014).</li><li>Teng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+zebrafish+lgi1a+results+in+abnormal+development,+brain+defects+and+a+seizure-like+behavioral+phenotype.">Knockdown of zebrafish lgi1a results in abnormal development, brain defects and a seizure-like behavioral phenotype.</a> Human Molecular Genetics. , (2010).</li><li>Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+in+Scn1a+zebrafish+mutant+identifies+clemizole+as+a+potential+Dravet+syndrome+treatment.">Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment.</a> Nature Communications. , (2013).</li><li>Suls, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+loss-of-function+mutations+in+CHD2+cause+a+fever-sensitive+myoclonic+epileptic+encephalopathy+sharing+features+with+dravet+syndrome.">De novo loss-of-function mutations in CHD2 cause a fever-sensitive myoclonic epileptic encephalopathy sharing features with dravet syndrome.</a> American Journal of Human Genetics. , (2013).</li><li>Grone, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epilepsy,+behavioral+abnormalities,+and+physiological+comorbidities+in+syntaxin-binding+protein+1+(STXBP1)+mutant+zebrafish.">Epilepsy, behavioral abnormalities, and physiological comorbidities in syntaxin-binding protein 1 (STXBP1) mutant zebrafish.</a> PLoS ONE. , (2016).</li><li>de Calbiac, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DEPDC5+knockdown+causes+mTOR-dependent+motor+hyperactivity+in+zebrafish.">DEPDC5 knockdown causes mTOR-dependent motor hyperactivity in zebrafish.</a> Annals of Clinical and Translational Neurology. , (2018).</li><li>Panchaud, N., P&#233;li-Gulli, M. P., De Virgilio, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acid+deprivation+inhibits+TORC1+through+a+GTPase-activating+protein+complex+for+the+Rag+family+GTPase+Gtr1.">Amino acid deprivation inhibits TORC1 through a GTPase-activating protein complex for the Rag family GTPase Gtr1.</a> Science Signaling. , (2013).</li><li>Lim, K. R. Q., Maruyama, R., Yokota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eteplirsen+in+the+treatment+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Eteplirsen in the treatment of Duchenne muscular dystrophy.</a> Drug Design, Development and Therapy. , (2017).</li><li>Kok, F. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+genetic+screening+reveals+poor+correlation+between+morpholino-induced+and+mutant+phenotypes+in+zebrafish.">Reverse genetic screening reveals poor correlation between morpholino-induced and mutant phenotypes in zebrafish.</a> Developmental Cell. , (2015).</li><li>Rossi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+compensation+induced+by+deleterious+mutations+but+not+gene+knockdowns.">Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns.</a> Nature. , (2015).</li><li>Stainier, D. Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+morpholino+use+in+zebrafish.">Guidelines for morpholino use in zebrafish.</a> PLoS Genetics. , (2017).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental dynamics an official public. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>M&#248;ller, R. S., Dahl, H. A., Helbig, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+next+generation+sequencing+to+epilepsy+genetics.">The contribution of next generation sequencing to epilepsy genetics.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. , (2015).</li><li>Allen, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+mutations+in+epileptic+encephalopathies.">De novo mutations in epileptic encephalopathies.</a> Nature. , (2013).</li><li>Dunn, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+sequencing+methods+for+diagnosis+of+epilepsy+syndromes.">Next generation sequencing methods for diagnosis of epilepsy syndromes.</a> Frontiers in Genetics. , (2018).</li><li>Grone, B. P., Baraban, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+in+epilepsy+research:+Legacies+and+new+directions.">Animal models in epilepsy research: Legacies and new directions.