Name: behavioral and physiological analysis in a zebrafish model of epilepsy
Uploaded: 2021-10-19T13:00:00
Duration: 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Behavioral And Physiological Analysis In A Zebrafish Model Of Epilepsy at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить сотрудников электрофизиологической платформы ICM, где проводились нейрофизиологические эксперименты. Мы также благодарим Anca Marian за техническую помощь. SC был поддержан грантом на батуте No 21488. EK был поддержан грантом AFM No 18469 и грантом ERC Consolidator Grant (ALS-Networks). HC был поддержан наградами PhD от Фонда медицинских наук (PLP20141031462) и ARSLA. Для AD и RM эта работа была поддержана тремя грантами от Национального управления по научным исследованиям и инновациям Румынии, CNCS-UEFISCDI (номера проектов PN-III-P4-ID-PCE-2016-0010, PN-III-P2-2.1-PED-2016-0007 и COFUND-NEURON-NMDAR-PSY), грантом исследовательской и инновационной программы Европейского Союза Horizon 2020 - грантовое соглашение No 668863-SyBil-AA и грантом Национального научного фонда NSF-IOS-1656830, финансируемым правительством США.

<ol>
	<li>Kabashi, E., Champagne, N., Brustein, E., Drapeau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+the+swim+of+things:+Recent+insights+to+neurogenetic+disorders+from+zebrafish.">In the swim of things: Recent insights to neurogenetic disorders from zebrafish.</a> Trends in Genetics. 26 (8), 373-381 (2010).</li><li>Baxendale, S., van Eeden, F., Wilkinson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Power+of+Zebrafish+in+personalised+medicine.">The Power of Zebrafish in personalised medicine.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. , (2017).</li><li>Baraban, S. C., Taylor, M. R., Castro, P. A., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pentylenetetrazole+induced+changes+in+zebrafish+behavior,+neural+activity+and+c-fos+expression.">Pentylenetetrazole induced changes in zebrafish behavior, neural activity and c-fos expression.</a> Neuroscience. , (2005).</li><li>Cunliffe, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+zebrafish+toolkit+for+investigating+the+pathobiology+of+epilepsy+and+identifying+new+treatments+for+epileptic+seizures.">Building a zebrafish toolkit for investigating the pathobiology of epilepsy and identifying new treatments for epileptic seizures.</a> Journal of Neuroscience Methods. , (2016).</li><li>Griffin, A., Krasniak, C., Baraban, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+epilepsy+treatment+through+personalized+genetic+zebrafish+models.">Advancing epilepsy treatment through personalized genetic zebrafish models.</a> Progress in Brain Research. , (2016).</li><li>Griffin, A., Hamling, K. R., Knupp, K., Hong, S. G., Lee, L. P., Baraban, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clemizole+and+modulators+of+serotonin+signalling+suppress+seizures+in+Dravet+syndrome.">Clemizole and modulators of serotonin signalling suppress seizures in Dravet syndrome.</a> Brain. , (2017).</li><li>Orellana-Paucar, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+from+zebrafish+and+mouse+models+on+the+activity+and+safety+of+ar-turmerone+as+a+potential+drug+candidate+for+the+treatment+of+epilepsy.">Insights from zebrafish and mouse models on the activity and safety of ar-turmerone as a potential drug candidate for the treatment of epilepsy.</a> PLoS ONE. , (2013).</li><li>Baxendale, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+compounds+with+anti-convulsant+properties+in+a+zebrafish+model+of+epileptic+seizures.">Identification of compounds with anti-convulsant properties in a zebrafish model of epileptic seizures.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. , (2012).</li><li>Bar-Peled, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tumor+suppressor+complex+with+GAP+activity+for+the+Rag+GTPases+that+signal+amino+acid+sufficiency+to+mTORC1.">A tumor suppressor complex with GAP activity for the Rag GTPases that signal amino acid sufficiency to mTORC1.</a> Science. 340 (6136), 1100-1106 (2013).</li><li>Ishida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+DEPDC5+cause+autosomal+dominant+focal+epilepsies.">Mutations of DEPDC5 cause autosomal dominant focal epilepsies.</a> Nature Genetics. , (2013).</li><li>Dibbens, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+DEPDC5+cause+familial+focal+epilepsy+with+variable+foci.">Mutations in DEPDC5 cause familial focal epilepsy with variable foci.</a> Nature Genetics. , (2013).</li><li>Baulac, S., Weckhuysen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DEPDC5-Related Epilepsy. GeneReviews®. , (1993).</li><li>Picard, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DEPDC5+mutations+in+families+presenting+as+autosomal+dominant+nocturnal+frontal+lobe+epilepsy.">DEPDC5 mutations in families presenting as autosomal dominant nocturnal frontal lobe epilepsy.</a> Neurology. , (2014).</li><li>Teng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+zebrafish+lgi1a+results+in+abnormal+development,+brain+defects+and+a+seizure-like+behavioral+phenotype.">Knockdown of zebrafish lgi1a results in abnormal development, brain defects and a seizure-like behavioral phenotype.</a> Human Molecular Genetics. , (2010).</li><li>Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+in+Scn1a+zebrafish+mutant+identifies+clemizole+as+a+potential+Dravet+syndrome+treatment.">Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment.</a> Nature Communications. , (2013).