Name: in vitro scratch assay to demonstrate effects of arsenic on skin cell migration
Uploaded: 2019-02-23T13:00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration at JoVE.com

Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af National Institute on mindretal sundhed og sundhed forskelle af National Institutes of Health under Award nummer U54MD012388. Indholdet er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af National Institutes of Health.

<ol>
	<li>Diegelmann, R., Evans, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing:+an+overview+of+acute,+fibrotic+and+delayed+healing.">Wound healing: an overview of acute, fibrotic and delayed healing.</a> Frontiers in BioScience. 9, 283-289 (2004).</li><li>Braiman-Wiksman, L., Solomonik, I., Spira, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+into+wound+healing+sequence+of+events.">Novel insights into wound healing sequence of events.</a> Toxicologic Pathology. 35, 767-779 (2007).</li><li>Michelson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Platelets. , (2013).</li><li>Aikawa, M., Schoenbechler, M. J., Barbaro, J. F., Sadun, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+rabbit+platelets+and+leukocytes+in+the+release+of+histamine.+Electron+microscopic+observations.">Interaction of rabbit platelets and leukocytes in the release of histamine. Electron microscopic observations.</a> American Journal of Pathology. 63 (1), 85-98 (1971).</li><li>Liang, C., Park, A., Guan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+scratch+assay:+A+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro.">In vitro scratch assay: A convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nature Protocols. , 329-333 (2007).</li><li>Pinto, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bench-top+in+vitro+wound+assay+to+evaluate+wound+closure.+Applied.">A bench-top in vitro wound assay to evaluate wound closure. Applied.</a> In Vitro Toxicology. 2 (3), 151-156 (2016).</li><li>Pinto, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+mitigates+the+negative+effects+of+arsenic+contamination+in+an+in+vitro+wound+model.">Estrogen mitigates the negative effects of arsenic contamination in an in vitro wound model.</a> Applied In Vitro Toxicology. 4 (1), 24-29 (2018).</li><li>Roubelakis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-rich+plasma+(PRP)+promotes+fetal+mesenchymal+stem/stromal+cell+migration+and+wound+healing+process.">Platelet-rich plasma (PRP) promotes fetal mesenchymal stem/stromal cell migration and wound healing process.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 417-428 (2014).</li><li>Shibata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adiponectin+regulates+cutaneous+wound+healing+by+promoting+keratinocyte+proliferation+and+migration+via+the+ERK+signaling+pathway.">Adiponectin regulates cutaneous wound healing by promoting keratinocyte proliferation and migration via the ERK signaling pathway.</a> Journal of Immunology. 189 (6), 3231-3241 (2012).</li><li>Mendonca, R. J., Coutinho-Netto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+aspects+of+wound+healing.">Cellular aspects of wound healing.</a> Anais Brasileiros de Dermatologia. 84 (3), 257-262 (2009).</li><li>Beem, E., Segal, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+stability+and+sensitivity+of+cell+fluorescent+labels+when+used+for+cell+migration.">Evaluation of stability and sensitivity of cell fluorescent labels when used for cell migration.</a> Journal of Fluorescence. 23 (5), 975-987 (2013).</li><li>Gentry, P. R., Clewell, H. J., Greene, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+recent+advances+in+research+on+arsenic+cancer+risk+assessment.">The impact of recent advances in research on arsenic cancer risk assessment.</a> Regulatory Toxicology and Pharmacology. 69, 91-104 (2014).</li><li>Beamer, P. I., Klimecki, W. T., Loh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+children's+urinary+CC16+levels+with+arsenic+concentrations+in+multiple+environmental+media.">Association of children's urinary CC16 levels with arsenic concentrations in multiple environmental media.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health.pii: E521.2016:13. , (2016).</li><li>Robertson, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arsenic+in+ground-water+under+oxidizing+conditions,+southwest+United+States.">Arsenic in ground-water under oxidizing conditions, southwest United States.</a> Environmental Geochemistry and Health. 11, 3-4 (1989).</li><li>Foust, R. D., Mohapatra, P., Compton-O'Brian, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Groundwater+arsenic+in+the+Verde+Valley+in+central+Arizona,+USA.">Groundwater arsenic in the Verde Valley in central Arizona, USA.</a> Applied Geochemistry. 19, 251-255 (2004).</li><li>Uhlman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Arsenic in Arizona Ground Water: Source and Transport Characteristics. , (2008).</li><li>Agusa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+exposure+to+arsenic+from+drinking+water+in+Vietnam.">Human exposure to arsenic from drinking water in Vietnam.</a> Science of the Total Environment. , (2014).</li><li>Ayotte, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+temporal+variability+of+arsenic+in+groundwater+used+for+drinking+water+supply+in+the+United+States.">Factors affecting temporal variability of arsenic in groundwater used for drinking water supply in the United States.</a> Science of the Total Environment. , (2014).</li><li>Dummer, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geostatistical+modeling+of+arsenic+in+drinking+water+wells+and+related+toenail+arsenic+concentrations+across+Nova+Scotia,+Canada.">Geostatistical modeling of arsenic in drinking water wells and related toenail arsenic concentrations across Nova Scotia, Canada.</a> Science of the Total Environment. , (2014).</li><li>Sorg, T. J., Chen, A. S., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arsenic+species+in+drinking+water+wells+in+the+USA+with+high+arsenic+concentrations.">Arsenic species in drinking water wells in the USA with high arsenic concentrations.</a> Water Research. 48, 156-169 (2014).</li><li>Beamer, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+Children's+Urinary+CC16+Levels+with+Arsenic+Concentrations+in+Multiple+Environmental+Media.">Association of Children's Urinary CC16 Levels with Arsenic Concentrations in Multiple Environmental Media.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health. 13, (2016).</li><li>Pomari, E., Dalla Valle, L., Pertile, P., Colombo, L., Thornton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracrine+sex+steroid+synthesis+and+signaling+in+human+epidermal+keratinocytes+and+dermal+fibroblasts.">Intracrine sex steroid synthesis and signaling in human epidermal keratinocytes and dermal fibroblasts.