</a> Nature Neuroscience. , (2015).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+characterization+of+an+antisense+knockdown+zebrafish+model+of+Dravet+syndrome:+Inhibition+of+epileptic+seizures+by+the+serotonin+agonist+fenfluramine.">Pharmacological characterization of an antisense knockdown zebrafish model of Dravet syndrome: Inhibition of epileptic seizures by the serotonin agonist fenfluramine.</a> PLoS ONE. , (2015).</li><li>Swaminathan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-canonical+mTOR-Independent+Role+of+DEPDC5+in+Regulating+GABAergic+Network+Development.">Non-canonical mTOR-Independent Role of DEPDC5 in Regulating GABAergic Network Development.</a> Current Biology. , (2018).</li><li>Samarut, &. #. 2. 0. 1. ;., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#947;-Aminobutyric+acid+receptor+alpha+1+subunit+loss+of+function+causes+genetic+generalized+epilepsy+by+impairing+inhibitory+network+neurodevelopment.">&#947;-Aminobutyric acid receptor alpha 1 subunit loss of function causes genetic generalized epilepsy by impairing inhibitory network neurodevelopment.</a> Epilepsia. , 2061-2074 (2018).</li><li>Turrini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+mapping+of+neuronal+activity+during+seizures+in+zebrafish.">Optical mapping of neuronal activity during seizures in zebrafish.</a> Scientific Reports. , (2017).</li><li>Rosch, R. E., Hunter, P. R., Baldeweg, T., Friston, K. J., Meyer, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+and+dynamic+causal+modelling+reveal+brain-wide+changes+in+effective+connectivity+and+synaptic+dynamics+during+epileptic+seizures.">Calcium imaging and dynamic causal modelling reveal brain-wide changes in effective connectivity and synaptic dynamics during epileptic seizures.</a> PLoS Computational Biology. , (2018).</li><li>Baraban, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forebrain+Electrophysiological+Recording+in+Larval+Zebrafish.">Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2013).</li><li>Afrikanova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+the+Zebrafish+Pentylenetetrazol+Seizure+Model:+Locomotor+versus+Electrographic+Responses+to+Antiepileptic+Drugs.">Validation of the Zebrafish Pentylenetetrazol Seizure Model: Locomotor versus Electrographic Responses to Antiepileptic Drugs.</a> PLoS ONE. , (2013).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Epilepsi er en kompleks nevrologisk sykdom, med et bredt spekter av etiologier som begynner å bli belyst med fremkomsten av genetisk sekvenseringsteknologi25,26,27. Allsidige dyremodeller er avgjørende for en effektiv translasjonsstrategi som vil gi både innsikt i de patologiske mekanismene til genetisk koblede epilepsier, samt målrettede terapier for de distinkte formene for denne tilstanden. Sebrafiskmodeller har vært svært effektive til å reprodusere store egenskaper ved epilepsi og gi pålitelige avlesninger for antiepileptikascreening5,28. Spontane anfall kan påvises i genetisk modifisert sebrafisk15,29,30,31 og nevrofysiologisk analyse i disse modellene28 har bekreftet det nevronale grunnlaget for epileptisk-lignende oppførsel32,33. Små zebrafish larver er egnet til kjemiske skjermer i 96-brønns format ved hjelp av automatisert deteksjon av enkel oppførsel, for eksempel spontan svømming, noe som muliggjør rask påvisning av potensielle terapeutiske midler.
