Name: in vitro scratch assay to demonstrate effects of arsenic on skin cell migration
Uploaded: 2019-02-23T13:00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration at JoVE.com

وأيد المعهد الوطني لصحة الأقليات والفوارق الصحية من "المعاهد الوطنية للصحة" تحت رقم جائزة U54MD012388 للبحث عنها في هذا المنشور. المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية "المعاهد الوطنية للصحة".

<ol>
	<li>Diegelmann, R., Evans, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing:+an+overview+of+acute,+fibrotic+and+delayed+healing.">Wound healing: an overview of acute, fibrotic and delayed healing.</a> Frontiers in BioScience. 9, 283-289 (2004).</li><li>Braiman-Wiksman, L., Solomonik, I., Spira, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+into+wound+healing+sequence+of+events.">Novel insights into wound healing sequence of events.</a> Toxicologic Pathology. 35, 767-779 (2007).</li><li>Michelson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Platelets. , (2013).</li><li>Aikawa, M., Schoenbechler, M. J., Barbaro, J. F., Sadun, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+rabbit+platelets+and+leukocytes+in+the+release+of+histamine.+Electron+microscopic+observations.">Interaction of rabbit platelets and leukocytes in the release of histamine. Electron microscopic observations.</a> American Journal of Pathology. 63 (1), 85-98 (1971).</li><li>Liang, C., Park, A., Guan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+scratch+assay:+A+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro.">In vitro scratch assay: A convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nature Protocols. , 329-333 (2007).</li><li>Pinto, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bench-top+in+vitro+wound+assay+to+evaluate+wound+closure.+Applied.">A bench-top in vitro wound assay to evaluate wound closure. Applied.</a> In Vitro Toxicology. 2 (3), 151-156 (2016).</li><li>Pinto, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+mitigates+the+negative+effects+of+arsenic+contamination+in+an+in+vitro+wound+model.">Estrogen mitigates the negative effects of arsenic contamination in an in vitro wound model.</a> Applied In Vitro Toxicology. 4 (1), 24-29 (2018).</li><li>Roubelakis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-rich+plasma+(PRP)+promotes+fetal+mesenchymal+stem/stromal+cell+migration+and+wound+healing+process.">Platelet-rich plasma (PRP) promotes fetal mesenchymal stem/stromal cell migration and wound healing process.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 417-428 (2014).</li><li>Shibata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adiponectin+regulates+cutaneous+wound+healing+by+promoting+keratinocyte+proliferation+and+migration+via+the+ERK+signaling+pathway.">Adiponectin regulates cutaneous wound healing by promoting keratinocyte proliferation and migration via the ERK signaling pathway.</a> Journal of Immunology. 189 (6), 3231-3241 (2012).</li><li>Mendonca, R. J., Coutinho-Netto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+aspects+of+wound+healing.">Cellular aspects of wound healing.</a> Anais Brasileiros de Dermatologia. 84 (3), 257-262 (2009).</li><li>Beem, E., Segal, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+stability+and+sensitivity+of+cell+fluorescent+labels+when+used+for+cell+migration.">Evaluation of stability and sensitivity of cell fluorescent labels when used for cell migration.</a> Journal of Fluorescence. 23 (5), 975-987 (2013).</li><li>Gentry, P. R., Clewell, H. J., Greene, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+recent+advances+in+research+on+arsenic+cancer+risk+assessment.">The impact of recent advances in research on arsenic cancer risk assessment.</a> Regulatory Toxicology and Pharmacology. 69, 91-104 (2014).</li><li>Beamer, P. I., Klimecki, W. T., Loh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+children's+urinary+CC16+levels+with+arsenic+concentrations+in+multiple+environmental+media.">Association of children's urinary CC16 levels with arsenic concentrations in multiple environmental media.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health.pii: E521.2016:13. , (2016).</li><li>Robertson, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arsenic+in+ground-water+under+oxidizing+conditions,+southwest+United+States.">Arsenic in ground-water under oxidizing conditions, southwest United States.</a> Environmental Geochemistry and Health. 11, 3-4 (1989).</li><li>Foust, R. D., Mohapatra, P., Compton-O'Brian, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Groundwater+arsenic+in+the+Verde+Valley+in+central+Arizona,+USA.">Groundwater arsenic in the Verde Valley in central Arizona, USA.</a> Applied Geochemistry. 19, 251-255 (2004).</li><li>Uhlman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Arsenic in Arizona Ground Water: Source and Transport Characteristics. , (2008).</li><li>Agusa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+exposure+to+arsenic+from+drinking+water+in+Vietnam.">Human exposure to arsenic from drinking water in Vietnam.</a> Science of the Total Environment. , (2014).</li><li>Ayotte, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+temporal+variability+of+arsenic+in+groundwater+used+for+drinking+water+supply+in+the+United+States.">Factors affecting temporal variability of arsenic in groundwater used for drinking water supply in the United States.</a> Science of the Total Environment. , (2014).</li><li>Dummer, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geostatistical+modeling+of+arsenic+in+drinking+water+wells+and+related+toenail+arsenic+concentrations+across+Nova+Scotia,+Canada.">Geostatistical modeling of arsenic in drinking water wells and related toenail arsenic concentrations across Nova Scotia, Canada.</a> Science of the Total Environment. , (2014).</li><li>Sorg, T. J., Chen, A. S., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arsenic+species+in+drinking+water+wells+in+the+USA+with+high+arsenic+concentrations.">Arsenic species in drinking water wells in the USA with high arsenic concentrations.</a> Water Research. 48, 156-169 (2014).</li><li>Beamer, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+Children's+Urinary+CC16+Levels+with+Arsenic+Concentrations+in+Multiple+Environmental+Media.">Association of Children's Urinary CC16 Levels with Arsenic Concentrations in Multiple Environmental Media.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health. 13, (2016).</li><li>Pomari, E., Dalla Valle, L., Pertile, P., Colombo, L., Thornton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracrine+sex+steroid+synthesis+and+signaling+in+human+epidermal+keratinocytes+and+dermal+fibroblasts.">Intracrine sex steroid synthesis and signaling in human epidermal keratinocytes and dermal fibroblasts.</a> The FASEB Journal. 29 (2), 508-524 (2015).</li><li>Gotsulyak, Y., Kosach, R., Cherednyk, V., Tykhonkova, O., Khoruzhenka, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+cell+motility+evaluation+in+scratch+assay.">Optimization of cell motility evaluation in scratch assay.</a> Biopolymers and Cell. 30, 223-228 (2014).</li><li>Goetsch, K. P., Niesler, C. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+scratch+assay+for+in+vitro+skeletal+muscle+wound+healing+analysis.">Optimization of the scratch assay for in vitro skeletal muscle wound healing analysis.</a> Analytical Biochemistry. 411, 158-160 (2011).</li><li>Harishkumar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+the+mechanism+of+in+vitro+wound+healing+properties+of+citrus+tamurana+extract.">Revealing the mechanism of in vitro wound healing properties of citrus tamurana extract.</a> BioMed Research International. 13, (2013).</li><li>Johnston, S. T., Simpson, M. J., McElwain, D. L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+much+information+can+be+obtained+from+tracking+the+position+of+the+leading+edge+in+a+scratch+assay?.">How much information can be obtained from tracking the position of the leading edge in a scratch assay?.</a> Journal of the Royal Society Interface. 11, 1-9 (2014).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