</a> The FASEB Journal. 29 (2), 508-524 (2015).</li><li>Gotsulyak, Y., Kosach, R., Cherednyk, V., Tykhonkova, O., Khoruzhenka, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+cell+motility+evaluation+in+scratch+assay.">Optimization of cell motility evaluation in scratch assay.</a> Biopolymers and Cell. 30, 223-228 (2014).</li><li>Goetsch, K. P., Niesler, C. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+scratch+assay+for+in+vitro+skeletal+muscle+wound+healing+analysis.">Optimization of the scratch assay for in vitro skeletal muscle wound healing analysis.</a> Analytical Biochemistry. 411, 158-160 (2011).</li><li>Harishkumar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+the+mechanism+of+in+vitro+wound+healing+properties+of+citrus+tamurana+extract.">Revealing the mechanism of in vitro wound healing properties of citrus tamurana extract.</a> BioMed Research International. 13, (2013).</li><li>Johnston, S. T., Simpson, M. J., McElwain, D. L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+much+information+can+be+obtained+from+tracking+the+position+of+the+leading+edge+in+a+scratch+assay?.">How much information can be obtained from tracking the position of the leading edge in a scratch assay?.</a> Journal of the Royal Society Interface. 11, 1-9 (2014).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Anvendelsen af denne analyse giver en høj overførselshastighed og rettidig evaluering af cellulære migration og kan direkte oversættes til komplekse fysiologiske systemer5,6,7. Af denne grund, den foreslåede bænk-top model tunet og praktiseres for at vurdere virkningerne af forskellige terapeutiske agenter og miljømæssige toksiner på sårheling6. Koncentrationerne af arsen bruges i den aktuelle undersøgelse blev anset for miljømæssigt relevante gennem omfattende litteratursøgning af kendte eksponeringsniveauer, og fra retrospektiv gennemgang af forskellige data baser14,15, 16,17,18,19,20,21. Brug af denne in vitro- scratch analyse vist, at eksponering for en arsen koncentration inden for høje, men miljømæssigt relevante udvalg, forsinket sår lukning (cellulære migration).
Denne bænk top model blev også ansat til at isolere og studere en enkelt cellelinje (fibroblast) for yderligere at forstå, hvordan fibroblast migration bidrager til sår healing resultater. Derudover er det svært at studere funktionerne i en enkelt cellelinje i komplekse i vivo systemer med mange andre celler og væv til stede, der kan forstyrre analysen. Analysen omfatter desuden et middel til at nå semi-kvantitative procent sår lukning data, der kan bruges til at målrette specifikke cellulære mekanismer gennem hvilke forbindelser kan påvirke sårheling. For eksempel, celler, der bruges i scratch analysen kan indsamles og opbevares i en ønskede reagens og bruges i genekspression (signal mRNA) eller protein udtryk-undersøgelser,22. Disse oplysninger kan være nyttige til investigator hvis de søger at forstå hvad signaler eller proteiner kan i vid udstrækning bidrage til ændringer i cellulære migration i overværelse af varierende behandlinger (f.eks arsen)22.
Menneskelige neonatal dermal fibroblaster blev udvalgt til dette arbejde er baseret på deres fremtrædende rolle i sårheling. Dog protokollens scratch assay er blevet gennemført ved hjælp af forskellige celletyper og for en række forskningsformål. For eksempel er scratch analysen blevet vedtaget i inden for onkologi for at studere migration hæmning af kemoterapi narkotika23; for skeletmuskulatur celle migration, spredning og diffusion24; at studere effekten af planteekstrakter på cellulære migration25; og forstå hvordan keratinocytter migration og spredning bidrager til sår healing9. Derudover evalueres en tidligere papir af Pinto et al. virkningerne af uran (U) og trombocyttal-rich plasma (PRP) på hDFn migration ved hjælp af scratch assay6. Formålet med dette arbejde var at forstå omfang som dette assay kunne teste effekten af agent menes at langsom cellulære migration (U), såvel som agent menes at fremskynde cellulære migration (PRP). Som det kan ses i den ovennævnte arbejde og forskning af andre efterforskere, anvendelse af scratch analysen har stort potentiale for brug i forskellige eksperimentelle modeller26. Trods den detalje gives inden for metoderne, skal variansen forventes mellem efterforskere og eksperimenter. Cellulære migration priser vil sandsynligvis svinge baseret på cellelinie i brug, ud over de krævede mikronæringsstoffer behov for unikke celletyper. Mange af de vigtige bemærkninger til støtte i celle udbytte og levedygtighed er angivet som noter i hele denne protokol. Det anbefales imidlertid kraftigt, at efterforskere Følg producentens anbefalinger for optimale vækstbetingelser, og at bruge denne metode som supplerende undervisning for generelle celle kultur arbejde.
Selv om scratch analysen er ekstremt alsidige for undersøgelse af cellulære aktivitet; uforudsete bias kan opstå i måleteknikker. For eksempel, når du bruger ImageJ manuelt spore celle migration fronter, kan variation findes blandt brugere, som kan begrænse nøjagtigheden og indsamling af repræsentative data. Det skal også bemærkes, at migration fronter bør læses blinde til behandling at minimere bruger bias. Desuden, manuelt identificering migration fronter kan resultere i fejlberegning af gennemsnitlige afstand på grund af pseudopod dannelse, som celler og deres evne til at nå ud til form fokale sammenvoksninger, som kan være visuelt vildledende. På lignende måde, brug af fluorescerende "celle tracker" farvestoffer på cellens overflade eller nukleare proteiner til at opdage migration kan utilsigtet fastsætte cellerne medførende unøjagtigheder ved måling af cellulære migration over tid. Det anbefales, at passende positive og/eller negative kontroller være indskrevet i eksperimentet at helt æsler effekten af behandling på cellelinjer. Praksis af denne analyse skal være afsluttet i anerkendelse af dens begrænsninger. Denne analyse kan ikke garantere at cellulære migration resultater fra in vitro forsøg direkte vil oversætte til i vivo resultater. Sår healing og cellulære migration i et komplekst levende system indebærer en lang række celletyper og molekylære signaler; hver har potentiale til at påvirke healing svar.
I Resumé, har scratch analysen vist sig for at give høj overførselshastighed screening af cellulære migration i svar til skiftende miljøer6,25. Vi udnyttede specifikt denne protokol for at med held registrerer ændringer i cellulære migration som følge af arsen eksponering på forskellige miljømæssigt relevante doser. Disse data har givet begrundelse for at bruge bunden analysen til yderligere undersøgelse og vurdere den mekanistiske veje af cellulære migration i denne analyse og hvordan disse veje er ændret af arsen eksponering.