DEPDC5-nedslagsmodellen som presenteres her, oppnås ved injeksjon av AMO i sebrafiskembryoet for å blokkere genuttrykk under utvikling. Denne modellen presenterer flere keystone fenotypiske egenskaper under forskjellige tidspunkter for larvutvikling, som kan brukes som indikatorer på terapieffektivitet under en kjemisk eller genetisk screeningprotokoll. Den AMO-medierte gen-knock-down er en kraftig teknikk som viser fordeler i forhold til kjemisk induserte anfallsmodeller, da det spesifikt retter seg mot uttrykket av et gen av interesse, og dermed tillater identifisering av de underliggende patogene mekanismene utløst av en genetisk mutasjon. Kjemiske indusere, som likevel er potente verktøy for narkotikascreening, kan virke gjennom flere cellulære veier som kanskje ikke alltid er relevante for den genetiske mutasjonen som studeres. Mens AMO-injeksjon i seg selv er en enkel teknikk når den mestres av eksperimentet, presenterer den også en rekke begrensninger. Injeksjonene må utføres på ett cellestadium embryo; i våre hender økte injeksjoner på senere stadier sterkt variasjonen av fenotypen. Dette begrenser tiden som er tilgjengelig for injeksjon; Derfor er en strategi for å generere egg til injeksjon i en tidssekvens nyttig. Vi bruker rutinemessig 4-5 kryss som vi åpner med 15-20 min intervaller, slik at injeksjon av en clutch før du får den neste. Videre må det tas hensyn til å vurdere fenotypen samtidig mellom ulike eksperimenter, da stereotype atferd utvikler seg raskt i løpet av de første utviklingsdagene. Volumet og konsentrasjonen av AMOer må også kontrolleres nøye, da generell toksisitet på grunn av injeksjon av store mengder vil maskere den spesifikke fenotypen. De ulike kontrollene som presenteres i innledningen er avgjørende for å bestemme riktig injeksjonsdose og den tilsvarende fenotypen.
Feltopptak av larval sebrafiskhjernen er et nyttig verktøy for å undersøke de skadelige effektene av genetiske mutasjoner involvert i forskjellige hjernesykdommer på den globale nevronaktiviteten34. Depolariseringshendelser sett under disse eksperimentelle forholdene er en etablert metode for å vurdere elektrofysiologiske effekter av legemidler under forskjellige epileptiske forhold15,35. Vurderingen av disse effektene er imidlertid for det meste gjort kvalitativt i stedet for kvantitativt, og har en subjektiv observatør som aktør i analysen. Her utvikler vi en automatisk deteksjonsstrategi som objektivt kan kvantifisere depolariseringshastigheten, deres amplitude og varighet, og kan evaluere fremdriften av disse parametrene over tid, eller med forskjellige genetiske eller farmakologiske intervensjoner.
De representative resultatene som presenteres her viser den forventede feltaktiviteten til DEPDC5 knock-down genetisk modell i forhold til en Mismatch kontroll i 4-6 dpf sebrafisk, før og etter anvendelsen av PTZ for å introdusere epileptiform-lignende elektrografisk aktivitet. Tidligere har vi vist en betydelig økning i basalaktiviteten til DEPDC5 knockdown tilstand18. Her viser vi at responsen fra disse to forholdene til PTZ, en kjemisk epileptiform aktivitets induser, har en lignende bane i tide, starter med en periode med relativt lav frekvens, høy amplitude depolarisering hendelser og fortsetter med en periode med høyere frekvens, lavere amplitude depolarisering hendelser. Feltregistreringshendelser har langsom dynamikk (frekvenser av interesse er i området 0,005-0,2 s-1), derfor brukes både lavpass- og høypassfiltre i denne protokollen for å isolere hendelsene av interesse. Etter å ha eliminert lavfrekvent støy, utføres påvisning av depolariseringshendelser ved hjelp av en enkel terskel. Siden statistikken over signalet er sterkt påvirket av tilstedeværelsen av depolariseringshendelser, kunne vi ikke bruke standardavviket til det totale signalet for å bestemme denne terskelen. Variasjonen av verdien av standardavviket på tvers av datasett var større enn de observerte registreringsstøynivåene. Derfor, etter visuell inspeksjon av sporene, brukte vi en fast verdi av terskelen på 0,3 mV, for å unngå skjevheter forårsaket av forskjellige nivåer av depolariseringsaktivitet.
Den beskrevne protokollen gir en standardisert og enkel metode for evaluering av motorisk oppførsel og nevronal feltaktivitet, via ekstracellulær strømspenningsopptak kombinert med automatisk deteksjon av depolariseringshendelser i det optiske tectum, for å karakterisere epileptiformlignende fenotyper i sebrafiskmodeller.