تطبيق هذا الفحص يوفر تقييم الفائق، وفي الوقت المناسب للهجرة الخلوية وقد يترجم مباشرة إلى النظم الفسيولوجية المعقدة5،،من67. ولهذا السبب، تم ضبطها ويمارس لتقييم آثار مختلف العوامل العلاجية والسموم البيئية على الجرح الشفاء6مقاعد البدلاء-أعلى النموذج المقترح. تركيزات الزرنيخ المستخدمة في الدراسة الحالية تعتبر بيئياً ذات الصلة عن طريق البحث في الأدبيات واسعة من مستويات التعرض المعروفة، ومن مراجعة استعادية بيانات مختلف قواعد1514،، 16،،من1718،19،،من2021. استخدام هذا في المختبر الصفر الفحص أثبتت أن التعرض لتركيز الزرنيخ داخل العالية، لكن نطاق بيئياً ذات الصلة، وتأخر إغلاق الجرح (الهجرة الخلوية).
كما كان يعمل هذا النموذج الأعلى في مقاعد البدلاء لعزل ودراسة خط خلية فردية (تنتجها الخلايا الليفية) زيادة فهم كيفية إسهام الهجرة تنتجها الخلايا الليفية الجرح نتائج الشفاء. وعلاوة على ذلك، من الصعب دراسة مهام خط الخلية الفردية في الأنظمة المعقدة في فيفو مع العديد من الخلايا والأنسجة الحالية الأخرى التي يمكن أن تتداخل مع التحليل. بالإضافة إلى ذلك، يوفر المقايسة إلى وسيلة لتحقيق البيانات إغلاق الجرح نسبة نصف الكمية التي يمكن استخدامها لاستهداف آليات خلوية محددة من خلالها المركبات قد تؤثر على التئام الجروح. على سبيل المثال، يمكن جمع الخلايا المستخدمة في التحليل الصفر والمخزنة في كاشف المرجوة والمستخدمة في التعبير الجيني (إشارة مرناً) أو تعبير البروتين فحوصات22. يمكن أن تكون هذه المعلومات مفيدة للمحقق إذا كانت تسعى إلى فهم ما إشارات أو البروتينات قد إلى حد كبير يسهم في أحداث تغييرات في الهجرة الخلوية حضور متفاوتة علاجات (أي، الزرنيخ)22.
واختيرت الليفية الجلدية الولدان البشرية لهذا العمل استناداً إلى دورها البارز في التئام الجروح. ومع ذلك، تم تنفيذ هذا البروتوكول المقايسة الصفر باستخدام مختلف أنواع الخلايا ومن أجل تحقيق مجموعة من الأغراض البحثية. على سبيل المثال، اعتمد التحليل الصفر في مجال الأورام لدراسة تثبيط الهجرة للعلاج الكيميائي المخدرات23؛ للهجرة الخلية الهيكل العظمى والعضلات، والانتشار، ونشر24؛ لدراسة تأثير المستخلصات النباتية على25من الهجرة الخلوية؛ وأن نفهم كيف تساهم الهجرة keratinocyte وانتشار الجرح الشفاء9. بالإضافة إلى ذلك، ورقة سابقة بواسطة بينتو et al. تقييم آثار اليورانيوم (U) والبلازما الغنية بالصفائح الدموية (PRP) على الهجرة هدفن استخدام مقايسة الصفر6. وكان الغرض من هذا العمل فهم المدى الذي يمكن اختبار هذا التحليل تأثير عامل الفكر إلى إبطاء الهجرة الخلوية (U)، فضلا عن عامل الفكر إلى تسريع الهجرة الخلوية (الحزب الثوري). كما يمكن أن يرى في العمل المذكور آنفا والبحوث محققون آخرون، تطبيق التحليل الصفر إمكانات عالية للاستخدام في مختلف النماذج التجريبية26. على الرغم من التفاصيل المقدمة ضمن الأساليب، يتوقع أن الفرق بين المحققين والتجارب. على سبيل المثال، معدلات الهجرة الخلوية سوف يرجح أن تتقلب استناداً إلى خط الخلية في الاستخدام، بالإضافة إلى المغذيات الدقيقة المطلوبة اللازمة لأنواع الخلايا الفريدة. يتم سرد العديد من الملاحظات الهامة للمساعدة في الخلية العائد والجدوى كما يلاحظ في جميع أنحاء هذا البروتوكول. ومع ذلك، فمن المستحسن أن المحققين اتبع توصيات الشركة المصنعة لظروف النمو الأمثل، واستخدام هذا الأسلوب كالتعليم التكميلي للخلية العامة ثقافة العمل.
على الرغم من أن التحليل الصفر مرنة للغاية لدراسة الأنشطة الخلوية؛ قد تنشأ التحيز غير المنظورة في قياس التقنيات. على سبيل المثال، عند استخدام إيماجيج لتتبع يدوياً جبهات الهجرة الخلية، قد يوجد تباين بين المستخدمين، والتي يمكن أن تحد من دقة وجمع بيانات تمثيلية. كما تجدر الإشارة إلى أن الجبهات الهجرة ينبغي أن يقرأ الأعمى للعلاج للتقليل من التحيز المستخدم. وعلاوة على ذلك، يدوياً تحديد جبهات الهجرة قد يؤدي إلى سوء تقدير لمتوسط المسافة سافر بسبب تشكيل بسيودوبود الخلايا وقدرتها على الوصول إلى نموذج الالتصاقات المحورية، التي يمكن أن تكون مضللة بصريا. وعلى نفس المنوال، استخدام فلوري "تعقب خلية" الأصباغ على سطح الخلية أو البروتينات النووية للكشف عن الهجرة قد غير قصد إصلاح الخلايا أدى إلى عدم الدقة عند قياس الهجرة الخلوية على مر الزمن. من المستحسن أن يكون المسجلين الضوابط الإيجابية و/أو السلبية المناسبة داخل هذه التجربة لتقويم تماما تأثير العلاج على خطوط الخلية. يجب إكمال الممارسة لهذا التحليل واعترافاً بأوجه القصور. هذا التحليل لا تضمن أن نتائج الهجرة الخلوية التي تم الحصول عليها من التجارب في المختبر سوف تترجم مباشرة إلى نتائج في فيفو . الهجرة الجرح الشفاء والخلوية في نظام معيشة معقدة تنطوي على العديد من أنواع الخلايا والإشارات الجزيئية؛ كل منها لديه القدرة على التأثير على استجابات الشفاء.
في ملخص، وجد المقايسة الصفر لتوفير الفرز الفائق للهجرة الخلوية استجابة لتغير البيئات6،25. ونحن على وجه التحديد تستخدم هذا البروتوكول بنجاح الكشف عن التغييرات في الهجرة الخلوية نتيجة للتعرض للزرنيخ في جرعات مختلفة بيئياً ذات الصلة. وقدمت هذه البيانات مبررا لاستخدام مقايسة الصفر إلى مزيد من الدراسة وتقييم مسارات آليا إلى الهجرة الخلوية في هذا التحليل، وكيف يتم تغيير هذه المسارات بالتعرض للزرنيخ.