</li><li>Suls, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+loss-of-function+mutations+in+CHD2+cause+a+fever-sensitive+myoclonic+epileptic+encephalopathy+sharing+features+with+dravet+syndrome.">De novo loss-of-function mutations in CHD2 cause a fever-sensitive myoclonic epileptic encephalopathy sharing features with dravet syndrome.</a> American Journal of Human Genetics. , (2013).</li><li>Grone, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epilepsy,+behavioral+abnormalities,+and+physiological+comorbidities+in+syntaxin-binding+protein+1+(STXBP1)+mutant+zebrafish.">Epilepsy, behavioral abnormalities, and physiological comorbidities in syntaxin-binding protein 1 (STXBP1) mutant zebrafish.</a> PLoS ONE. , (2016).</li><li>de Calbiac, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DEPDC5+knockdown+causes+mTOR-dependent+motor+hyperactivity+in+zebrafish.">DEPDC5 knockdown causes mTOR-dependent motor hyperactivity in zebrafish.</a> Annals of Clinical and Translational Neurology. , (2018).</li><li>Panchaud, N., P&#233;li-Gulli, M. P., De Virgilio, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acid+deprivation+inhibits+TORC1+through+a+GTPase-activating+protein+complex+for+the+Rag+family+GTPase+Gtr1.">Amino acid deprivation inhibits TORC1 through a GTPase-activating protein complex for the Rag family GTPase Gtr1.</a> Science Signaling. , (2013).</li><li>Lim, K. R. Q., Maruyama, R., Yokota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eteplirsen+in+the+treatment+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Eteplirsen in the treatment of Duchenne muscular dystrophy.</a> Drug Design, Development and Therapy. , (2017).</li><li>Kok, F. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+genetic+screening+reveals+poor+correlation+between+morpholino-induced+and+mutant+phenotypes+in+zebrafish.">Reverse genetic screening reveals poor correlation between morpholino-induced and mutant phenotypes in zebrafish.</a> Developmental Cell. , (2015).</li><li>Rossi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+compensation+induced+by+deleterious+mutations+but+not+gene+knockdowns.">Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns.</a> Nature. , (2015).</li><li>Stainier, D. Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+morpholino+use+in+zebrafish.">Guidelines for morpholino use in zebrafish.</a> PLoS Genetics. , (2017).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental dynamics an official public. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>M&#248;ller, R. S., Dahl, H. A., Helbig, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+next+generation+sequencing+to+epilepsy+genetics.">The contribution of next generation sequencing to epilepsy genetics.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. , (2015).</li><li>Allen, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+mutations+in+epileptic+encephalopathies.">De novo mutations in epileptic encephalopathies.</a> Nature. , (2013).</li><li>Dunn, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+sequencing+methods+for+diagnosis+of+epilepsy+syndromes.">Next generation sequencing methods for diagnosis of epilepsy syndromes.</a> Frontiers in Genetics. , (2018).</li><li>Grone, B. P., Baraban, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+in+epilepsy+research:+Legacies+and+new+directions.">Animal models in epilepsy research: Legacies and new directions.</a> Nature Neuroscience. , (2015).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+characterization+of+an+antisense+knockdown+zebrafish+model+of+Dravet+syndrome:+Inhibition+of+epileptic+seizures+by+the+serotonin+agonist+fenfluramine.">Pharmacological characterization of an antisense knockdown zebrafish model of Dravet syndrome: Inhibition of epileptic seizures by the serotonin agonist fenfluramine.</a> PLoS ONE. , (2015).</li><li>Swaminathan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-canonical+mTOR-Independent+Role+of+DEPDC5+in+Regulating+GABAergic+Network+Development.">Non-canonical mTOR-Independent Role of DEPDC5 in Regulating GABAergic Network Development.</a> Current Biology. , (2018).</li><li>Samarut, &. #. 2. 0. 1. ;., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#947;-Aminobutyric+acid+receptor+alpha+1+subunit+loss+of+function+causes+genetic+generalized+epilepsy+by+impairing+inhibitory+network+neurodevelopment.">&#947;-Aminobutyric acid receptor alpha 1 subunit loss of function causes genetic generalized epilepsy by impairing inhibitory network neurodevelopment.</a> Epilepsia. , 2061-2074 (2018).</li><li>Turrini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+mapping+of+neuronal+activity+during+seizures+in+zebrafish.">Optical mapping of neuronal activity during seizures in zebrafish.</a> Scientific Reports. , (2017).</li><li>Rosch, R. E., Hunter, P. R., Baldeweg, T., Friston, K. J., Meyer, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+and+dynamic+causal+modelling+reveal+brain-wide+changes+in+effective+connectivity+and+synaptic+dynamics+during+epileptic+seizures.">Calcium imaging and dynamic causal modelling reveal brain-wide changes in effective connectivity and synaptic dynamics during epileptic seizures.</a> PLoS Computational Biology. , (2018).</li><li>Baraban, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forebrain+Electrophysiological+Recording+in+Larval+Zebrafish.">Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2013).</li><li>Afrikanova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+the+Zebrafish+Pentylenetetrazol+Seizure+Model:+Locomotor+versus+Electrographic+Responses+to+Antiepileptic+Drugs.">Validation of the Zebrafish Pentylenetetrazol Seizure Model: Locomotor versus Electrographic Responses to Antiepileptic Drugs.</a> PLoS ONE. , (2013).</li></ol>