Sårheling består af en kompleks serie af overlappende trin, der involverer forskellige celletyper, signaling molekyler og ekstracellulære matrix komponenter1. Sammen, arbejder disse komponenter i fællesskab for at opnå sår opløsning eller reparation, der i sidste ende fører til dannelsen af et beskyttende fibrotisk ar afhængigt af graden af traumer1. For at fange de enkelte processer og funktioner af sår er healing i et eksperiment vanskeligt; enkelte trin inden for sårheling proces skal identificeres og testet separat. Blandt de mange trin i sårheling, processen af cellulære migration har været betragtet som kritisk når de evaluerer helbredende priser2. Cellulære migration kan iagttages i alle faser af sårheling og nødvendiggør yderligere forståelse af, hvordan ændringer i celle migration kan indvirkning sår lukning. For eksempel, er cellulære migration set i både tidlige og sene fase betændelse, med blod koagulation og trombocyttal aggregering på såret site3. Disse begivenheder forhindre overdreven blodtab ved at danne en midlertidig blokering for at fylde såret områder væv3. Blodplader i omløb vil syntetiserer og udskiller vasoaktive mediatorer sammen med kemotaktisk faktorer, som tilsammen signal for inflammatoriske leukocyt migration (hvide blodlegemer) til de sårede væv til reparation4. Re epithelialization opstår inden for timer efter vævsskade og indebærer dækker webstedet sår gennem aktivitet og migration af epitel keratinocytter at forhindre yderligere forurening eller invasion af fremmede partikler til sår site2. Disse eksempler fange kun nogle få af de mange celle migration funktioner forbundet med sårheling.
Scratch analysen er beskrevet og anvendes til bedre at forstå celle migration og sine mange roller i sårheling5,6. Denne analyse anses forsimplede, giver høj overførselshastighed og muliggør investigator at indsamle repræsentative celle migration data. Migration assays har vist at visse forbindelser kan fremskynde eller bremse hastigheden af cellulære migration6. Desuden giver disse assay resultater translationel fysiologisk oplysninger, der kan bruges til at formulere mål behandlinger, dosering koncentrationer og gener af interesse inden i vivo eksperimenter. Analysen kræver grundlæggende celle kultur teknikker og forsyninger, en cellelinje af valg og imaging-teknologi til at fange bevægelse over tid eller bevægelse i svar på behandlinger.
Analysen kan være let manipuleres eller skræddersyet til behovene af investigator. Men der er fire grundlæggende spørgsmål at overveje før eksperimenter. Hvilke generelle eller specifikke spørgsmål (r) er den forsøger at besvare en eller flere delforsøgsledere? Dette gælder for de fleste hypoteser drevet forskning; Det er imidlertid afgørende for denne analyse fordi det vil afgøre mange af parametrene, der skulle præcist og helt besvare spørgsmål (r). Hvad celle linje eller cellelinjer (hvis der findes flere) bør bruges til at repræsentere den fysiologisk system ved at blive undersøgt? For eksempel, i en kutant sår healing undersøgelse, en dermal fibroblast5,6,7, stamcelle8, eller epidermale keratinocytter9 kan anses for at repræsentere cellepopulationer, der normalt findes i overflod i huden væv10. Alternativt, neutrofiler, makrofager eller andre inflammatoriske celler kunne evalueres i dette system til at repræsentere celle migration af andre komponenter af sårheling inden for hud væv10. Desuden, vil at identificere de specifikke cellelinie evalueres bidrage til at identificere, hvilke reagenser er optimal at bruge til at fremme celle metaboliske aktivitet. Hvordan bliver celle migration sporet/afbildet? Der er en række teknikker, der anvendes til at observere celle migration inden for en plade eller kolbe. For eksempel, giver farvning eller fluorescently tagging celler og bruger fluorescens eller Konfokal imaging til at spore celler en stærk kontrast, som giver mulighed for investigator for klart at definere cellulære vs. ikke-cellulære placeringer og cellulær bevægelse11 . En anden almindelig teknik, beskrevet i denne undersøgelse, er anvendelsen af omvendte lysmikroskopi med fase kontrast6,7. Dette alternativ til celle farvestoffer og fluorescens tillader brugeren at leve spor celler uden at uhelbredeligt fix celler før imaging og giver også mulighed for at fange billeder af den samme individuelle brønde indeholdende sårede encellelag af celler på tværs af tiden point. Foranstaltninger, hvad udfaldet vil blive brugt til analyse? Ved hjælp af billeder indsamlet under hele undersøgelsen, data kan fremskaffes ændringer til cellulære migration satser kan forstås. I vores laboratorium, mikroskopiske billeder taget på den inverterede lysmikroskop er uploadet til billede analyse software og procent sår lukning og summerede arealet under kurven (AUC) beregnes.
Vi vil fremhæve den konkrete anvendelse af denne analyse at belyse ændringerne dermal fibroblast migration i et kendt miljø forurenende, arsen. Arsen er et naturligt forekommende halvmetal fundet i jordskorpen. Forskellige steder er blevet fundet med forhøjede niveauer af arsen, der udgør en risiko for personer, der bor i nærheden af disse steder. Som et resultat, har mad og vand kilder vist sig at have øget niveauer af arsen kontaminering, hvilket øger sandsynligheden for enkeltpersoner til at blive udsat for arsen. Miljømæssige arsen eksponering har vist sig at have langsigtede sundhedsmæssige konsekvenser befolkningsgrupper ovenfor eller endda under den nuværende USA Environmental Protection Agency (USEPA) Max forurenende niveau (MCL) 10 ppb (10 µg/L)12, 13. selv om u.s. EPA har sat denne MCL og anses for det sikkert for drikkevand grænser, arsenik koncentrationer, der overskrider denne grænse er ikke ualmindelige i vandkilder på verdensplan. I det sydvestlige USA, har talrige grundvand, godt vand og springs dokumenteret for at indeholde vedrørende niveauer af arsen14. For eksempel, indeholder Montezuma godt i Verde Valley, AZ, 210 µg/L arsen15. Grundvand omkring floden Verde, AZ indeholder 16 µg/L af arsen i gennemsnit med peak værdier at nå 1,3 mg/L15,16. Navnlig overstiger arsenik koncentrationer i mange brønde i Verde floden vand skur 50 µg/L15,16. Med denne viden, miljømæssigt relevante arsen koncentrationer blev udvalgt der spænder fra under MCL på 0,1 µM (7,5 ppb), at ovennævnte MCL på 10 µM (750 ppb) i aktuelt undersøgelse14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 .
De oplysninger, der indsamles fra disse eksperimenter vil blive brugt som en tidlig indikator for potentielle ændringer af cellulære migration priser i en i vivo sår forurenet med arsen. Bagefter, signalering molekyler kan vælges baseret på deres rolle for fremme af sårheling og cellulære migration, og fremtidige kvantitative polymerase kæde reaktion (qPCR) baseret gen expression eksperimenter kan oprettes efter afslutningen af aktuelt undersøgelser. Hvis migration satser i denne analyse ændrer i overværelse af arsen, specifikt gen mål involveret i cellulære migration kan være mål for skadelige virkninger af arsen, og kan således være mekanismen af forstyrrelser.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Class II A/B3 Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td>15201-816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile Gloves</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>55082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Precision</td>
			<td>Model 182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Q080318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPR Centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>349702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Scale</td>
			<td>Ohaus</td>
			<td>I093 1125062111P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighting paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>H351125781212A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biohazard bags</td>
			<td>Fisherbran</td>
			<td>01-830A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Jacketed CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>309739-31053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10566-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Pipettor</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>140685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p200 Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p20 Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denominator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D59707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 tissue flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430725U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tube</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-539-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Marker</td>
			<td>Securline</td>
			<td>92167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wipes</td>
			<td>Kintech</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>63-67-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Filter Pipet Tips</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>16160210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Great Value</td>
			<td>220-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovial Rack</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>5030-0505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Gizmo Supply</td>
			<td>B00SCOGY56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube Rack</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waste Beaker</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Edge Ruler</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human neonatal dermal fibroblasts (hDFn)</td>
			<td>lot: 1734, 2902</td>
			<td>106-05n</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rstudio Statistical Software</td>
			<td></td>
			<td>ver: 3.5.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>NIH</td>
			<td>ver: 1.8.0_112</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro scratch assay to demonstrate effects of arsenic on skin cell migration