التئام الجروح ويتكون من سلسلة معقدة من تداخل الخطوات التي تنطوي على مختلف أنواع الخلايا والجزيئات مما يشير إلى عناصر المصفوفة خارج الخلية1. معا، هذه المكونات والعمل يدا واحدة لتحقيق القرار الجرح أو إصلاحها، الأمر الذي يؤدي في نهاية المطاف إلى تشكيل ندبة تليفية الحماية تبعاً لدرجة الصدمة1. للقبض على العمليات الفردية والوظائف للجرح الشفاء في تجربة واحدة صعبة؛ الخطوات الفردية داخل الجرح الشفاء عملية تحتاج إلى تحديد واختبارها بشكل منفصل. من بين العديد من الخطوات لالتئام الجروح، عملية الهجرة الخلوية اعتبرت حاسمة عند تقييم معدلات الشفاء2. الهجرة الخلوية يمكن ملاحظتها في جميع المراحل من التئام الجروح، ومما يستلزم زيادة فهم كيف يمكن أن تؤثر التعديلات للهجرة الخلية إغلاق الجرح. على سبيل المثال، يعتبر الهجرة الخلوية في كلا التهاب المرحلة المبكرة والمتأخرة، مع تجميع الدم تخثر الدم والصفائح الدموية في موقع الجرح3. هذه الأحداث منع فقدان الدم المفرط عن طريق تشكيل انسداد مؤقت لملء المناطق الجرحى خالية من الأنسجة3. سوف توليف الصفائح الدموية بالدورة الدموية وإفراز وسطاء فعال في الأوعية جنبا إلى جنب مع العوامل تشيموتاكتيك، أي إشارة معا لهجرة الكريات البيض الالتهابية (خلايا الدم البيضاء) للأنسجة الجرحى لإصلاح4. Epithelialization إعادة يحدث في غضون ساعة إصابة الأنسجة وينطوي على تغطية الموقع الجرح من خلال النشاط والهجرة من الخلايا الظهارية الكيراتينيه لمنع زيادة تلوث أو غزو من الجسيمات الأجنبية إلى موقع الجرح2. التقاط هذه الأمثلة فقط عدد قليل من الهجرة الخلية العديد من المهام المرتبطة بالتئام الجروح.
تم وصف المقايسة الصفر واستخدامه لفهم أفضل للهجرة الخلية ولها العديد من الأدوار في الجرح الشفاء5،6. هذا التحليل يعتبر التبسيط ويوفر الفائق، وتمكن المحقق لجمع بيانات الهجرة الخلية الممثل. وقد أظهرت فحوصات الهجرة بنجاح أن بعض المركبات قد تسريع أو إبطاء معدل الهجرة الخلوية6. وعلاوة على ذلك، توفر هذه نتائج الفحص متعدية المعلومات الفسيولوجية التي يمكن استخدامها لوضع العلاجات المستهدفة، الجرعات التركيزات، والجينات للفائدة قبل التجريب في فيفو . الفحص يتطلب تقنيات استزراع الخلايا الأساسية واللوازم، خط خلية للاختيار، وتكنولوجيا التصوير لالتقاط حركة عبر الوقت أو الحركة استجابة للعلاج.
ويمكن التلاعب المقايسة سهولة أو مصممة خصيصا لتناسب احتياجات المحقق. ومع ذلك، هناك أربع مسائل أساسية للنظر قبل التجريب. ما هو السؤال عامة أو محددة (ق) هو/هي investigator(s) محاولة للإجابة؟ وهذا ينطبق على معظم الفرضيات مدفوعة للبحث؛ ومع ذلك، أنها حاسمة بالنسبة لهذا التحليل لأنه سيتم تحديد العديد من المعلمات المطلوبة بدقة والإجابة السؤال (ق) تماما. يجب استخدام ما الخلية خط أو الخلية الخطوط (إذا كانت متعددة) لتمثيل النظام الفسيولوجية قيد الدراسة؟ على سبيل المثال، في الجلدي الجرح الدراسة الشفاء، وتنتجها الخلايا الليفية الجلد5،،من67،8من الخلايا الجذعية، أو قد تعتبر البشرة keratinocyte9 تمثيل السكان الخلية التي توجد عادة بكثرة في الأنسجة الجلد10. وبدلاً من ذلك، يمكن تقييم العَدلات أو الضامة أو الخلايا الملتهبة الأخرى في هذا النظام تمثل الهجرة الخلية للمكونات الأخرى لالتئام الجروح داخل أنسجة الجلد10. بالإضافة إلى ذلك، تحديد خط خلية معينة، يجري تقييم سوف يساعد على تحديد الكواشف التي هي الأمثل استخدامها لتعزيز النشاط الأيضي في الخلية. كيف ستكون الهجرة الخلية تتبع تصويرها؟ وهناك عدد من التقنيات المستخدمة لمراقبة الهجرة الخلية داخل اللوحة أو قارورة. على سبيل المثال، يوفر الصباغة أو فلوريسسينتلي تمييز الخلايا واستخدام الفلورية أو التصوير [كنفوكل] لتعقب الخلايا على النقيض قوي، الذي يسمح للمحقق يحدد بوضوح الخلوية مقابل المواقع غير الخلوي والحركة الخلوية11 . تقنية شائعة أخرى، الموصوفة في هذه الدراسة، هو استخدام الفحص المجهري الخفيفة المقلوب مع مرحلة التباين6،7. يسمح للمستخدم بالعيش تعقب الخلايا دون الحاجة إلى إصلاح الميؤوس من شفائهم الخلايا قبل تصوير هذا البديل للخلية الأصباغ والأسفار ويسمح أيضا لالتقاط الصور من نفس الآبار الفردية التي تحتوي على مونولاييرس الجرحى من الخلايا عبر النقاط الزمنية. ما هي نتائج التدابير التي سيتم استخدامها لتحليل؟ استخدام الصور التي جمعت طوال فترة الدراسة، يمكن توليد البيانات التي يمكن فهم التغيرات في معدلات الهجرة الخلوية. في لدينا مختبر، مجهرية من الصور التي تم التقاطها في المجهر المقلوب الخفيفة يتم تحميلها إلى برمجيات تحليل الصور ويتم حسابها بإغلاق الجرح في المائة ومجموع المساحة تحت المنحنى (AUC).
