Name: in vitro scratch assay to demonstrate effects of arsenic on skin cell migration
Uploaded: 2019-02-23T13:00:00
Duration: 9 min 24 s
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该出版物中报告的研究得到了国家卫生研究院少数群体健康和健康差距研究所的支持, 该奖项编号为 U54MD012388。内容完全由作者负责, 不一定代表国家卫生研究院的官方观点。

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	<li>Diegelmann, R., Evans, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing:+an+overview+of+acute,+fibrotic+and+delayed+healing.">Wound healing: an overview of acute, fibrotic and delayed healing.</a> Frontiers in BioScience. 9, 283-289 (2004).</li><li>Braiman-Wiksman, L., Solomonik, I., Spira, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+into+wound+healing+sequence+of+events.">Novel insights into wound healing sequence of events.</a> Toxicologic Pathology. 35, 767-779 (2007).</li><li>Michelson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Platelets. , (2013).</li><li>Aikawa, M., Schoenbechler, M. J., Barbaro, J. F., Sadun, E. 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Electron microscopic observations.</a> American Journal of Pathology. 63 (1), 85-98 (1971).</li><li>Liang, C., Park, A., Guan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+scratch+assay:+A+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro.">In vitro scratch assay: A convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nature Protocols. , 329-333 (2007).</li><li>Pinto, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bench-top+in+vitro+wound+assay+to+evaluate+wound+closure.+Applied.">A bench-top in vitro wound assay to evaluate wound closure. Applied.</a> In Vitro Toxicology. 2 (3), 151-156 (2016).</li><li>Pinto, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+mitigates+the+negative+effects+of+arsenic+contamination+in+an+in+vitro+wound+model.">Estrogen mitigates the negative effects of arsenic contamination in an in vitro wound model.</a> Applied In Vitro Toxicology. 4 (1), 24-29 (2018).</li><li>Roubelakis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-rich+plasma+(PRP)+promotes+fetal+mesenchymal+stem/stromal+cell+migration+and+wound+healing+process.">Platelet-rich plasma (PRP) promotes fetal mesenchymal stem/stromal cell migration and wound healing process.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 417-428 (2014).</li><li>Shibata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adiponectin+regulates+cutaneous+wound+healing+by+promoting+keratinocyte+proliferation+and+migration+via+the+ERK+signaling+pathway.">Adiponectin regulates cutaneous wound healing by promoting keratinocyte proliferation and migration via the ERK signaling pathway.</a> Journal of Immunology. 189 (6), 3231-3241 (2012).</li><li>Mendonca, R. 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I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+Children's+Urinary+CC16+Levels+with+Arsenic+Concentrations+in+Multiple+Environmental+Media.">Association of Children's Urinary CC16 Levels with Arsenic Concentrations in Multiple Environmental Media.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health. 13, (2016).</li><li>Pomari, E., Dalla Valle, L., Pertile, P., Colombo, L., Thornton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracrine+sex+steroid+synthesis+and+signaling+in+human+epidermal+keratinocytes+and+dermal+fibroblasts.">Intracrine sex steroid synthesis and signaling in human epidermal keratinocytes and dermal fibroblasts.</a> The FASEB Journal. 29 (2), 508-524 (2015).</li><li>Gotsulyak, Y., Kosach, R., Cherednyk, V., Tykhonkova, O., Khoruzhenka, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+cell+motility+evaluation+in+scratch+assay.">Optimization of cell motility evaluation in scratch assay.</a> Biopolymers and Cell. 30, 223-228 (2014).</li><li>Goetsch, K. P., Niesler, C. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+scratch+assay+for+in+vitro+skeletal+muscle+wound+healing+analysis.">Optimization of the scratch assay for in vitro skeletal muscle wound healing analysis.</a> Analytical Biochemistry. 411, 158-160 (2011).</li><li>Harishkumar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+the+mechanism+of+in+vitro+wound+healing+properties+of+citrus+tamurana+extract.">Revealing the mechanism of in vitro wound healing properties of citrus tamurana extract.</a> BioMed Research International. 13, (2013).</li><li>Johnston, S. T., Simpson, M. J., McElwain, D. L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+much+information+can+be+obtained+from+tracking+the+position+of+the+leading+edge+in+a+scratch+assay?.">How much information can be obtained from tracking the position of the leading edge in a scratch assay?.</a> Journal of the Royal Society Interface. 11, 1-9 (2014).</li></ol>