På grunn av sin lille størrelse, oviparous utvikling og åpenhet i tidlige stadier av utviklingen, har sebrafisk dukket opp som en verdifull virveldyrorganisme for modellering av menneskelige sykdommer så forskjellige som kardiovaskulære, kreft- eller nevrologiske lidelser1,2. Sebrafisk kombinerer fordelene ved en virveldyr, inkludert høy bevaring av organarkitektur og genetisk kode, med den lille størrelsen og enkel genetisk manipulering av enklere modellorganismer, og letter derfor både grunnleggende studier og translasjonelle applikasjoner. Spesielt har dens manglende evne til automatisert screening av atferd og fluorescerende markører av cellulære prosesser gjort sebrafisk til en spesielt attraktiv modell for epilepsiforskning. Dette har blitt demonstrert av en høy økning i det siste tiåret av antall publikasjoner med kjemisk induserte og / eller genetiske modeller av epilepsi3,4,5 og, mer nylig, rapporter om lovende terapeutiske midler hentet fra kjemiske skjermer i disse modellene6,7,8.
DEPDC5 er medlem av GATOR1-komplekset, en negativ regulator av mTOR-signalering9. Mutasjoner i DEPDC5-genet har først blitt oppdaget i 2013 i proband som lider av autosomale dominerende fokale epilepsier10,11, og har siden blitt rapportert i en rekke kliniske forhold forbundet med fokal epileptiske manifestasjoner og fokal kortikale dysplasi12. Det store flertallet av rapporterte mutasjoner er spådd å forårsake tap av funksjon av genet12, og dette ble formelt demonstrert for en rekke DEPDC5 muterte transkripsjoner som er målrettet av tull mediert mRNA forfall12,13. I samsvar resulterer nedslag av genet orthologue i sebrafisk ved hjelp av antisense morpholino oligonukleotider (AMOer) i en rekke funksjoner som er felles for epileptiske modeller i denne organismen, inkludert hyperaktivitet, svinghjullignende svømming, spontane anfall og forbedret nevronal aktivitet14,15,16,17,18. Interessant, behandling med rapamycin, en hemmer av mTOR-signalering, reverserte atferdsfunksjonene i denne modellen18, støtter hypotesen om at DEPDC5 tap av funksjon kan utløse epilepsi på grunn av en feilregulering av mTOR-banen9,19.
Forbigående nedslag av genuttrykk in vivo ved hjelp av antisense oligonukleotider som bærer morpholino modifikasjon har vært et uvurderlig verktøy for å studere rollen som spesifikke gener, på linje med si / shRNA-baserte teknikker. Nylig har AMO-baserte strategier også funnet kliniske applikasjoner, med en første AMO-terapi som mottar FDA-godkjenning for behandling av Duchenne muskelatrofi i 201620. Mens det ble rapportert at i sebrafisk fenotypen av akutt AMO-basert gen knock-down ikke alltid korrelere med de konstitutive knock-out modeller21, dette kan skyldes i det minste i noen tilfeller kompenserende mekanismer som fremkalles av konstitutive genetiske modifikasjoner22. Imidlertid er spørsmålet om spesifisitet av den AMO-induserte fenotypen en ubestridelig bekymring som må tas opp flittig i studier ved hjelp av denne teknologien23. For å sikre spesifisiteten til den AMO-baserte knock-down fenotypen, er det nødvendig med flere nøkkelkontroller. Disse inkluderer en doseresponskurve som gjør det mulig å velge den laveste dosen av AMO effektiv for gen-knock-down, og unngår generell toksisitet på grunn av innføring av et overskudd av genetisk materiale. Bruk av en mismatch AMO som ikke retter seg mot noen bestemt region i genomet er også nødvendig for å etablere en passende dose og i å identifisere en bestemt fenotype. En annen AMO som retter seg mot en annen region av samme gen, for eksempel en skjøteblokkerende AMO, er nødvendig for å bekrefte at fenotypen skyldes nedslag av målgenet. Redning av knock-down fenotypen med cDNA av genet, enten den menneskelige orthologue eller en codon-modifisert versjon av sebrafiskgenet som ikke kan målrettes av AMO, gir et sterkt argument til fordel for fenotype spesifisiteten. Mangel på redning med samme cDNA som inneholder tap av funksjon mutasjoner (som innføring av en tidlig stopp codons) er et ytterligere bevis i denne retningen.