سوف نسلط الضوء استخدام محدد من هذا التحليل توضيح التغييرات للهجرة عن طريق الجلد تنتجها الخلايا الليفية حضور الملوثات بيئية معروفة، الزرنيخ. الزرنيخ ميتالويد التي تحدث بشكل طبيعي وجدت داخل قشرة الأرض. قد تم العثور على المواقع المختلفة مع مستويات مرتفعة من الزرنيخ، الذي يشكل خطرا على الأفراد الذين يعيشون بالقرب من هذه المواقع. كنتيجة لذلك، أظهرت مصادر الغذاء والماء إلى زيادة مستويات التلوث بالزرنيخ، مما يزيد من احتمالات للأفراد لتصبح عرضه للزرنيخ. التعرض للزرنيخ البيئية قد ثبت أن عواقب صحية طويلة الأجل في المجموعات السكانية البشرية أعلاه أو حتى أدناه الحالي وكالة حماية البيئة في "الولايات المتحدة" (USEPA) ماكس الملوث مستوى (MCL) من 10 جزء في البليون (10 ميكروغرام/لتر)12، 13-على الرغم من أن تعيين هذا MCL USEPA ويرى أنه للشرب حدود، تركيزات الزرنيخ التي تتجاوز هذا الحد غير المألوف في مصادر المياه في العالم. في جنوب غرب الولايات المتحدة، أن المياه الجوفية ومياه الآبار والينابيع العديدة قد وثقت لاحتواء فيما يتعلق بمستويات الزرنيخ14. على سبيل المثال، يتضمن كذلك مونتيزوما في الوادي الأخضر، من الألف إلى الياء، 210 ميكروغرام/لتر للزرنيخ15. المياه الجوفية حول نهر الأخضر، من الألف إلى الياء يحتوي على 16 ميكروغرام/لتر للزرنيخ في المتوسط، مع قيم الذروة التي وصلت إلى 1.3 مغ/لتر15،16. جدير بالذكر أن تركيزات الزرنيخ في العديد من الآبار في إلقاء مياه النهر الأخضر يتجاوز 50 ميكروغرام/لتر15،16. مع هذه المعرفة، كانت تركيزات الزرنيخ بيئياً ذات الصلة المحددة التي تتراوح من أسفل MCL في 0.1 ميكرومتر (7.5 جزء في البليون)، أعلاه MCL الساعة 10 ميكرون (750 جزء في البليون) الحالية في دراسة14،،من1516 , 17 , 18 , 19 , 20 .
سيتم استخدام المعلومات التي تم جمعها من هذه التجارب كمؤشر مبكر للتغييرات المحتملة لمعدلات الهجرة الخلوية في في فيفو الجرح ملوثة بالزرنيخ. بعد ذلك، مما يشير إلى إمكانية تحديد الجزيئات استناداً إلى دورها في تسهيل التئام الجروح والهجرة الخلوية، وقد تحدد بوليميريز الكمية المقبلة سلسلة من ردود الفعل (قبكر) على أساس الجينات التعبير تجارب عند انتهاء الحالية الدراسات. إذا تغير معدلات الهجرة في هذا التحليل وجود الزرنيخ، الجينات محددة الأهداف المعنية بالهجرة الخلوية قد تكون هدفا للآثار الضارة للزرنيخ، وهكذا قد تكون الآلية التي تعطل.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Class II A/B3 Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td>15201-816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile Gloves</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>55082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Precision</td>
			<td>Model 182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Q080318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPR Centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>349702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Scale</td>
			<td>Ohaus</td>
			<td>I093 1125062111P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighting paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>H351125781212A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biohazard bags</td>
			<td>Fisherbran</td>
			<td>01-830A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Jacketed CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>309739-31053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10566-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Pipettor</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>140685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p200 Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p20 Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denominator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D59707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 tissue flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430725U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tube</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-539-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Marker</td>
			<td>Securline</td>
			<td>92167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wipes</td>
			<td>Kintech</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>63-67-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Filter Pipet Tips</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>16160210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Great Value</td>
			<td>220-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovial Rack</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>5030-0505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Gizmo Supply</td>
			<td>B00SCOGY56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube Rack</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waste Beaker</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Edge Ruler</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human neonatal dermal fibroblasts (hDFn)</td>
			<td>lot: 1734, 2902</td>
			<td>106-05n</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rstudio Statistical Software</td>
			<td></td>
			<td>ver: 3.5.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>NIH</td>
			<td>ver: 1.8.0_112</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro scratch assay to demonstrate effects of arsenic on skin cell migration