作者没有什么可透露的。

该检测方法的应用可提供高通量和及时的细胞迁移评估, 并可直接转化为复杂的生理系统5,6,7。为此, 提出的台式模型进行了调整和实践, 以评估各种治疗剂和环境毒素对伤口愈合的影响6。通过对已知接触水平的广泛文献搜索, 以及对各种数据库14、15 的 回顾性审查, 本研究中使用的砷浓度被认为与环境有关。16,17,18,19,20,21。使用这种体外划痕试验表明, 暴露在高, 但与环境相关的范围内的砷浓度, 延迟伤口闭合 (细胞迁移)。
这种台面模型也被用来分离和研究单个细胞系 (成纤维细胞), 以进一步了解成纤维细胞迁移如何有助于伤口愈合的结果。此外, 很难研究单个细胞系在复杂的体内系统中的功能, 许多其他细胞和组织可能会干扰分析。此外, 该检测提供了一种实现半定量百分比伤口闭合数据的方法, 这些数据可用于针对特定的细胞机制, 通过这些机制, 化合物可能会影响伤口愈合。例如, 划痕检测中使用的细胞可以收集并储存在所需的试剂中, 并用于基因表达 (信号 mrna) 或蛋白质表达检测22。如果调查员试图了解哪些信号或蛋白质可能在很大程度上促成了在存在不同治疗方法 (即砷) 的情况下细胞迁移的变化, 则这些信息对他们很有用。
根据人类新生儿真皮成纤维细胞在创面愈合中的突出作用, 选择了他们进行这项工作。然而, 这种划痕检测协议已经使用各种细胞类型实施, 并用于一系列研究目的。例如, 在肿瘤学领域采用划痕法研究化疗药物的迁移抑制 23;用于骨骼肌细胞迁移、增殖和扩散24;研究植物提取物对细胞迁移的影响25;并了解角质形成细胞的迁移和增殖是如何促进伤口愈合的 9。此外, pinto等人先前的一篇论文利用划痕分析6评估了铀 (u) 和富含血小板的血浆 (prp) 对 hdfn 迁移的影响。这项工作的目的是了解这种检测在多大程度上可以测试被认为是减缓细胞迁移 (u) 的剂的效果, 以及被认为是加速细胞迁移 (prp) 的代理的效果。从上述工作和其他研究人员的研究中可以看出, 划痕法的应用在各种实验模型26 中具有很高的应用潜力。尽管方法中提供了细节, 但调查人员和实验人员之间应出现差异。例如, 除了独特细胞类型所需的微量营养素外, 细胞迁移率可能会根据所使用的细胞系而波动。许多有助于细胞产量和活力的重要观察被列为整个本协议中的笔记。然而, 强烈建议调查人员遵循制造商关于最佳生长条件的建议, 并将这种方法作为一般细胞培养工作的补充说明。
虽然划痕检测是非常多才多艺的细胞活性的研究;测量技术中可能会出现不可预见的偏差。例如, 当使用 imagej 手动跟踪单元格迁移方面时, 用户之间可能存在差异, 这可能会限制准确性和具有代表性的数据收集。还应指出的是, 迁移方面应被理解为对处理视而不见, 以最大限度地减少用户偏见。此外, 手动识别迁移面可能会导致错误地计算平均行驶距离, 因为细胞形成了假脚群, 并有能力伸出来形成焦点粘连, 这在视觉上可能会产生误导。同样, 在细胞表面使用荧光 "细胞跟踪器" 染料或核蛋白检测迁移可能会无意中修复细胞, 从而在测量细胞随时间的迁移时出现不准确。建议在实验中加入适当的阳性和阴性对照, 以完全评估治疗对细胞系的影响。这种检测的实践必须在认识到其局限性的情况下完成。该检测并不能保证从体外实验中获得的细胞迁移结果将直接转化为体内结局.在一个复杂的生命系统中, 伤口愈合和细胞迁移涉及多种细胞类型和分子信号;每一个都有可能影响治疗反应。
总之, 划痕检测已被发现提供了高通量筛选的细胞迁移响应不断变化的环境6,25。我们专门利用该协议成功地检测了由于在各种环境相关的剂量下接触砷而引起的细胞迁移的变化。这些数据为使用划痕分析进一步研究和评估本检测中细胞迁移的机械途径以及砷接触如何改变这些途径提供了理由。