Авторам нечего раскрывать.

Эпилепсия является сложным неврологическим заболеванием, отличающимся широким спектром этиологий, которые начинают выясняться с появлением технологий генетического секвенирования25,26,27. Универсальные животные модели необходимы для эффективной трансляционной стратегии, которая даст как понимание патологических механизмов генетически связанных эпилепсий, так и таргетную терапию для различных форм этого состояния. Модели рыбок данио были очень эффективны в воспроизведении основных признаков эпилепсии и обеспечении надежных показаний для скрининга противоэпилептических препаратов5,28. Спонтанные судороги могут быть обнаружены у генетически модифицированных рыбок данио15,29,30,31 и нейрофизиологический анализ в этих моделях28 подтвердил нейронную основу эпилептикоподобного поведения32,33. Малогабаритные личинки рыбок данио поддаются химическим экранам в формате 96 скважин с использованием автоматического обнаружения простого поведения, такого как спонтанное плавание, что позволяет быстро обнаруживать потенциальные терапевтические средства.
Представленная здесь модель детона DEPDC5 получена путем инъекции AMO в эмбрион рыбки данио для блокирования экспрессии генов во время развития. Эта модель представляет несколько ключевых фенотипических особенностей в разные временные точки развития личинок, которые могут быть использованы в качестве показателей эффективности терапии во время протокола химического или генетического скрининга. Нокаут гена, опосредованный АМО, является мощным методом, демонстрирующим преимущества перед химически индуцированными моделями судорог, поскольку он специально нацелен на экспрессию интересующего гена, что позволяет идентифицировать основные патогенные механизмы, вызванные генетической мутацией. Химические индуцеры, которые, тем не менее, являются мощными инструментами для скрининга лекарств, могут действовать через несколько клеточных путей, которые не всегда могут быть связаны с изучаемой генетической мутацией. Хотя инъекция АМО сама по себе является простой техникой, когда она осваивается экспериментатором, она также представляет ряд ограничений. Инъекции должны быть выполнены на стадии одной клетки эмбриона; в наших руках инъекции на более поздних стадиях значительно увеличивались вариабельность фенотипа. Это ограничивает время, доступное для инъекций; поэтому полезна стратегия генерации яйцеклеток для инъекций во временной последовательности. Мы обычно используем 4-5 крестов, которые мы открываем с интервалом 15-20 минут, позволяя впрыскивать одно сцепление перед получением следующего. Кроме того, необходимо позаботиться о том, чтобы оценить фенотип в одних и тех же точках между различными экспериментами, поскольку стереотипное поведение быстро развивается в течение первых дней развития. Объем и концентрация АМО также должны тщательно контролироваться, так как общая токсичность из-за инъекций чрезмерных количеств будет маскировать конкретный фенотип. Различные контрольные элементы, представленные во введении, необходимы для определения правильной дозы инъекции и соответствующего фенотипа.
Полевые записи мозга личинок рыбок данио являются полезным инструментом для исследования вредных последствий генетических мутаций, участвующих в различных расстройствах мозга, на глобальную активность нейронов34. События деполяризации, наблюдаемые в этих экспериментальных условиях, являются устоявшимся методом оценки электрофизиологического воздействия лекарственных средств в различных эпилептических условиях15,35. Однако оценка этих эффектов в основном проводилась качественно, а не количественно, и в качестве субъекта анализа был установлен субъективный наблюдатель. Здесь мы разрабатываем автоматическую стратегию обнаружения, которая может объективно количественно оценить скорость деполяризации, их амплитуду и продолжительность, а также может оценить прогресс этих параметров во времени или с различными генетическими или фармакологическими вмешательствами.
Репрезентативные результаты, представленные здесь, показывают ожидаемую полевую активность генетической модели DEPDC5 по сравнению с контролем несоответствия у рыбок данио 4-6 dpf до и после применения PTZ для введения эпилептиформной электрографической активности. Ранее мы показали значительное увеличение базальной активности депонирования DEPDC5 при условии18. Здесь мы показываем, что реакция этих двух условий на PTZ, химический индуктор эпилептиформной активности, имеет аналогичную траекторию во времени, начиная с периода относительно низкой частоты, событий деполяризации с высокой амплитудой и продолжая периодом событий деполяризации с более высокой частотой, более низкой амплитудой. События полевой записи имеют медленную динамику (интересуемые частоты находятся в диапазоне 0,005-0,2с-1),поэтому для изоляции интересующих событий используются как фильтры нижних, так и высоких частот. После устранения низкочастотного шума обнаружение событий деполяризации осуществляется с помощью простого порога. Поскольку на статистику сигнала сильно влияет наличие событий деполяризации, мы не могли использовать стандартное отклонение общего сигнала для определения этого порога. Изменчивость значения стандартного отклонения между наборами данных была больше, чем наблюдаемые уровни регистрируемого шума. Поэтому после визуального осмотра следов мы использовали фиксированное значение порога 0,3 мВ, чтобы избежать смещения, вызванного разными уровнями деполяризационной активности.
Описанный протокол обеспечивает стандартизированный и простой метод оценки двигательного поведения и активности нейронного поля посредством регистрации напряжения внеклеточного тока в сочетании с автоматическим обнаружением событий деполяризации в зрительном тектуме для характеристики эпилептиформоподобных фенотипов в моделях рыбок данио.