Forstå de fysiologiske mekanismer for sårheling har været genstand for igangværende forskning i mange år. Denne forskning direkte giver sig udslag i ændringer i kliniske standarder bruges til behandling af sår og mindske sygelighed og dødelighed for patienter. Sårheling er en kompleks proces, der kræver strategisk celle og væv interaktion og funktion. En af de mange kritisk vigtige funktioner i sårheling er individuelle og kollektive cellulære migration. Efter skade migrere forskellige celler fra blodet, omgivende bindevæv og epitel væv hurtigt til webstedet sår ved hjælp af kemiske og/eller fysiske stimuli. Denne migration reaktion kan i vid udstrækning diktere resultater og succes af en helbredende såret. Forstå dette bestemt cellefunktion er vigtigt for Translationel medicin, der kan føre til forbedret sårheling resultater. Her, beskriver vi en protokol, der bruges til bedre at forstå cellulære migration, som den vedrører sårheling, og hvordan ændringer i det cellulære miljø i væsentlig grad kan ændre denne proces. I dette eksempel undersøgelse, blev dermal fibroblaster dyrket i medierne suppleret med føtal bovint serum (FBS) som éncellelag kulturer i vævskultur flasker. Celler var aseptisk overføres til vævskultur behandlet 12-godt plader og vokset til 100% sammenløb. Ved ankomsten til sammenløbet, blev cellerne i éncellelag lodret ridset, ved hjælp af en p200 afpipetteres tip. Arsen fortyndet i kultur medier suppleret med FBS blev føjet til individuelle brønde på miljømæssigt relevante doser spænder 0,1-10 M. billeder blev taget til fange hver 4 timer (h) over en 24-timers periode ved hjælp af en omvendt lysmikroskop at observere cellulære migration (sår lukning). Billeder var individuelt analyseret ved hjælp af billede analyse software, og procent sår lukning blev beregnet. Resultaterne viser, at arsen bremser sårheling. Denne teknik giver en hurtig og billig første skærmbillede for evaluering af virkningerne af forurenende stoffer på sårheling.