伤口愈合由一系列复杂的重叠步骤组成, 涉及各种细胞类型、信号分子和细胞外基质成分 1。这些成分共同协同工作, 以实现伤口的分辨率或修复, 最终导致形成一个纤维化的保护性疤痕,这取决于创伤的程度1。在一个实验中捕捉伤口愈合的个别过程和功能是困难的;伤口愈合过程中的个别步骤需要单独识别和测试。在伤口愈合的许多步骤中, 细胞迁移的过程在评估愈合率时被认为是至关重要的2。细胞迁移可以在伤口愈合的所有阶段观察到, 因此需要进一步了解细胞迁移的改变如何影响伤口闭合。例如, 细胞迁移出现在早期和晚期炎症中, 在伤口部位3处凝血和血小板聚集。这些事件通过形成暂时堵塞来填补没有组织3的受伤区域, 从而防止过度失血。循环中的血小板将合成和分泌血管活性介质以及趋化因子, 这些因子共同向受伤组织传递炎症白细胞迁移 (白细胞) 信号, 用于修复4。再上皮化发生在组织损伤后的几个小时内, 包括通过上皮角质细胞的活动和迁移覆盖伤口部位, 以防止外来颗粒进一步污染或侵入伤口部位2。这些例子只捕获了与伤口愈合相关的许多细胞迁移功能中的几个。
对划痕法进行了描述, 并用于更好地了解细胞迁移及其在伤口愈合中的许多作用 5,6。这种检测被认为是简单的, 提供高吞吐量, 并使调查员能够收集具有代表性的细胞迁移数据。迁移检测已成功地证明某些化合物可能会加速或减缓细胞迁移的速度6。此外, 这些检测结果提供了可用于在体内实验之前制定目标处理、剂量浓度和感兴趣的基因的转化生理信息。该检测需要基本的细胞培养技术和用品、首选的细胞系以及成像技术, 以捕捉随着时间的推移而移动或响应治疗的运动。
该检测可以很容易地操纵或定制, 以满足调查人员的需要。然而, 在实验之前有四个基本问题需要考虑。调查人员试图回答哪些一般性或具体问题？这适用于大多数假设驱动的研究;然而, 它是至关重要的, 这种检测, 因为它将确定准确和完全回答问题所需的许多参数。应该用什么细胞系或细胞系 (如果是多个) 来代表正在研究的生理系统？例如, 在皮肤伤口愈合研究中,真皮成纤维细胞5、6、7、干细胞8或表皮角质形成细胞9可能被认为代表通常发现的细胞群皮肤组织中的丰富量10。或者, 中性粒细胞, 巨噬细胞或其他炎症细胞可以在这个系统中进行评估, 以代表细胞迁移的伤口愈合在皮肤组织10。此外, 确定正在评估的特定细胞系将有助于确定哪些试剂是最佳的使用, 以促进细胞代谢活动。细胞迁移将如何被跟踪？有许多技术用于观察盘子或烧瓶内的细胞迁移。例如, 染色或荧光标记细胞, 并使用荧光或共聚焦成像来跟踪细胞提供了强烈的对比, 这使得调查员能够清楚地定义细胞与非细胞的位置和细胞运动11.另一种常见的技术, 在这项研究中描述, 是使用倒置光显微镜与相对比6,7。这种替代细胞染料和荧光的方法使用户无需在成像前最终固定细胞即可活跟踪细胞, 还可以捕获包含不同时间点的细胞受伤单层的同一口井的图像。将使用哪些结果措施进行分析？利用整个研究过程中收集的图像, 可以生成数据, 在这些数据中可以了解细胞迁移率的变化。在我们的实验室中, 将倒置光学显微镜上拍摄的显微图像上传到图像分析软件, 计算曲线下的伤口闭合率和求和面积。
我们将强调这种检测方法的具体用途, 以阐明在已知的环境污染物砷存在的情况下皮肤成纤维细胞迁移的变化。砷是一种天然存在的金属, 存在于地壳中。在不同地点发现了砷含量较高的地方, 这对居住在这些地点附近的个人构成了风险。因此, 事实证明, 食物和水源增加了砷污染的程度, 增加了个人接触砷的可能性。环境砷接触已被证明对高于甚至低于美国环境保护署 (美国环保局) 目前 10 ppb (10μgl) 12 的最大污染物水平 (mcl)12的人群的健康产生长期影响,13. 虽然美国环保局制定了这一 mcl, 并认为它对饮酒限制是安全的, 但超过这一限度的砷浓度在全世界的水源中并不少见。在美国西南部, 有大量的地下水、井水和泉水含有有关的砷含量 14。例如, 在佛得角谷、az、蒙特祖马井中含有210微克/砷 15.沿佛得角河周围的地下水, az 平均含有16μgl 砷, 峰值达到 1.3 mgl15,16。值得注意的是, 佛得角河流域许多水井中的砷浓度超过 50μgs·15,16。根据这一知识, 在目前的研究14、15、 16 中, 选择了与环境相关的砷浓度, 从低于 mcl 的 0.1μm (7.5 ppb) 到在 mcl 以上的 10μm (750 ppb) 不等.,17,18,19,20.
从这些实验中收集到的信息将被用作受砷污染的体内伤口细胞迁移率可能发生变化的早期指标。然后, 可以根据信号分子在促进伤口愈合和细胞迁移方面的作用来选择信号分子, 并在电流完成后建立未来的基于定量聚合酶链反应 (qpcr) 的基因表达实验研究。如果在这种检测中, 在砷存在的情况下, 迁移率发生变化, 细胞迁移中涉及的特定基因靶标可能是砷有害影响的目标, 因此可能是破坏的机制。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Class II A/B3 Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td>15201-816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile Gloves</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>55082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Precision</td>
			<td>Model 182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Q080318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPR Centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>349702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Scale</td>
			<td>Ohaus</td>
			<td>I093 1125062111P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighting paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>H351125781212A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biohazard bags</td>
			<td>Fisherbran</td>
			<td>01-830A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Jacketed CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>309739-31053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10566-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Pipettor</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>140685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p200 Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p20 Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denominator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D59707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 tissue flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430725U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tube</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-539-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Marker</td>
			<td>Securline</td>
			<td>92167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wipes</td>
			<td>Kintech</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>63-67-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Filter Pipet Tips</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>16160210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Great Value</td>
			<td>220-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovial Rack</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>5030-0505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Gizmo Supply</td>
			<td>B00SCOGY56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube Rack</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waste Beaker</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Edge Ruler</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human neonatal dermal fibroblasts (hDFn)</td>
			<td>lot: 1734, 2902</td>
			<td>106-05n</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rstudio Statistical Software</td>
			<td></td>
			<td>ver: 3.5.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>NIH</td>
			<td>ver: 1.8.0_112</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro scratch assay to demonstrate effects of arsenic on skin cell migration