Her presenterer vi en metode for å generere en sebrafisk DEPDC5 tap av funksjonsmodell og protokollen for atferdsfenotyping ved 28 og 48 h etter befruktning (hpf). Ved 28 hkf forårsaker DEPDC5 tap av funksjon generell hyperaktivitet, som det fremgår av forbedrede spole- og rykningsbevegelser av embryoene i koret. Et automatisert bevegelsesdeteksjonssystem kan brukes på dette stadiet for å kvantifisere den totale aktiviteten per embryo. Ved 48 hk viser sebrafisk stereotypt rømningssvømming som svar på berøring. I sebrafisk med nedregulert uttrykk for DEPDC5er svømmebanen betydelig mer tortuous enn i kontroller, fisken viser en "kork-skrue" eller "svinghjul" som mønster, ligner andre rapporterte epilepsimodeller i denne organismen3,4. Elektrofysiologiske opptak ble oppnådd i det optiske tectum i sebrafisk larver mellom 4-6 dager etter befruktning (dpf) og viser en baseline økning i nevronaktivitet i DEPDC5 knock-down dyr. Fordelen med denne modellen er at den presenterer flere fenotypiske egenskaper på forskjellige tidspunkter, noe som kan være nyttig for å overvåke og vurdere effekten av narkotikabehandlinger under utvikling.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:751px;" width="750">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:197px;">Agarose</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich, France</td>
			<td style="width:84px;">A9539</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aquarium salt&#160;</td>
			<td>Instant Ocean, Blacksburg, VA</td>
			<td>SS15-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass with filament</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF100-50-10</td>
			<td>OD: 1,5mm, ID: 0,5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Depdc5-atg antisense morpholino</td>
			<td>GeneTools, OR, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>sequence 5&#8217;- TGCCTTCATGGTGACCGTCATTTTA -3&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Depdc5-mis antisense morpholino</td>
			<td>GeneTools, OR, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>sequence 5&#8217;- TGCgTTgATcGTGACCcTgATTTTA -3&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Depdc5-splice antisense morpholino</td>
			<td>GeneTools, OR, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>sequence 5&#8217;- ACATTCCTGTTTCACCATAGATGAT -3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digitizer</td>
			<td>Molecular Devices, CA, USA</td>
			<td>Digidata 1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fast Green Dye</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td>F7258</td>
			<td>Stock solution of 0.2%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass-bottom petri dishes</td>
			<td>Ibidi, Germany</td>
			<td>81218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td>68270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Grasshopper 2 camera</td>
			<td style="width:163px;">FLIR, BC, Canada</td>
			<td>GRAS-03K2M-C</td>
			<td>formerly Point Grey Research</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human wild-type DEPDC5 cDNA</td>
			<td>Dharmacon, France</td>
			<td>NM_001242897.1</td>
			<td>&#160;Accession: BC144291 Clone ID 905</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ software</td>
			<td>NIH, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td>P9333&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matlab software</td>
			<td>MathWorks, MA, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td>S7653&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td>71687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pancuronium bromide&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Alomone Labs</td>
			<td style="width:84px;">P-130</td>
			<td style="width:307px;">Stock solution of 60mM in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parafilm</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td>P7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Patch clamp amplifier</td>
			<td>Molecular Devices, CA, USA</td>
			<td>MultiClamp 700B</td>
			<td>Computer-controled patch clamp amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pClamp10 acquisition software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pentylenetetrazol (PTZ)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td>P6500</td>
			<td>Stock solution of 300mM (dissolved in recording solution)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipette puller</td>
			<td>Narishige, Japan</td>
			<td>PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pneumatic PicoPump&#160;</td>
			<td>WPI, France</td>
			<td>PV 820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sylgard 184 kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich Intl.</td>
			<td>761036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transfer plastic pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td>Z350605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zebralab</td>
			<td>Viewpoint, France</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