Благодаря своим небольшим размерам, яйцекладу и прозрачности на ранних стадиях развития, рыбка данио стала ценным позвоночным организмом для моделирования заболеваний человека, столь же разнообразных, как сердечно-сосудистые, онкологические или неврологические расстройства1,2. Рыбка данио сочетает в себе преимущества позвоночных, в том числе высокую сохранность архитектуры органов и генетического кода, с небольшим размером и простотой генетических манипуляций с более простыми модельными организмами, что облегчает как фундаментальные исследования, так и трансляционные приложения. В частности, его поддаться высокопроизводительному автоматизированному скринингу поведения и флуоресцентным маркерам клеточных процессов сделала рыбок данио особенно привлекательной моделью для исследований эпилепсии. Это было продемонстрировано высоким увеличением в последнее десятилетие числа публикаций, включающих химически индуцированные и/или генетические модели эпилепсии3,4, 5и, в последнее время, сообщения о перспективныхтерапевтических средствах, полученных из химических экранов в этих моделях6,7,8.
DEPDC5 является членом комплекса GATOR1, отрицательного регулятора сигнализации mTOR9. Мутации в гене DEPDC5 были впервые обнаружены в 2013 году у пробандов, страдающих аутосомно-доминантными фокальными эпилепсиями10,11,и с тех пор были зарегистрированы в ряде клинических состояний, связанных с очаговыми эпилептическими проявлениями и фокальной кортикальной дисплазией12. Подавляющее большинство зарегистрированных мутаций, по прогнозам, вызывают потерю функции гена12,и это было официально продемонстрировано для ряда мутированных транскриптов DEPDC5, которые нацелены на бессмысленный опосредованный распад мРНК12,13. В согласии, сбивание гена-ортолога у рыбок данио с использованием антисмысловых морфолиноолиголидов (АМО) приводит к ряду особенностей, которые являются общими для эпилептических моделей в этом организме, включая гиперактивность, поворотно-подобное плавание, спонтанные судороги и повышенную нейрональную активность14,15,16,17,18. Интересно, что лечение рапамицином, ингибитором передачи сигналов mTOR, обратило вспять поведенческие особенности этой модели18,поддерживая гипотезу о том, что потеря функции DEPDC5 может вызвать эпилепсию из-за неправильной регуляции пути mTOR9,19.
Преходящее сбивание экспрессии генов in vivo с использованием антисмысловых олигонуклеотидов, несущих морфолинодедирование, стало бесценным инструментом для изучения роли специфических генов наравне с методами на основе si/shRNA. В последнее время стратегии, основанные на АМО, также нашли клиническое применение, причем первая АМО-терапия получила одобрение FDA для лечения мышечной атрофии Дюшенна в 2016году 20. Хотя сообщалось, что у рыбок данио фенотип острого нокдауна генов на основе АМО не всегда коррелирует с конститутивными нокаут-моделями21,это может быть связано, по крайней мере, в некоторых случаях с компенсаторными механизмами, порожденными конститутивными генетическими модификациями22. Однако вопрос о специфичности фенотипа, индуцированного АМО, является бесспорным вопросом, который должен быть усердно рассмотрен в исследованиях с использованием этой технологии23. Чтобы обеспечить специфичность нокдаун-фенотипа на основе AMO, необходимо несколько ключевых элементов управления. К ним относится кривая доза-реакция, которая позволяет выбрать самую низкую дозу AMO, эффективную для сбивания генов, избегая общей токсичности из-за введения избытка генетического материала. Использование Mismatch AMO, который не нацелен на какую-либо конкретную область в геноме, также требуется для установления соответствующей дозы и идентификации конкретного фенотипа. Второй AMO, который нацелен на другую область того же гена, такую как AMO, блокирующий сращивание, необходим для подтверждения того, что фенотип обусловлен сносом гена-мишени. Спасение нокдауна фенотипа с кДНК гена, либо человеческого ортолога, либо кодон-модифицированной версии гена рыбки данио, которая не может быть нацелена на AMO, дает веский аргумент в пользу специфичности фенотипа. Отсутствие спасения с той же кДНК, содержащей мутации потери функции (такие как введение кодонов ранней остановки), является еще одним доказательством в этом направлении.