了解伤口愈合的生理机制一直是多年来正在进行的研究的重点。这项研究直接转化为临床标准的变化, 用于治疗伤口和降低发病率和死亡率的患者。伤口愈合是一个复杂的过程, 需要战略性的细胞和组织的相互作用和功能。伤口愈合的许多至关重要的功能之一是个体和集体细胞迁移。受伤后, 血液、周围结缔组织和上皮组织中的各种细胞通过化学和物理刺激迅速迁移到伤口部位。这种迁移反应在很大程度上决定了愈合伤口的结果和成功。了解这种特定的细胞功能对于转化医学很重要, 因为这种转化医学可以改善伤口愈合的结果。在这里, 我们描述了一个协议, 用于更好地理解细胞迁移, 因为它涉及到伤口愈合, 以及如何改变细胞环境可以显著改变这一过程。在本例中, 真皮成纤维细胞生长在培养基中, 并以胎儿牛血清 (fbs) 为补充, 作为组织培养瓶中的单层培养物。细胞无菌转移到组织培养中, 经过12孔钢板处理, 并生长到100% 融合。到达汇合处后, 单层中的细胞被垂直划伤, 使用 p200 管尖。在培养介质中稀释的砷被添加到与环境相关的剂量为 0.1-10m, 每 4小时 (h) 拍摄图像一次, 使用倒置光显微镜观察细胞迁移 (伤口)结束)。利用图像分析软件对图像进行了单独分析, 计算了创面闭合百分比。结果表明, 砷减缓伤口愈合。这项技术提供了一个快速和廉价的第一屏幕, 以评估污染物对伤口愈合的影响。