Stikprøvestørrelserne (n) for alle behandlingsgrupper blev n = 28. Celler var med held kulturperler følgende aseptisk teknik og lab protokoller (figur 1). Ensartet ridser blev observeret på tværs af alle behandlingsgrupper med den gennemsnitlige scratch bredde måling 0,8 mm 0,4 mm (figur 2). Kontrolgruppen havde en gennemsnitlig summeres arealet under kurven værdien af 1,355.83; 0,01 µM som behandlingsgrupper havde en gennemsnitlig opsummerede arealet under kurven værdien af 1,366.21; 0,1 µM som behandlingsgrupper havde en gennemsnitlig opsummerede arealet under kurven værdien af 1,326.24, 1,0 µM som behandling gruppe havde gennemsnitligt opsummerede arealet under kurven værdien af 1,295.10; og endelig den 10 µM som behandling gruppe havde en gennemsnitlig summeres arealet under kurven værdien af 535.12, som var statistisk lavere sammenlignet med alle andre grupper (p < 0,05) (figur 3). R-program for statistisk analyse blev brugt til at køre en en-vejs ANOVA med en Tukey post hoc justering til at bestemme statistiske forskelle blandt behandlingsgrupper (p < 0,05).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58838/58838fig2.jpg"> Figur 2: repræsentative bunden assay billeder over en periode på 20 h. Billeder A-D repræsenterer cellulære migration af kontrol celler; billeder E-H repræsenterer cellulære migration af celler forurenet med 1,0 µM som; billeder I-L repræsenterer cellulære migration af celler forurenet med 10 µM som. Fra disse billeder er det klart at cellulære migration er bremset i overværelse af arsen. Kontrol billeder viser en helt "helbredt" bunden efter 20 timer, mens de andre to som behandling grupper ikke var "helbredt". De 10 µM som behandling hæmmet fuldstændig lukning helt efter 24 h. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58838/58838fig2large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58838/58838fig3.jpg"> Figur 3: arsen bremser cellulære migration i scratch analysen. Billeder blev taget til fange i en 24-timers periode at observere ændringer i cellulære migration satser i overværelse af varierende koncentrationer af arsen. RAW billeder blev analyseret ved hjælp af en automatiseret software (f.eks.i MATLAB), som i første omgang målt sår bredde, derefter beregnet procent lukning og endelig arealet under kurven (AUC). Fejllinjer udgør standard fejl af middelværdien. De 10 µM som behandling gruppe statistisk bremset cellulære migration af human dermal fibroblaster neonatal (hDFn), vist ved en statistisk lavere AUC værdi, i forhold til alle andre behandlingsgrupper ved hjælp af en en-vejs ANOVA med en Tukey post hoc justering (p < 0,05). Statistiske forskelle repræsenteres af bogstaverne "A" og "B", som blev opnået gennem brug af metoden kompakt brev Display tilgængelige i R-program. Behandlinger, der ikke deler en fælles brev er statistisk signifikant fra hinanden (p < 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58838/58838fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration at JoVE.com