Здесь мы представляем метод генерации модели потери функции рыбок данио DEPDC5 и протокол поведенческого фенотипирования через 28 и 48 ч после оплодотворения (hpf). При 28 л.с. потеря функции DEPDC5 вызывает общую гиперактивность, о чем свидетельствует усиленное сворачивание и подергивание движений эмбрионов внутри хориона. Автоматизированная система обнаружения движения может быть использована на этом этапе для количественной оценки общей активности на эмбрион. При 48 л.с. рыбки данио демонстрируют стереотипное побег, плавая в ответ на прикосновение. У рыбок данио с пониженной экспрессией DEPDC5траектория плавания значительно более извилиста, чем у контрольных, рыба демонстрирует «пробковый винт» или «поворотное колесо», подобное рисунку, аналогичному другим зарегистрированным моделям эпилепсии в этом организме3,4. Электрофизиологические записи были получены в зрительном тектуме у личинок рыбок данио между 4-6 днями после оплодотворения (dpf) и показали базовое увеличение активности нейронов у животных DEPDC5. Преимущество этой модели заключается в том, что она представляет несколько фенотипических особенностей в разные моменты времени, которые могут быть полезны при мониторинге и оценке эффективности лекарственной терапии во время разработки.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:751px;" width="750">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:197px;">Agarose</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich, France</td>
			<td style="width:84px;">A9539</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aquarium salt&#160;</td>
			<td>Instant Ocean, Blacksburg, VA</td>
			<td>SS15-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass with filament</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF100-50-10</td>
			<td>OD: 1,5mm, ID: 0,5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Depdc5-atg antisense morpholino</td>
			<td>GeneTools, OR, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>sequence 5&#8217;- TGCCTTCATGGTGACCGTCATTTTA -3&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Depdc5-mis antisense morpholino</td>
			<td>GeneTools, OR, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>sequence 5&#8217;- TGCgTTgATcGTGACCcTgATTTTA -3&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Depdc5-splice antisense morpholino</td>
			<td>GeneTools, OR, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>sequence 5&#8217;- ACATTCCTGTTTCACCATAGATGAT -3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digitizer</td>
			<td>Molecular Devices, CA, USA</td>
			<td>Digidata 1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fast Green Dye</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td>F7258</td>
			<td>Stock solution of 0.2%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass-bottom petri dishes</td>
			<td>Ibidi, Germany</td>
			<td>81218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td>68270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Grasshopper 2 camera</td>
			<td style="width:163px;">FLIR, BC, Canada</td>
			<td>GRAS-03K2M-C</td>
			<td>formerly Point Grey Research</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human wild-type DEPDC5 cDNA</td>
			<td>Dharmacon, France</td>
			<td>NM_001242897.1</td>
			<td>&#160;Accession: BC144291 Clone ID 905</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ software</td>
			<td>NIH, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td>P9333&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matlab software</td>
			<td>MathWorks, MA, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td>S7653&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td>71687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pancuronium bromide&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Alomone Labs</td>
			<td style="width:84px;">P-130</td>
			<td style="width:307px;">Stock solution of 60mM in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parafilm</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td>P7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Patch clamp amplifier</td>
			<td>Molecular Devices, CA, USA</td>
			<td>MultiClamp 700B</td>
			<td>Computer-controled patch clamp amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pClamp10 acquisition software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pentylenetetrazol (PTZ)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td>P6500</td>
			<td>Stock solution of 300mM (dissolved in recording solution)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipette puller</td>
			<td>Narishige, Japan</td>
			<td>PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pneumatic PicoPump&#160;</td>
			<td>WPI, France</td>
			<td>PV 820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sylgard 184 kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich Intl.</td>
			<td>761036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transfer plastic pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich, France</td>
			<td>Z350605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zebralab</td>
			<td>Viewpoint, France</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