behavioral and physiological analysis in a zebrafish model of epilepsy

Epilepsi representerer en av de vanligste nevrologiske lidelsene, og påvirker anslagsvis 50 millioner mennesker over hele verden. Nylige fremskritt innen genetisk forskning har avdekket et stort spekter av gener involvert i ulike former for epilepsi, og fremhever den heterogene naturen til denne lidelsen. Egnede dyremodeller er avgjørende for å undersøke de patologiske mekanismene utløst av genetiske mutasjoner implisert i epilepsi og for å utvikle spesialiserte, målrettede terapier. I de senere år har sebrafisk dukket opp som en verdifull virveldyrorganisme for modellering av epilepsier, med bruk av både genetisk manipulasjon og eksponering for kjente epileptogene legemidler, som pentylenetetrazol (PTZ), for å identifisere nye antiepileptika. Skadelige mutasjoner i mTOR-regulatoren DEPDC5 har vært assosiert med ulike former for fokale epilepsier og nedslag av sebrafisk orthologue forårsaker hyperaktivitet forbundet med spontane anfallslignende episoder, samt forbedret elektrografisk aktivitet og karakteristisk svinghjulssvømming. Her beskrev vi metoden som er involvert i å generere DEPDC5 tap av funksjonsmodell og illustrere protokollen for å vurdere motoraktivitet ved 28 og 48 h post befruktning (hpf), samt en metode for registrering av feltaktivitet i sebrafiskoptiske tectum. En illustrasjon av effekten av det epileptogene stoffet PTZ på nevronal aktivitet over tid er også gitt.

Figur 1 viser representative spenningsspor av 4-6 dpf sebrafisk larve ekstracellulære feltopptak ved to genetiske forhold: Mismatch control og DEPDC5 knock-down. I basisperioden for innspillingen viser DEPDC5-nedslag en høyere forekomst av spontane hendelser, mens mismatch-kontrollen viser svært få svingninger. Disse aktivitetsmønstrene er representative for den betydelige økningen i nevronaktivitet på grunn av tap av funksjon av DEPDC5, som vi tidligere har rapportert18. Etter PTZ-programmet viser både Mismatch-kontroll og DEPDC5-nedslag et økt antall depolariseringshendelser. I løpet av den første perioden etter PTZ-påføring (10 – 60 min) observeres en frekvens på 0,8 hendelser per min i både mismatchkontroll og DEPDC5-nedslag, der de fleste hendelsene er av høy amplitude (>1 mV). I løpet av sistnevnte responsperiode (60 – 120 min etter PTZ-søknad) øker depolariseringshendelsene til rundt 1 hendelse per min, og de fleste hendelsene er av lav amplitude (≤1 mV).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58837/58837fig1.jpg"> Figur 1: Eksempelspor av feltopptak i zebrafish larver hjerne. (A) Oversikt over 180 min opptak for en Mismatch kontroll larve og en DEPDC5 Knock-down. Først ble spontan baselineaktivitet registrert, så ble PTZ brukt i badekar (rød bar). (B) Peri-stimulus tid histogrammer av depolarisering hendelser for Mismatch kontroll og DEPDC5 knock-down. Hendelsene ble klassifisert som høy amplitude (>1 mV - blå) og lav amplitude (≤1 mV - svart). (C-E) Eksempel på spor av de ulike periodene i opptaket: (C) spontan aktivitet, (D) Høy amplitudehendelser i den første perioden etter PTZ-applikasjonen, (E) Lav amplitudehendelser i siste periode etter PTZ-applikasjonen. Legg merke til at skriptfilene for å få tak i disse tallene er angitt som Tilleggsfil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58837/58837fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Tilleggsfil: Skriptfiler for trinn 3.4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58837/Supplementary_File.zip" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Behavioral And Physiological Analysis In A Zebrafish Model Of Epilepsy at JoVE.com

Behavioral And Physiological Analysis In A Zebrafish Model Of Epilepsy

Her presenterer vi en protokoll for utvikling og karakterisering av en sebrafiskmodell av epilepsi som følge av den forbigående hemmingen av DEPDC5-genet.

Atferds- og fysiologisk analyse i en sebrafiskmodell av epilepsi

Epilepsy represents one of the most common neurological disorders, affecting an estimated 50 million people worldwide. Recent advances in genetic research ...