وقد فهم الآليات الفسيولوجية لالتئام تركيز البحوث الجارية لسنوات عديدة. يترجم هذا البحث مباشرة إلى التغييرات في المعايير السريرية المستخدمة لعلاج الجروح وخفض معدلات الاعتلال والوفيات للمرضى. التئام الجروح هو عملية معقدة تتطلب التفاعل الاستراتيجي في الخلايا والأنسجة والوظيفة. واحدة من العديد من الوظائف ذات أهمية حاسمة لالتئام الجروح هو الهجرة الخلوية الفردية والجماعية. عند إصابة، تهاجر خلايا مختلفة من الدم والأنسجة الضام، والظهاريه المحيطة بسرعة إلى موقع الجرح عن طريق المحفزات الكيميائية و/أو المادية. يمكن أن تملي هذه الاستجابة الهجرة إلى حد كبير نتائج ونجاح التئام الجروح. فهم هذه الوظيفة الخلوية محددة مهم للطب متعدية الجنسيات يمكن أن تؤدي إلى تحسين الجرح الشفاء نتائج. هنا، يمكننا وصف بروتوكول يستخدم من أجل فهم أفضل للهجرة الخلوية كما أنها تتصل بالتئام الجرح، وكيف التغييرات في البيئة الخلوية يمكن أن يغير كثيرا من هذه العملية. في هذا المثال الدراسة، كانت تزرع الليفية الجلدية في وسائل الإعلام التي تستكمل بالمصل البقري الجنين (FBS) كثقافات أحادي الطبقة في قوارير زراعة الأنسجة. أسيبتيكالي الخلايا المحولة إلى زراعة الأنسجة تعامل 12-جيدا لوحات ونمت لالتقاء 100%. عند الوصول إلى التقاء، كانت عمودياً خدش الخلايا في أحادي الطبقة استخدام تلميح بيبيت p200. الزرنيخ المخفف في وسائط الثقافة تستكمل مع FBS وأضيفت إلى الآبار الفردية في بيئياً ذات الصلة جرعات تتراوح بين 0.1-10 م الصور تم القبض على كل 4 ساعات (ح) على مدى فترة 24 ساعة مجهر ضوء معكوس لمراقبة الهجرة الخلوية (الجرح باستخدام إغلاق). صور منفردة حللت باستخدام برنامج تحليل الصور، والجرح في المائة الإغلاق تم حسابها. وتبين النتائج أن الزرنيخ يبطئ التئام الجروح. يوفر هذا الأسلوب شاشة أولى سريعة وغير مكلفة لتقييم آثار الملوثات على التئام الجروح.