In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration

In Vitro Skrab Assay for at demonstrere virkningerne af arsen på huden celle Migration

Denne undersøgelse fokuserer på en in vitro- model af sår healing (scratch assay) som en mekanisme til at bestemme hvordan miljøforurenende såsom arsenik indflydelse cellulære migration. Resultaterne viser, at denne in vitro assay giver hurtige og tidlige indikationer af ændringer til cellulære migration inden i vivo eksperimenter.

Understanding the physiologic mechanisms of wound healing has been the focus of ongoing research for many years. This research directly translates into ...

Cellulære migration er en kritisk sårheling proces, der kan drastisk ændre resultatet af en helbredende sår. Denne protokol giver forskerne mulighed for bedre at forstå effekten af forskellige forbindelser på cellulære migration under sårheling. Hvilket ofte kan gange føre til målrettede behandlingsstrategier for klinisk medicin.Den ridse assay er en omkostningseffektiv og høj-throughput tilgang til at generere meningsfulde sårheling data forud for dyre og tidskrævende in vivo test. Den ridse assay som en metode er særlig relevant i sårheling applikationer. Mest specifikt, huden.Men analysen er virkelig en migration assay, og kunne anvendes på enhver celletype, hvor migration af celler er af interesse at måle eller fange. Svarende til klassisk celle og væv kultur, standard driftsprocedurer, uddannelse, teknik, og praksis, praksis, praksis. Disse er nøglen til succes med bunden assay.Demonstrere proceduren vil være Nathan Cruz, en kandidatstuderende, og Oscar Lujan, en bachelor forsker. For at starte denne procedure, forberede biosikkerhed II kabinet ved hjælp af en 70% isopropy vandig løsning til at udføre en sanitet tørre, der begynder på bagsiden og sidevægge, og arbejder ned til bundpladen. Også tørre alle materialer, der vil blive brugt i analysen, før du placerer dem i kabinettet.Dernæst opnå hætteglas, der indeholder den ønskede kryoreserveret cellelinje, og læg den i et encentrisk dybt vandbad ved 37 grader Celsius for at tø op. Der tilsættes 10 milliliter medium suppleret med 10% FBS i en T75 vævskulturkolbe. Åbn hætteglasset med cellelageret, og fremsugning forsigtigt opløsningen.Cellerne overføres derefter til T75-kolben. Fjern en milliliter medier fra kolben, og overfør det tilbage til hætteglasset, og overfør det derefter tilbage til kolben for at maksimere celleudbyttet fra hætteglasset. Stram kolbens hætte og sten den forsigtigt for at sprede cellerne ensartet i suspensionen over hele overfladen.Derefter skal du mærke kolben med de oplysninger, der vises her, og anbringe den i en befugtet inkubator ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i 72 timer. Først skal du hente vævskulturkolben fra kuvøsen og observere de klæbede celler som beskrevet i tekstprotokollen. Aspirere hele mediemængden fra kolben og overfør det til en affaldsbeholder.Tilsæt fem milliliter afbalanceret saltopløsning til kolben, og sten den forsigtigt for at skylle overskydende medier, døde celler eller affaldsprodukt. Fjern derefter hele mængden af saltopløsning fra kolben og kassér den i en affaldsbeholder. Dernæst tilsættes to milliliter trypsin til kolben, og forsigtigt sten det for at sprede enzymet over de klæbede celler.Sørg for, at den klæbende overflade er helt mættet, og læg vævskolben i inkubatoren i to til tre minutter. Efter dette, let banke på siden af kolben tre til fem gange for at lette celle udstationering. Kolben aftørres med 70 % alkohol, og den anbringes i biosikkerhedsskabet.Der tilsættes fem milliliter aktiemedier til vævskolben for at stoppe enzymsubstratreaktionen. Inspirer hele mængden af væske fra kolben, og overfør den til et sterilt konisk rør på 15 milliliter. Centrifuge ved 200 gange g og ved 25 grader Celsius i fem minutter.Brug derefter 70% alkohol til at tørre røret, der indeholder de pelleterede celler, og placere det inde i biosikkerhed kabinet. Pipette fra medierne, efterlader ca. 250 mikroliter af væske med cellepellet. Kør bunden af det koniske rør på tværs af hætteglassedene på en mikrocentrifuge rørholder for at skabe en hurtig vibration og forstyrre og resuspendere cellepellet.Når