behavioral and physiological analysis in a zebrafish model of epilepsy

Эпилепсия представляет собой одно из наиболее распространенных неврологических расстройств, затрагивающих, по оценкам, 50 миллионов человек во всем мире. Недавние достижения в области генетических исследований выявили большой спектр генов, причастных к различным формам эпилепсии, подчеркивая гетерогенную природу этого расстройства. Соответствующие животные модели необходимы для исследования патологических механизмов, вызванных генетическими мутациями, замешанными в эпилепсии, и для разработки специализированных, целевых методов лечения. В последние годы рыбки данио стали ценным позвоночным организмом для моделирования эпилепсии с использованием как генетических манипуляций, так и воздействия известных эпилептогенных препаратов, таких как пентилентетразол (PTZ), для выявления новых противоэпилептических терапевтических средств. Вредные мутации в регуляторе mTOR DEPDC5 были связаны с различными формами фокальной эпилепсии и сбитием ортолога рыбок данио, вызывающих гиперактивность, связанную со спонтанными приступообразными эпизодами, а также повышенную электрографическую активность и характерное плавание с поворотным колесом. Здесь мы описали метод, участвующий в создании модели потери функции DEPDC5 и проиллюстрировали протокол оценки двигательной активности через 28 и 48 ч после оплодотворения (hpf), а также метод регистрации полевой активности в зрительном тектуме рыбок данио. Также приведена иллюстрация влияния эпилептогенного препарата PTZ на активность нейронов с течением времени.

На рисунке 1 показаны репрезентативные следы напряжения 4-6 dpf записей внеклеточного поля личинок рыбок данио в случае двух генетических состояний: контроль несоответствия и депой DEPDC5. В базовом периоде записи декдаун DEPDC5 показывает более высокую распространенность спонтанных событий, в то время как контроль несоответствия отображает очень мало колебаний. Эти паттерны активности являются репрезентативными для значительного увеличения активности нейронов из-за потери функции DEPDC5,как мы ранее сообщали18. После применения PTZ как контроль несоответствия, так и сбитие DEPDC5 показывают увеличение числа событий деполяризации. В течение первого периода после применения PTZ (10 – 60 мин) наблюдается скорость 0,8 событий в минуту как в контроле несоответствия, так и в детонации DEPDC5, где большинство событий имеют высокую амплитуду (>1 мВ). В течение последнего периода отклика (60 – 120 мин после применения PTZ) скорость событий деполяризации увеличивается примерно до 1 события в минуту, и большинство событий имеют низкую амплитуду (≤1 мВ).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58837/58837fig1.jpg"> Рисунок 1:Пример следов полевых записей в мозге личинок рыбок данио. (A) Обзор 180-минутной записи для контрольной личинки mismatch и DEPDC5 Knock-down. Сначала регистрировалась спонтанная исходная активность, затем В ванне применяли PTZ (красная полоса). (B) Пери-стимульные временные гистограммы событий деполяризации для контроля несоответствия и детонации DEPDC5. События были классифицированы как высокая амплитуда (>1 мВ - синий) и низкая амплитуда (≤1 мВ - черный). (С-Е) Примеры следов различных периодов записи:(C)спонтанная активность,(D)События высокой амплитуды в течение первого периода после применения PTZ,(E)События низкой амплитуды в течение последнего периода после применения PTZ. Обратите внимание, что файлы скриптов для получения этих рисунков предоставляются в виде дополнительного файла. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58837/58837fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Дополнительный файл: файлы сценариев для шага 3.4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58837/Supplementary_File.zip" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Behavioral And Physiological Analysis In A Zebrafish Model Of Epilepsy at JoVE.com