وكان حجم العينة (n) لكل معاملة المجموعات n = 28. وكانت الخلايا المستزرعة بنجاح التقنيات التالية العقيم وبروتوكولات مختبر (الشكل 1). ولوحظت خدوش موحدة عبر كافة مجموعات علاجية مع عرض الصفر يعني قياس 0.8 ملم 0.4 مم (الشكل 2). مجموعات التحكم كان متوسط مساحة summed تحت المنحنى قيمة 1,355.83؛ ميكرومتر 0.01 كمجموعات العلاج كان متوسط قد لخص المنطقة تحت المنحنى قيمة 1,366.21؛ 0.1 ميكرومتر كمجموعات العلاج قد لخص متوسط المساحة تحت المنحنى قيمة 1,326.24، قد 1.0 ميكرومتر كفريق العلاج في متوسط قد لخص المنطقة تحت المنحنى قيمة 1,295.10؛ وأخيراً 10 ميكرومتر كما كان الفريق معاملة منطقة summed متوسط تحت المنحنى قيمة 535.12، الذي كان أقل إحصائيا مقارنة بجميع الفئات الأخرى (p < 0.05) (الشكل 3). واستخدمت برنامج R للتحليل الإحصائي لتشغيل ANOVA أحادي اتجاه مع تسوية توكي الوظائف المخصصة لتحديد الفروق الإحصائية بين المجموعات المعالجة (ف < 0.05).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58838/58838fig2.jpg"> رقم 2: الاعتداء الصفر الممثل الصور على مدى فترة 20 ح. د-الصور تمثل الهجرة الخلوية لخلايا المراقبة؛ الصور ه-ح تمثل الهجرة الخلوية للخلايا الملوثة مع 1.0 ميكرومتر ك؛ وتمثل الصور أنا-L الهجرة الخلوية للخلايا الملوثة مع 10 ميكرون ك. من هذه الصور، فمن الواضح أن الهجرة الخلوية تباطأ حضور الزرنيخ. إظهار الصور تحكم الصفر "شُفي" تماما بعد ح 20، بينما الفريقان كمعاملة أخرى لا "تلتئم". ميكرومتر 10 كعلاج أعاق الإغلاق الكامل تماما بعد 24 h. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58838/58838fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58838/58838fig3.jpg"> الشكل 3: الزرنيخ يؤدي إلى إبطاء الهجرة الخلوية في مقايسة الصفر. تم القبض على الصور على مدى فترة 24 ساعة لمراقبة التغييرات في معدلات الهجرة الخلوية وجود تركيزات متفاوتة من الزرنيخ. تم تحليل صور raw باستخدام برامج الآلي (مثلاً، في MATLAB)، الذي عرض الجرح المقاسة في البداية، ثم تحسب نسبة الإغلاق، وأخيراً المنطقة تحت المنحنى (AUC). أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للوسط. ميكرومتر 10 كمجموعة العلاج إحصائيا تباطأت الهجرة الخلوية البشرية عن طريق الجلد الخلايا الليفية الولدان (هدفن)، سيظهر بقيمة أوك إحصائيا أقل، مقارنة بجميع المجموعات المعاملة الأخرى استخدام ANOVA اتجاه واحد مع تسوية وظيفة المخصص توكي (ف < 0.05). يتم تمثيل الاختلافات الإحصائية بالحروف "ألف" و "باء"، والتي تم الحصول عليها من خلال استخدام أسلوب "ضغط رسالة العرض" المتاحة في برنامج البحث والتطوير. العلاجات التي لا تشترك في رسالة مشتركة يعتد به إحصائيا من بعضها البعض (ف < 0.05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58838/58838fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration at JoVE.com