den nye celleopløsning er færdig, vises den som en uklar blanding uden resterende pellet. Føj to milliliter medier til cellens genoplivning. Pipette cellerne forsigtigt op og ned på siden af røret 20 gange for at bryde op eventuelle klumper.Og registrere den samlede celle suspension volumen. Dernæst skal du bruge en steril pipette til at tilføje 20 mikroliter af trypan blå lager til en tom brønd af en 96-brønd plade. Ved hjælp af en steril pipettespids overføres 20 mikroliter af cellelager fra 15-milliliterrøret til brønden, der indeholder trypanblå opløsning.Pipette forsigtigt at blande indholdet og overføre 10 mikroliter af blandingen mellem dækslet slip og tællekammeret på et hæmocytometer. Tæl kun cellerne i midten og fire hjørne firkanter, separat tælle både det samlede celletal og ikke-levedygtige celletal for de fem identificerede firkanter. Når du har beregnet det levedygtige celletal, skal du markere en vandret linje hen over bunden af en 12-brøndplade for at fungere som referencemærke under billeddannelse.Cellelageret fortyndes med medier til en massetæthed på 19.000 celler pr. milliliter. Derefter frø hver brønd af 12-brønd plade med en milliliter af den fortyndede celle bestand, blande cellemassen med jævne mellemrum for at sikre jævn cellesåning på tværs af alle 12 brønde. Mærl hver plade med de oplysninger, der vises her.Og læg den i en kuvøse ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid, indtil cellerne vokser til 100% sammenløb. Hent en 12-brønd plade med celler fra kuvøsen. Ved hjælp af et mikroskop med en 10x mål, observere cellerne og bestemme sammenløbet i hver brønd.Dernæst aspirere og bortskaffe vækstmedierne fra hver brønd. Saml en P200 pipetter med en 1-200 mikroliter steril spids. I hver brønd glider pipettespidsen hen over celleoverfladen fra 12:00-placeringen til 6:00-lokationen for at frembringe et ridsende sår.Skyl hver brønd med en milliliter afbalanceret saltopløsning for at fjerne overskydende snavs og celleklumper. Rock pladen fra side til side for at lette vask. Fjern og bortskaf derefter den afbalancerede saltopløsning fra hver brønd.Ved hjælp af en P1000 pipetter med en 1, 000-microliter spids, tilsæt 1.000 mikroliter fra de forberedte arsen bestande i brønde, der er blevet tilfældigt tildelt med en behandlingsgruppe. Brug en ny pipettespids til hver brønd, og optag det tidspunkt, hvor behandlingerne tilføjes. Inkuber pladerne ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid.For at afbilde pladerne skal du tage billeder af hver brønd ved 10x objektiv forstørrelse hver fjerde time over en 24-timers periode. Hental den linje, der tidligere er tegnet i bunden af pladen, for at afbilde den samme placering langs bunden i hver brønd på hvert tidspunkt. I denne undersøgelse, en in vivo scratch test analyse bruges til at observere virkningerne af arsen på celle migration.Ensartede ridser observeres på tværs af alle behandlingsgrupper med en gennemsnitlig ridsebredde på ca. 0,8 millimeter. Kontrolcellerne viser en helt helet bunden efter 20 timer. De to arseniske grupper viser ikke dette niveau af healing.Med 10-mikromolar behandling hæmme lukning helt i 24 timer. Disse resultater viser, at tilstedeværelsen af arsen bremser cellulære migration. De rå billeder taget under analysen analyseres ved hjælp af automatiseret software til at måle sårbredden, derefter beregne procent lukning, og endelig beregne området under kurven.Den 10-mikromolære behandlingsgruppe viser statistisk bremset cellulære migration af humane neonatal dermal fibroblaster i forhold til alle andre behandlingsgrupper. Det er vigtigt at grundigt praksis denne teknik til at øge konsistensen, når skrabe cellerne. Utilsigtet variation mellem analyser kan potentielt skæve data og ændre konklusioner.Yderligere molekylære teknikker såsom kvantitativ polymerase kædereaktion og enzym-forbundet immunosorbent assays kan anvendes post-scratch assay at identificere messenger signaler og proteiner, der kan være målet for ændringer i celle migration observeret i analysen. Denne analyse har bidraget til forskernes forståelse af kræftmetastase, nye kræftbehandlinger, stamceller og regenerativ medicin og mange andre videnskabelige milepæle.