所有治疗组的样本大小 (n) 为n = 28。细胞是按照无菌技术和实验室协议成功培养的 (图 1)。在所有治疗组中观察到均匀的划痕, 平均划伤宽度为 0.8 mm 0.4 毫米 (图 2)。对照组的平均求和面积低于曲线值 1 355.83;0.01μm as 治疗组的平均求和面积低于曲线值 1 366.21;0.1μm as 处理组的平均求和面积在曲线值 1, 326.24 下, 1.0 μm as 处理组的平均求和面积在曲线值 1, 295.10 下;最后, 10μm as 治疗组的平均求和面积低于曲线值 535.12, 与所有其他组相比有统计学意义 (p < 0.05) (图 3)。统计分析的 r 程序被用来运行单向方差分析, 并进行 tukey的临时后调整, 以确定治疗组之间的统计差异 (p < 0.05)。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58838/58838fig2.jpg"> 图 2: 在20小时内具有代表性的划痕检测图像.图像 a-d 表示控制细胞的细胞迁移;图像 e-h 表示受1.0 μm as 污染的细胞的细胞迁移;图像 i-l 表示受 10μm as 污染的细胞的细胞迁移。从这些图像中可以清楚地看出, 在砷存在的情况下, 细胞迁移速度变慢。控制图像显示, 2 0 小时后完全 "治愈" 的划痕, 而另外两个治疗组则没有 "治愈"。10μm as 治疗完全禁止在24小时后完全关闭. 请<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58838/58838fig2large.jpg" target="_blank">点击这里查看此数字的较大版本.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58838/58838fig3.jpg"> 图 3: 砷减缓划痕检测中的细胞迁移.在24小时内拍摄到的图像是为了观察在砷浓度不同的情况下细胞迁移率的变化。使用自动化软件 (例如, 在 matlab 中) 对原始图像进行了分析, 该软件最初测量伤口宽度, 然后计算出百分比闭合, 最后计算曲线下的面积 (auc)。错误条表示平均值的标准误差。10μm as 治疗组在统计上减缓了新生儿皮肤成纤维细胞的细胞迁移, 与使用单向方差分析并进行临时调整的所有其他治疗组相比, 这一值的 auc 值在统计学上较低 (p& lt;0.05)。统计差异由字母 "a" 和 "b" 表示, 它们是通过使用 r 程序中提供的紧凑型字母显示方法获得的。不共享共同字母的治疗在统计上具有重要意义 (p<0.05)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58838/58838fig3large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>

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In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration

在体外显示砷对皮肤细胞迁移影响的划痕测定

本研究的重点是伤口愈合的体外模型 (划痕检测), 作为一种机制, 以确定环境污染物, 如砷如何影响细胞迁移。结果表明, 这种体外检测在体内实验之前为细胞迁移的变化提供了快速和早期的迹象。

Understanding the physiologic mechanisms of wound healing has been the focus of ongoing research for many years. This research directly translates into ...