Behavioral And Physiological Analysis In A Zebrafish Model Of Epilepsy

Здесь мы представляем протокол разработки и характеристики модели эпилепсии рыбок данио, возникающую в результате преходящего ингибирования гена DEPDC5.

Поведенческий и физиологический анализ в модели эпилепсии рыбок данио

Epilepsy represents one of the most common neurological disorders, affecting an estimated 50 million people worldwide. Recent advances in genetic research ...

Этот протокол обеспечивает быстрый способ оценки последствий сбивания гена WC5, который является наиболее распространенной причиной фокальной эпилепсии. Основным преимуществом этой методики является то, что мы можем использовать ее для оценки эпилепсии, как фенотипа, используя как поведенческие, так и физиологические особенности на различных стадиях развития. За день до микроуколажа установите брачные резервуары для рыбок данио.Утром после инъекции удалите разделители, чтобы включить нерест. Используйте тонкое сито для переноса яиц в 100-миллиметровые чашки Петри, наполненные эмбриональной водой. Используя пластиковую пипетку Пастера, соберите от 60 до 80 яиц и разложите яйца в силиконовой чашке Петри для инъекции.мы перемещаем большую часть воды, оставляя ровно настолько, чтобы покрыть яйца наполовину. Поместите стеклянную иглу вертикально в трубку с раствором для инъекций. Дайте цветной раствору заполнить тюбик капиллярным действием в течение нескольких минут.Когда раствор для инъекций будет виден в кончике иглы, установите иглу на инъекционную ручку микроинжектора и включите воздушный компрессор. Отрегулируйте настройку давления, чтобы создать объем впрыска в два нанолиттера. И поместить яйца под рассекающий бинокулярный микроскоп, с четырехкратным увеличением.Вставьте кончик иглы через хорион и желток одностадовых эмбрионов, чтобы ввести раствор непосредственно в каждую клетку. Затем перенесите введенные эмбрионы в меченую 100-миллиметровую чашку Петри с эмбриональной водой и поместите пластину в инкубатор с 28 градусами Цельсия. Через 28 часов после внесения удобрений поместите пластиковую сетку 1,2 на 1,2 миллиметра на дно тестовой посуды.Используйте пластиковую пипетку Пастера, чтобы поместить от 10 до 12 эмбрионов в их хорионах на пластиковую сетку. Наполните тарелку достаточным количеством эмбриональной воды, чтобы держать эмбрион погруженным, но не плавающим, осторожно перемещая эмбрионы пластиковым наконечником в положение на сетке по мере необходимости. Затем, используя видеокамеру, прикрепленную к микроскопу рассечения, запишите спонтанную активность накатки в течение 10-20 минут.Чтобы проанализировать общее спонтанное движение, используйте модуль количественной оценки активности в лабораторной системе Zebra, чтобы загрузить записанное видео и спроектировать арены отслеживания вокруг каждого эмбриона по мере необходимости. Установите пороговые значения заморозки и разрыва на 10 и 50 соответственно. И при автоматизированном видеоанализе, который количественно оценивает общую активность внутри каждой из определенных арен.Затем восстановите набор данных в виде электронной таблицы для выполнения анализа, используя соответствующее программное обеспечение для анализа данных. Через 46 часов после оплодотворения используйте тонкие щипцы для дехорионизации эмбрионов и наполните 130-миллиметровую тестовую чашку эмбриональной водой. По крайней мере, за 15 минут до отдыха разогреть тестовую посуду в инкубаторе с 28 градусами Цельсия.Чтобы выполнить тест на побег с помощью прикосновения, используйте пластиковую пипетку Пастера, чтобы поместить эмбрион в центр тестовой чашки под камеру. Начните запись, используя скорость захвата 30 кадров в секунду. Используя тонкий пластиковый наконечник, слегка коснитесь хвоста эмбриона мигающим движением.Остановка записи, когда личинка прекращает свое движение. Затем перенесите эмбрион в новую чашку, наполненную свежей эмбриональной водой, и повторите тест с таким количеством эмбрионов, сколько необходимо для каждого экспериментального состояния. Чтобы подготовить рыбу зебры к электрофизиологическому анализу, поместите рыбу через один, четыре-шесть дней после оплодотворения в чашку Петри со стеклянным дном.Удалите любую лишнюю, лишнюю матросную среду, чтобы рыба была как можно ближе ко дну блюда. Используйте пластиковую пастерную пипетку, чтобы добавить достаточно теплой жидкой агросы, чтобы покрыть личинку. В то время как агрос харднес, используйте тонкие щипцы, чтобы сориентировать рыбу вентральной стороной вниз в центре блюда.Затем добавляют в чашку два миллилитра регистрирующем раствора, содержащего 10 микромолярного панкурония бромида, чтобы блокировать нервно-мышечную передачу. Затем заполните микропипеттинг регистрирующим раствором и используйте усилитель патч-зажима в конфигурации зажима напряжения, чтобы измерить сопротивление электрода в ванне, чтобы подтвердить его правильное значение. Используя объектив 20x, расположите голову личинки в центральном поле зрения и опустите микропипет, чтобы достичь записывающего положения в оптической тектуме.переключите усилитель патч-зажима на конфигурацию тока и зафиксируйте удерживающие токи до нуля миллиампер. Используя фильтр нижних частот в один килогерц, скорость сбора в один килогерц и цифровой коэффициент усиления 10, регистрируют спонтанную активность рыбы в течение 60 минут для определения базовых уровней активности. В конце исходной записи, на 143 микролитра 300 миллимолар на литр пентилететразола раствора в ванну, для конечной концентрации 20 миллимолар на литр.Записывают нейронную активность животного в растворе пентиленететразола еще 120 минут. В течение базового периода регистрации, от четырех до шести дней после оплодотворения эпилептических моделей рыб данио демонстрируют более высокую распространенность спонтанных событий, в то время как контрольные рыбы несоответствуют очень мало колебаний. После применения пентиленетеразола как контроль несоответствий, так и эпилептические модели рыбок данио демонстрируют повышенное количество событий глубокой поляризации.В течение первого периода после применения пентиленететразола наблюдается скорость 0,8 события в минуту как у животных, контролирующие несоответствие, так и у сбитых животных, для которых большинство событий имеют высокую амплитуду. В течение последнего периода ответа. Скорость событий деполяризации увеличивается примерно до одного события в минуту.И большинство событий имеют низкую амплитуду. При выполнении нокдауна очень важно установить правильную дозу морфолино с помощью кривой реакции дозы и выполнить контроль, чтобы избежать неспецифической токсичности. Этот толчок позволил провести несколько последующих исследований, включая тестирование эффектов генетических или химических модификаторов.А поведение рыбок данио и нейронная активность для понимания эффектов развития DC пять мутаций.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A General Method for Evaluating Incubation of Sucrose Craving in Rats