Denne protokollen gir en rask måte å evaluere effekten av nedslag av WC5-genet, som er den vanligste årsaken til fokal epilepsi. Den største fordelen med denne teknikken er at vi kan bruke den til å vurdere epilepsien, som fenotype ved hjelp av både atferdsmessige og fysiologiske egenskaper på ulike stadier av utvikling. En dag før mikroinjeksjonen, sett opp Zebrafish parringstanker.På morgenen av injeksjonen, fjern skilleveggene for å aktivere gyting. Bruk en fin sil for å overføre eggene til 100 millimeter Petri-retter, fylt med embryovann. Bruk en pasteurpipet i plast, Velg 60 til 80 egg, og ordne eggene i en silikonbelagt Petri-tallerken til injeksjonen.vi beveger det meste av vannet, og etterlater akkurat nok til å dekke eggene halvveis. Plasser en glassnål vertikalt i et rør med injeksjonsoppløsning. La den fargede løsningen fylle røret ved kapillær virkning over en periode på flere minutter.Når injeksjonsoppløsningen er synlig i nålens spiss, monterer du nålen på mikroinjektorens injektorens injektor og slår på luftkompressoren. Juster trykkinnstillingen for å generere et to nanoliter injeksjonsvolum. Og for å plassere eggene under et dissekert kikkertmikroskop, med en fire ganger forstørrelse.Sett nålespissen gjennom koreksjonen og eggeplommen av entrinns embryoer for å injisere løsningen direkte i hver celle. Overfør deretter de injiserte embryoene til en merket 100 millimeter Petri-tallerken med embryovann, og legg platen i en 28 grader Celsius inkubator. 28 timer etter befruktning, legg en plast 1,2 x 1,2 millimeter nettinggitter på bunnen av testfatet.Bruk en pasteurpipette i plast til å plassere 10 til 12 embryoer i korionene på plastnettet. Fyll parabolen med nok embryovann til å holde embryoet nedsenket, men ikke flytende, forsiktig flytte embryoene med en plastspiss på plass på rutenettet etter behov. Deretter, ved hjelp av et videokamera festet til et Dissection Microscope, ta opp den spontane spoleaktiviteten i 10 til 20 minutter.For å analysere den totale spontane bevegelsen, bruk aktivitetskvartifiseringsmodulen i et Zebra-laboratoriesystem for å laste opp den innspilte videoen og for å designe sporingsarenaene rundt hvert embryo etter behov. Sett fryse- og bristeterskler til henholdsvis 10 og 50. Og når den automatiserte videoanalysen, som kvantifiserer den totale aktiviteten inne i hver av de definerte arenaene.Deretter gjenoppretter du datasettet som et regneark for å utføre analysen, ved hjelp av riktig dataanalyseprogramvare. 46 timer etter befruktning, bruk fine tang for å dechorionate embryoene, og fyll en 130 millimeter testrett med embryovann. Minst 15 minutter før resten, varm testretten i en 28 grader Celsius inkubator.For å utføre en berøring fremkalt escape response test, bruk en plast Pasteur pipette for å plassere et embryo i midten av testretten, under kameraet. Start innspillingen med en anskaffelsesrate på 30 bilder per sekund. Bruk en fin plastspiss, berør embryoets hale litt med en flikkbevegelse.Stoppe opptaket, når larven har avsluttet sin bevegelse. Overfør deretter embryoet til en ny oppbevaringsfat fylt med friskt embryovann, og gjenta testen med så mange embryoer som nødvendig for hver eksperimentell tilstand. For å forberede Zebra-fisken til elektrofysiologisk analyse, plasser en, fire til seks dager etter befruktningsfisk i en glassbunn Petri-tallerken.Fjern eventuelt overflødig, ekstra sjømannsmedium for å sikre at fisken vil være så nær bunnen av parabolen som mulig. Bruk en plast pasteur pipette for å legge til nok varme flytende agros til å dekke larven. Mens agros hardner, bruk fine tang for å orientere fisken ventral side ned i midten av parabolen.Tilsett deretter to milliliter opptaksløsning, som inneholder 10 mikromolar pancuroniumbromid til parabolen for å blokkere nevromuskulær overføring. Fyll deretter en mikropipettering med opptaksløsning, og bruk en patchklemmeforsterker i spenningsklemmekonfigurasjonen for å måle elektrodemotstanden i badekaret for å bekrefte riktig verdi. Bruk et 20x mål, plasser larvens hode i det sentrale synsfeltet, og senk mikropipet for å nå opptaksposisjonen i det optiske tectumet.bytt patchklemmeforsterkeren til gjeldende klemmekonfigurasjon og fest holdestrømmen til null milliamp. Ved hjelp av et lavpassfilter på en kilohertz, og anskaffelsesgrad på ett kilohertz, og en digital gevinst på 10, registrerer du fiskens spontane aktivitet i 60 minutter for å bestemme de grunnleggende aktivitetsnivåene. På slutten av basisopptaket, ved 143 mikroliter av en 300 millimolar per liter pentylenetetrazolløsning til badet, for en endelig konsentrasjon på 20 millimolar per liter.Registrer dyrets nevronale aktivitet i pentylenetetrazoloppløsning i ytterligere 120 minutter. I løpet av basisperioden for opptaket viser fire til seks dager etter befruktning epileptiske modeller sebrafisk en høyere forekomst av spontane hendelser, mens mismatch kontroll fisk viser svært få svingninger. Etter pentylenetetrazolapplikasjon viser både mismatchkontroll og epileptiske modeller sebrafisk et økt antall dype polariseringshendelser.I løpet av den første perioden etter pentylenetetrazolapplikasjon observeres en hastighet på 0,8 hendelser per minutt i både mismatchkontroll og slå ned dyr som de fleste hendelser er av høy amplitude. I løpet av den siste responsperioden. Frekvensen av depolariseringshendelser øker til rundt én hendelse per minutt.Og de fleste hendelsene er av lav amplitude. Når du utfører knock down, er det svært viktig å etablere riktig dose morpholinos ved hjelp av en doseresponskurve og å utføre kontroller for å unngå ikke-spesifikke toksisiteter. Dette presset for å muliggjøre flere nedstrømsstudier, inkludert testing av effekten av genetiske eller kjemiske modifikatorer.Og sebrafiskens atferd og nevrale aktiviteter for å forstå utviklingseffektene av DC fem mutasjoner.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A General Method for Evaluating Incubation of Sucrose Craving in Rats