In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration

في المختبر الصفر المقايسة لإثبات آثار الزرنيخ على هجرة خلايا الجلد

وتركز هذه الدراسة على نموذج في المختبر للجرح شفاء (الصفر المقايسة) كآلية لتحديد الملوثات البيئية كيف مثل الزرنيخ تأثير الهجرة الخلوية. وتبين النتائج أن هذا التحليل في المختبر يوفر مؤشرات السريع والمبكر للتغييرات للهجرة الخلوية قبل التجريب في فيفو .

Understanding the physiologic mechanisms of wound healing has been the focus of ongoing research for many years. This research directly translates into ...

الهجرة الخلوية هي عملية شفاء الجروح الحرجة التي يمكن أن تغير جذريا نتيجة الجرح الشفاء. يسمح هذا البروتوكول للباحثين بفهم أفضل لتأثير المركبات المختلفة على الهجرة الخلوية أثناء التئام الجروح. والتي يمكن أن تؤدي في كثير من الأحيان إلى استراتيجيات علاجية مستهدفة للطب السريري.إن المقايسة الصفرية هي نهج فعال من حيث التكلفة وعالي الإنتاجية لتوليد بيانات ذات معنى لتضميد الجروح قبل إجراء اختبار vivo مكلف ومكثف للوقت. الحكّام كطريقة بشكل خاصّ مهمّة في جرح تضميد جراح تطبيقات. على وجه التحديد، الجلد.ومع ذلك ، فإن الفحص هو في الحقيقة مقايسة هجرة ، ويمكن تطبيقه على أي نوع خلية حيث يكون ترحيل الخلايا مهمًا لقياسه أو التقاطه. مماثلة لثقافة الخلايا والأنسجة الكلاسيكية ، وإجراءات التشغيل القياسية ، والتدريب ، والتقنية ، والممارسة ، والممارسة. تلك هي مفتاح النجاح مع الحكة.وسيكون من بين البرهان على الإجراء ناثان كروز، وهو طالب ماجستير، وأوسكار لوجان، وهو باحث جامعي. لبدء هذا الإجراء، وإعداد مجلس الوزراء السلامة البيولوجية II باستخدام 70٪ محلول مائي isopropyl لإجراء مسح الصرف الصحي، بدءا من الجدران الخلفية والجانبية، والعمل وصولا الى اللوح الأساسي. أيضا مسح أسفل جميع المواد التي سيتم استخدامها في المقايسة قبل وضعها في مجلس الوزراء.بعد ذلك، الحصول على قنينات تحتوي على خط الخلية المبردة المطلوبة، ووضع واحدة في حمام مائي عميق سنتيمتر واحد في 37 درجة مئوية لذوبان الجليد. إضافة 10 ملليلتر من المتوسطة تكملها 10٪ FBS في قارورة زراعة الأنسجة T75. فتح القارورة التي تحتوي على مخزون الخلية، وpirate بعناية الحل.ثم نقل الخلايا إلى قارورة T75. إزالة ملليلتر واحد من وسائل الإعلام من القارورة، ونقلها مرة أخرى إلى القارورة، ومن ثم نقله مرة أخرى إلى قارورة لتعظيم العائد الخلية من القارورة. تشديد قبعة القارورة وروك بلطف عليه لتفريق موحدة الخلايا في تعليق عبر السطح بأكمله.بعد هذا، ضع القارورة بالمعلومات المعروضة هنا، ووضعها في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 72 ساعة. أولاً، استرداد قارورة زراعة الأنسجة من الحاضنة، ومراقبة الخلايا الملتزمة كما هو موضح في بروتوكول النص. التعرق كامل حجم وسائل الإعلام من قارورة ونقلها إلى حاوية النفايات.إضافة خمسة ملليلتر من محلول الملح متوازن إلى القارورة، والصخور بلطف لشطف أي وسائل الإعلام الزائدة، والخلايا الميتة، أو النفايات المنتج. ثم إزالة كامل حجم محلول الملح من القارورة والتخلص منه في حاوية النفايات. بعد ذلك ، أضف مليلترين من التربسين إلى القارورة ، وخرزها بلطف لتفريق الإنزيم فوق الخلايا الملتزم بها.تأكد من أن سطح الملتصا مشبع تماما، ووضع قارورة الأنسجة في الحاضنة لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق. بعد ذلك، اضغط بلطف على جانب القارورة ثلاث إلى خمس مرات للمساعدة في تسهيل انفصال الخلية. امسح القارورة بـ 70٪ من الكحول، ووضعها في خزانة السلامة البيولوجية.إضافة خمسة ملليلترات من وسائل الإعلام الأسهم إلى قارورة الأنسجة لوقف رد فعل الركيزة الانزيم. استلهم حجم السائل بالكامل من القارورة، ونقله إلى أنبوب مخروطي مُعقم 15 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي في 200 مرة ز و 25 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.ثم استخدام 70٪ الكحول لمسح أسفل الأنبوب الذي يحتوي على الخلايا بيليه، ووضعها داخل مجلس الوزراء السلامة الحيوية. ماصة قبالة وسائل الإعلام، وترك وراء ما يقرب من 250 ميكرولترات من السوائل مع بيليه الخلية. تشغيل الجزء السفلي من أنبوب مخروطي عبر فتحات القارورة من رف أنبوب microcentrifuge لخلق اهتزاز سريع والانزعاج وإعادة تركيب بيليه الخلية.عندما تكتمل بشكل صحيح، سوف تظهر حل الخلية الجديدة كخليط غائم مع أي بيليه المتبقية. إضافة ملليلترين من الوسائط إلى إعادة الإضافة الخلية. ماصة الخلايا بلطف صعودا وهبوطا على جانب الأنبوب 20 مرة لتفريق أي كتل.وسجل حجم إجمالي تعليق الخلية. بعد ذلك، استخدم ماصة معقمة لإضافة 20 ميكرولترات من الأسهم الزرقاء trypan إلى بئر فارغة من لوحة 96 جيدا. باستخدام تلميح ماصات معقمة، نقل 20 ميكرولترات من مخزون الخلية من أنبوب 15 ملليلتر إلى البئر التي تحتوي على حل تريبان الأزرق.الماصات بلطف لخلط المحتويات ونقل 10 ميكرولترات من الخليط بين زلة الغطاء وغرفة العد على مقياس الدم. عد الخلايا فقط في الوسط وأربعة مربعات زاوية، بشكل منفصل حساب كل من العدد الكلي للخلية وعدد الخلايا غير قابلة للحياة للمربعات الخمسة التي تم تحديدها. بعد حساب عدد الخلايا القابلة للتطبيق، ضع علامة على خط أفقي عبر الجزء السفلي من لوحة 12-well لتكون بمثابة علامة مرجعية أثناء التصوير.تخفيف مخزون الخلية مع وسائل الإعلام إلى كثافة 19،000 خلية لكل ملليلتر. ثم بذور كل بئر من لوحة 12-جيدا مع ملليلتر واحد من مخزون الخلايا المخففة، وخلط مخزون الخلية بشكل دوري لضمان حتى بذر الخلايا عبر جميع الآبار 12. تسمية كل لوحة مع المعلومات المعروضة هنا.ووضعها في حاضنة عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى تنمو الخلايا إلى التقاء 100٪. استرداد لوحة 12-جيدا مع الخلايا من الحاضنة. باستخدام المجهر مع هدف 10x، ومراقبة الخلايا وتحديد التقاء داخل كل بئر.المقبل، والطامح والتخلص من وسائل الإعلام النمو من كل بئر. تجميع أنبوب P200 مع 1-200 تلميح معقم ميكرولتر. في كل بئر، تنزلق طرف ماصة عبر سطح الخلية من موقع 12:00 إلى موقع 6:00 لإنتاج جرح وهمية خدش.شطف كل بئر مع ملليلتر واحد من محلول الملح متوازن لمسح بعيدا الحطام الزائد وكتل الخلايا. صخرة لوحة من جانب إلى آخر لتسهيل الغسيل. ثم إزالة والتخلص من محلول الملح متوازن من كل بئر.باستخدام أنبوب P1000 مع طرف 1، 000 ميكرولتر، إضافة 1،000 ميكرولتر من مخزون الزرنيخ المعدة في الآبار التي تم تعيينها عشوائيا مع مجموعة العلاج. استخدمي نصيحة جديدة للميصة لكل بئر، وسجلي الوقت الذي تتم فيه إضافة العلاجات. احتضان لوحات في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.لتصوير اللوحات، التقط صور كل بئر في التكبير الموضوعي 10x كل أربع ساعات على مدى 24 ساعة. الرجوع إلى الخط الذي تم رسمه مسبقًا على الجزء السفلي من اللوحة إلى صورة نفس الموقع على طول الخدش داخل كل بئر في كل نقطة زمنية. في هذه الدراسة، يتم استخدام اختبار خدش الجسم الحي لمراقبة آثار الزرنيخ على هجرة الخلايا.ويلاحظ الخدوش موحدة في جميع مجموعات العلاج، مع متوسط عرض الصفر من حوالي 0.8 ملليمتر. تظهر خلايا التحكم خدشًا مُشفى تمامًا بعد 20 ساعة. لا تظهر المجموعتين الزرنيخ هذا المستوى من الشفاء.مع علاج 10 ميكرومولار تثبيط الإغلاق تماما لمدة 24 ساعة. وتبين هذه النتائج أن وجود الزرنيخ يبطئ الهجرة الخلوية. يتم تحليل الصور الخام التي تم التقاطها أثناء الفحص باستخدام برنامج آلي لقياس عرض الجرح ، ثم حساب نسبة الإغلاق ، وأخيراً حساب المنطقة تحت المنحنى.تُظهر مجموعة علاج الـ10 ميكرومولار الهجرة الخلوية البطيئة إحصائيًا للتليف الجلدي البشري الوليدي مقارنة بجميع مجموعات العلاج الأخرى. من المهم أن تمارس بدقة هذه التقنية لزيادة الاتساق عند خدش الخلايا. يمكن أن يؤدي التغير غير المقصود بين المقايسات إلى انحراف البيانات وتغيير الاستنتاجات.ويمكن استخدام تقنيات جزيئية أخرى مثل تفاعل البوليميراز الكمي المتسلسل ومقايس المناعة المرتبطة بالانزيم بعد الخدش لتحديد إشارات الرسول والبروتينات التي قد تكون هدفًا للتغييرات في هجرة الخلايا التي لوحظت في الفحص. وقد ساهم هذا الفحص في فهم الباحثين لتشائل السرطان، وعلاجات السرطان الناشئة الجديدة، والخلايا الجذعية والطب التجديدي، والعديد من المعالم العلمية الأخرى.