Общий метод оценки Инкубация Сахароза Тяга у крыс

For someone on a food-restricted diet, food craving in response to food-paired cues may serve as a key behavioral transition point between abstinence and ...

A Lightweight, Headphones-based System for Manipulating Auditory Feedback in Songbirds

Легкий, наушники-администратора системы для управления Звуковая обратная связь в Певчие птицы

Experimental manipulations of sensory feedback during complex behavior have provided valuable insights into the computations underlying motor control and ...

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish

Передний мозг Электрофизиологические записи в личинки данио рерио

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked ...

Recording and Analysis of Circadian Rhythms in Running-wheel Activity in Rodents

Запись и анализ циркадных ритмов в рабочем колеса деятельность в Грызуны

When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, ...

Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

Автоматизированная Высокая пропускная Поведенческий анализ в личинки данио

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

Функциональный анализ из питания личинок округа в Дрозофилы</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

The Power of Interstimulus Interval for the Assessment of Temporal Processing in Rodents

Мощность Interstimulus интервала для оценки временных обработки грызунов

Temporal processing deficits have been implicated as a potential elemental dimension of higher-level cognitive processes, commonly observed in ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

Баллистическая маркировка пирамидальных нейронов в мозговых фрагментах и в первичной культуре клеток

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...

A Rat Model of EcoHIV Brain Infection

Крысиная модель инфекции мозга EcoHIV

It has been well studied that the EcoHIV infected mouse model is of significant utility in investigating HIV associated neurological complications. ...