细胞迁移是一个关键的伤口愈合过程，可以彻底改变愈合伤口的结果。该协议使研究人员能够更好地了解各种化合物在伤口愈合过程中对细胞迁移的影响。这往往会导致临床医学的有针对性的治疗策略。划痕检测是一种经济高效且高通量的方法，用于在成本高昂且时间密集的体内测试之前生成有意义的伤口愈合数据。划痕测定作为一种方法在伤口愈合应用中特别相关。最具体地说，皮肤。然而，该检测实际上是一种迁移检测，可以应用于任何细胞类型，其中细胞迁移是感兴趣的测量或捕获。类似于经典的细胞和组织培养，标准操作程序，培训，技术和实践，实践，实践。这些都是成功的关键与划痕测定。展示这个程序的将是硕士生内森·克鲁兹和本科生奥斯卡·卢詹。要开始此过程，请使用 70% 异丙基水溶液准备生物安全 II 机柜，以执行卫生擦拭，从后壁和侧壁开始，一直工作到底板。在将检测材料放入机柜之前，还要擦拭所有用于测定的材料。接下来，获取含有所需冷冻保留细胞系的小瓶，并在37摄氏度的1厘米深的水浴中放置一个，以解冻。将10毫升的介质加入10%FBS，加入T75组织培养瓶。打开含有细胞储存的小瓶，小心吸气溶液。然后将细胞转移到T75烧瓶中。从烧瓶中取出一毫升的介质，并将其转移回小瓶中，然后将其转移回烧瓶中，以最大限度地提高小瓶中的细胞产量。拧紧烧瓶盖，轻轻摇动它，以均匀地将悬浮的细胞分散到整个表面。之后，用此处显示的信息标记烧瓶，并在 37 摄氏度和 5%的二氧化碳下放置在加湿的培养箱中 72 小时。首先，从培养箱中取回组织培养瓶，并观察文本协议中所述的粘附细胞。从烧瓶中吸出全部介质，然后转移到废物容器中。在烧瓶中加入五毫升的平衡盐溶液，轻轻摇动，冲洗掉多余的介质、死细胞或废物。然后从烧瓶中去除整个盐溶液，然后丢弃到废物容器中。接下来，在烧瓶中加入两毫升的三辛，轻轻摇动它，将酶分散在粘附的细胞上。确保粘附表面完全饱和，将组织烧瓶放在培养箱中两到三分钟。之后，轻轻敲拍烧瓶的侧面三到五次，以帮助促进细胞分离。用70%酒精擦拭烧瓶，并放在生物安全柜中。在组织烧瓶中加入五毫升的库存介质，以阻止酶基底反应。从烧瓶中吸出整个液体体积，并转移到无菌的15毫升锥形管中。在200倍g和25摄氏度下离心5分钟。然后使用70%酒精擦拭含有颗粒细胞的管子，并放在生物安全柜内。移出介质，留下约250微升的液体与细胞颗粒。将锥形管底部穿过微离心管机架的小瓶槽，以产生快速振动并干扰和重新暂停电池颗粒。正确完成后，新的细胞溶液将显示为无剩余颗粒的多云混合物。向细胞再增中添加两毫升介质。在管子的一侧轻轻上下移液细胞20次，以分解任何团块。并记录总细胞悬浮量。接下来，使用无菌移液器将20微升的 trypan 蓝色股票添加到96井板的空井中。使用无菌移液器尖端，将 20 微升细胞存量从 15 毫升管转移到含有 trypan 蓝色溶液的井中。移液器轻轻混合内容物，并在表皮滑移和血细胞计上的计数室之间转移 10 微升混合物。仅计算中心单元格和四个角方块，分别计算五个已标识正方形的总单元格计数和不可行的单元格计数。计算可行细胞计数后，在 12 井板的底部标记一条水平线，作为成像期间的参考标记。用介质稀释细胞存量，密度为每毫升19，000个细胞。然后用一毫升稀释的细胞储存播种12孔板的每个孔，定期混合细胞储存，以确保所有12口井的细胞均匀播种。使用此处显示的信息标记每个板。在37摄氏度和5%的二氧化碳下放在孵化器中，直到细胞生长到100%汇合。从培养箱中取回一个12井的细胞。使用具有 10 倍目标的显微镜，观察细胞并确定每个井内的汇合。接下来，从每一个井中吸气并处理生长介质。组装一个P200管道机与1-200微升无菌尖端。在每口井中，将移液器尖端从 12：00 位置滑过细胞表面，以产生划痕模拟伤口。用一毫升的平衡盐溶液冲洗每口井，清除多余的碎屑和细胞团块。将板从一侧摇到另一侧，以方便清洗。然后从每一个井中去除并处理平衡的盐溶液。使用带1000微升尖端的P1000移管器，将1000微升的砷储存添加到与治疗组随机分配的井中。对每一个井使用新的移液器尖端，并记录添加治疗的时间。用5%的二氧化碳在37摄氏度下孵育板。要对板进行成像，请每孔在 24 小时内以 10 倍的客观放大率拍摄一次图像。参考以前在板底绘制的线，在每个时间点上沿每个井内的划痕成像相同的位置。在这项研究中，一种体内划痕测试用于观察砷对细胞迁移的影响。所有治疗组均观察到均匀的划痕，平均划痕宽度约为 0.8 毫米。控制细胞在20小时后显示完全愈合的划痕。两个砷组没有显示这种水平的愈合。10微摩尔治疗抑制关闭完全24小时。这些结果表明，砷的存在减缓了细胞迁移。使用自动软件分析检测过程中捕获的原始图像，以测量伤口宽度，然后计算百分比闭合，最后计算曲线下的面积。10微摩尔治疗组显示，与所有其他治疗组相比，人类新生儿皮肤纤维细胞的细胞迁移在统计上减缓。彻底练习此技术以提高抓伤细胞的一致性非常重要。检测之间的无意变异性可能会扭曲数据并改变结论。进一步的分子技术，如定量聚合酶链反应和酶链接免疫吸附剂测定，可以采用刮伤后测定，以确定信使信号和蛋白质，这些信号和蛋白质可能是测定中观察到的细胞迁移变化的目标。这一分析有助于研究人员理解癌症转移、新兴的癌症疗法、干细胞和再生医学，以及许多其他科学里程碑。

Research

JoVE Journal

Environment

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