En generell metode for evaluering Inkubasjon av Sukrose Begjær i Rats

For someone on a food-restricted diet, food craving in response to food-paired cues may serve as a key behavioral transition point between abstinence and ...

A Lightweight, Headphones-based System for Manipulating Auditory Feedback in Songbirds

En lett, hodetelefoner-basert system for å manipulere Auditiv tilbakemelding i Songbirds

Experimental manipulations of sensory feedback during complex behavior have provided valuable insights into the computations underlying motor control and ...

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish

Forebrain Elektrofysiologisk opptak i larve Sebrafisk

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked ...

Recording and Analysis of Circadian Rhythms in Running-wheel Activity in Rodents

When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, ...

Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

Automatiserte høy gjennomstrømming Behavioral Analyser i sebrafisk Larver

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

Funksjonell analyse av larve Fôring Circuit i Drosophila</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

The Power of Interstimulus Interval for the Assessment of Temporal Processing in Rodents

Kraften i Interstimulus intervall for vurdering av timelige behandling i gnagere

Temporal processing deficits have been implicated as a potential elemental dimension of higher-level cognitive processes, commonly observed in ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

Ballistisk merking av pyramidale nevroner i hjerneskiver og i primær cellekultur

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...

A Rat Model of EcoHIV Brain Infection

En rottemodell av EcoHIV hjerneinfeksjon

It has been well studied that the EcoHIV infected mouse model is of significant utility in investigating HIV associated neurological complications. ...