Research

JoVE Journal

Environment

In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration

Exploring the Effects of Atmospheric Forcings on Evaporation: Experimental Integration of the Atmospheric Boundary Layer and Shallow Subsurface

استكشاف تأثيرات الغلاف الجوي التأثيرات على التبخر: تجربة دمج طبقة الغلاف الجوي الحدود وتحت السطحية الضحلة

Evaporation is directly influenced by the interactions between the atmosphere, land surface and soil subsurface. This work aims to experimentally study ...

A CO2 Concentration Gradient Facility for Testing CO2 Enrichment and Soil Effects on Grassland Ecosystem Function

A CO2 Concentration Gradient Facility for Testing CO2 Enrichment and Soil Effects on Grassland Ecosystem Function

A CO<sub&gt; 2</sub&gt; مرفق تركيز متدرجة لاختبار CO<sub&gt; 2</sub&gt; الإثراء والتربة تأثيرات على وظيفة الأراضي العشبية النظام الإيكولوجي

Continuing increases in atmospheric carbon dioxide concentrations (CA) mandate techniques for examining impacts on terrestrial ecosystems. Most ...

A Flow-through Exposure System for Evaluating Suspended Sediments Effects on Aquatic Life

نظام التعرض تدفق من خلال لتقييم موقوف الرواسب التأثيرات على الحياة المائية

This paper describes the Fish Larvae and Egg Exposure System (FLEES). The flow-through exposure system is used to investigate the effects of suspended ...

Determination of Inorganic Arsenic in a Wide Range of Food Matrices using Hydride Generation - Atomic Absorption Spectrometry.

تصميم الزرنيخ "غير العضوي" في "واسعة النطاق للأغذية مصفوفات" استخدام "هيدريد جيل"-قياس الطيف الكتلي الامتصاص الذري.

The European Food Safety Authority (EFSA) underlined in its Scientific Opinion on Arsenic in Food that in order to support a sound exposure assessment to ...

Protocol for Assessing the Relative Effects of Environment and Genetics on Antler and Body Growth for a Long-lived Cervid

البروتوكول المتعلق بتقييم الآثار النسبية للبيئة وعلم الوراثة في قرن الوعل ونمو الجسم سيرفيد المعمرة

Cervid phenotype can be placed into one of two categories: efficiency, which promotes survival over extravagant morphometric growth, and luxury, which ...

Preparation of DMMTAV and DMDTAV Using DMAV for Environmental Applications: Synthesis, Purification, and Confirmation

Preparation of DMMTAV and DMDTAV Using DMAV for Environmental Applications: Synthesis, Purification, and Confirmation

إعداد دممتاالخامس ودمدتاV استخدام DMAالخامس للتطبيقات البيئية: توليف وتنقيتها، وتأكيد

Dimethylated thioarsenicals such as dimethylmonothioarsinic acid (DMMTAV) and dimethyldithioarsinic acid (DMDTAV), which are produced by the metabolic ...

Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA

جمع واستخراج عينات من الهواء المهنية لتحليل الحمض النووي الفطرية

Traditional methods of identifying fungal exposures in occupational environments, such as culture and microscopy-based approaches, have several ...

An Experimental Protocol for Studying Mineral Effects on Organic Hydrothermal Transformations

وضع بروتوكول تجريبي لدراسة الآثار المعدنية على التحولات الحرارية المائية العضوية

Organic-mineral interactions are widely occurring in hydrothermal environments, such as hot springs, geysers on land, and the hydrothermal vents in the ...

Composition and Distribution Analysis of Bioaerosols Under Different Environmental Conditions

تكوين وتحليل التوزيع من بيوايروسولس تحت ظروف بيئية مختلفة

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, ...

Removal of Arsenic Using a Cationic Polymer Gel Impregnated with Iron Hydroxide

إزالة الزرنيخ باستخدام جل البوليمر الموجبة مشربة مع هيدروكسيد الحديد

In this work, we prepared an adsorbent composed of a cationic polymer gel containing iron hydroxide in its structure designed to adsorb arsenic from ...