Research

JoVE Journal

Environment

In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration

Exploring the Effects of Atmospheric Forcings on Evaporation: Experimental Integration of the Atmospheric Boundary Layer and Shallow Subsurface

Udforskning virkningerne af Atmosfæriske Drivkræfter på Fordampning: Eksperimentel Integration af det atmosfæriske grænselag og Shallow Subsurface

Evaporation is directly influenced by the interactions between the atmosphere, land surface and soil subsurface. This work aims to experimentally study ...

A CO2 Concentration Gradient Facility for Testing CO2 Enrichment and Soil Effects on Grassland Ecosystem Function

A CO2 Concentration Gradient Facility for Testing CO2 Enrichment and Soil Effects on Grassland Ecosystem Function

En CO<sub&gt; 2</sub&gt; Koncentrationsgradient faciliteten for Testing CO<sub&gt; 2</sub&gt; Berigelse og Jord Virkninger på Grassland Ecosystem Funktion

Continuing increases in atmospheric carbon dioxide concentrations (CA) mandate techniques for examining impacts on terrestrial ecosystems. Most ...

A Flow-through Exposure System for Evaluating Suspended Sediments Effects on Aquatic Life

En Flow-through Exposure system til evaluering suspenderet sediment Virkninger på vandlevende

This paper describes the Fish Larvae and Egg Exposure System (FLEES). The flow-through exposure system is used to investigate the effects of suspended ...

Determination of Inorganic Arsenic in a Wide Range of Food Matrices using Hydride Generation - Atomic Absorption Spectrometry.

Bestemmelse af uorganisk arsen i en bred vifte mad matricer ved hjælp af hydrid Generation - atomabsorptionsspektrometri.

The European Food Safety Authority (EFSA) underlined in its Scientific Opinion on Arsenic in Food that in order to support a sound exposure assessment to ...

Protocol for Assessing the Relative Effects of Environment and Genetics on Antler and Body Growth for a Long-lived Cervid

Protokol for at vurdere de Relative virkninger af miljø og Genetik på gevir og krop vækst for en langlivede Cervid

Cervid phenotype can be placed into one of two categories: efficiency, which promotes survival over extravagant morphometric growth, and luxury, which ...

Preparation of DMMTAV and DMDTAV Using DMAV for Environmental Applications: Synthesis, Purification, and Confirmation

Preparation of DMMTAV and DMDTAV Using DMAV for Environmental Applications: Synthesis, Purification, and Confirmation

Forberedelse af DMMTAV og DMDTAV bruger DMAV for miljømæssige programmer: syntese, rensning og bekræftelse

Dimethylated thioarsenicals such as dimethylmonothioarsinic acid (DMMTAV) and dimethyldithioarsinic acid (DMDTAV), which are produced by the metabolic ...

Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA

Kollektion og udvinding af erhvervsmæssig Luftprøver til analyse af svampe DNA

Traditional methods of identifying fungal exposures in occupational environments, such as culture and microscopy-based approaches, have several ...

An Experimental Protocol for Studying Mineral Effects on Organic Hydrothermal Transformations

En forsøgsplan for at studere Mineral effekter på økologisk hydrotermiske transformationer

Organic-mineral interactions are widely occurring in hydrothermal environments, such as hot springs, geysers on land, and the hydrothermal vents in the ...

Composition and Distribution Analysis of Bioaerosols Under Different Environmental Conditions

Sammensætning og Distribution analyse af Bioaerosols Under forskellige miljøforhold

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, ...

Removal of Arsenic Using a Cationic Polymer Gel Impregnated with Iron Hydroxide

Fjernelse af arsen ved hjælp af en kationisk polymer gel imprægneret med jern hydroxid

In this work, we prepared an adsorbent composed of a cationic polymer gel containing iron hydroxide in its structure designed to adsorb arsenic from ...