Name: in vitro scratch assay to demonstrate effects of arsenic on skin cell migration
Uploaded: 2019-02-23T13:00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration at JoVE.com

Recherche rapporté dans cette publication a été financée par l’Institut National sur la santé de minorité et les disparités de santé de la National Institutes of Health, sous attribution numéro U54MD012388. Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement l’opinion officielle de la National Institutes of Health.

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Application de ce test fournit une évaluation de haut débit et en temps opportun de la migration cellulaire et peut traduire directement à des systèmes physiologiques complexes5,6,7. Pour cette raison, le modèle de paillasse proposé a été à l’écoute et pratiqué pour évaluer les effets de divers agents thérapeutiques et les toxines environnementales sur6de cicatrisation. Les concentrations d’arsenic utilisé dans la présente étude sont jugées pertinentes pour l’environnement par le biais de recherche documentaire approfondie des niveaux d’exposition connus et d’une étude rétrospective des différentes données bases14,15, 16,17,18,19,20,21. Utilisation de ce dosage zéro in vitro ont démontré que l’exposition à une concentration d’arsenic dans le haut, mais pertinente de l’environnement, retard de fermeture de la plaie (migration cellulaire).
Ce modèle de dessus de banc était également employé pour isoler et étudier une lignée de cellules individuelles (fibroblastes) pour mieux comprendre comment la migration des fibroblastes contribue pour blesser les résultats de guérison. En outre, il est difficile d’étudier les fonctions d’une lignée de cellules individuelles dans des systèmes complexes in vivo avec beaucoup d’autres cellules et tissus présents qui peuvent interférer avec l’analyse. En outre, l’analyse fournit un moyen d’atteindre les données de fermeture de plaie pourcentage semi-quantitative qui peuvent être utilisées pour cibler les mécanismes cellulaires spécifiques par lesquels composés peuvent influer sur la cicatrisation des plaies. Par exemple, les cellules utilisées dans l’essai de gratter soient collectées et stockées dans un réactif désiré et utilisés dans l’expression des gènes (ADN messagère de signal) ou expression de la protéine dosages22. Cette information peut être utile à l’enquêteur s’ils cherchent à comprendre ce que des signaux ou des protéines peuvent largement contribuer à l’évolution de la migration cellulaire en présence de divers traitements (c.-à-d. l’arsenic)22.
Les fibroblastes humains par voie cutanée néonatales ont été sélectionnés pour ce travail basé sur leur rôle de premier plan dans la cicatrisation des plaies. Toutefois, ce protocole de dosage zéro a été implémenté à l’aide de divers types de cellules et pour une gamme des fins de recherche. Par exemple, le dosage zéro a été adopté dans le domaine de l’oncologie pour étudier l’inhibition de la migration des médicaments de chimiothérapie23; pour la migration des cellules musculaires squelettiques, la prolifération et la diffusion24; pour étudier l’effet des extraits de plantes sur la migration cellulaire25; et de comprendre comment la prolifération et la migration des kératinocytes contribuent pour blesser la guérison9. En outre, un précédent document de Pinto et coll. a évalué les effets de l’uranium (U) et le plasma riche en plaquettes (PRP) sur hDFn migration en utilisant le dosage zéro6. Le but de ce travail était de comprendre l’étendue à laquelle ce test pourrait tester l’effet d’un agent censé ralentir la migration cellulaire (U), mais aussi un agent censé accélérer la migration cellulaire (PRP). Comme on le voit dans les travaux susmentionné et recherche par d’autres chercheurs, application du dosage zéro a un potentiel élevé pour une utilisation dans différents modèles expérimentaux26. Malgré les détails fournis dans les méthodes, variance devrait avoir entre les enquêteurs et les expériences. Par exemple, les taux de migration cellulaire fluctuera probablement basée sur la lignée cellulaire utilisée, outre les micronutriments nécessaires requises pour les types de cellule unique. Plusieurs observations importantes pour aider à la viabilité et le rendement de la cellule sont répertoriés comme des NOTEs tout au long de ce protocole. Toutefois, il est fortement recommandé que les enquêteurs suivent des recommandations du fabricant pour les conditions optimales de croissance et d’utiliser cette méthode comme instruction supplémentaire pour les travaux de culture cellulaire générale.
Bien que le dosage zéro est extrêmement versatile pour l’étude de l’activité cellulaire ; préjugés imprévues peuvent survenir dans les techniques de mesure. Par exemple, lorsque vous utilisez ImageJ pour tracer manuellement des fronts de migration cellulaire, variation pouvant exister entre les utilisateurs, ce qui peuvent limiter l’exactitude et la collecte de données représentatives. Il convient également de noter que les fronts de migration doivent être lues en aveugle au traitement pour minimiser les biais de l’utilisateur. En outre, identifier manuellement les fronts de migration peut entraîner une erreur de calcul de la distance moyenne parcourue en raison de la formation de pseudopodes de cellules et de leur capacité à atteindre les adhérences focales forme, qui peuvent être trompeurs visuellement. De la même manière, l’utilisation de fluorescent « traqueur de la cellule » colorants sur la surface des cellules, ou le protéines nucléaires pour détecter la migration peuvent fixer involontairement cellules ce qui entraîne quelques imprécisions lors de la mesure de la migration cellulaire au fil du temps. Il est recommandé que des contrôles appropriés positifs et/ou négatifs inscrits au sein de l’expérience pour évaluer complètement l’effet du traitement sur les lignées cellulaires. Pratique de ce test doit être rempli en reconnaissance de ses limites. Ce test ne garantit pas que les résultats de la migration cellulaire de l’expérimentation in vitro seront traduira directement des résultats in vivo . Plaie des migrations cellulaires et guérison dans un système vivant complexe implique une multitude de types de cellules et les signaux moléculaires ; chacun d'entre eux a la possibilité d’influencer les réponses de guérison.
En résumé, le scratch test s’est avéré fournissent criblage à haut débit de migration cellulaire en réponse à l’évolution des environnements6,25. Plus précisément, nous avons utilisé ce protocole pour détecter avec succès les changements dans la migration cellulaire suite à l’exposition à l’arsenic à diverses doses écologiquement pertinents. Ces données ont fourni de justification pour utiliser le dosage zéro pour une étude plus et d’évaluer les voies mécanistes de la migration cellulaire dans ce test et comment ces voies sont altérées par l’exposition à l’arsenic.

La cicatrisation se compose d’une série complexe de chevauchement des étapes qui implique différents types de cellules, molécules de signalisation et de composants de la matrice extracellulaire1. Ensemble, ces composants fonctionnent de concert pour atteindre la résolution de plaie ou de réparation, ce qui conduit finalement à la formation d’une cicatrice fibreuse protection selon le degré de traumatisme1. Pour capturer les processus individuels et les fonctions de plaie dans une expérience de guérison est difficile ; différentes étapes dans la processus de cicatrisation doivent être identifiés et testés séparément. Parmi les nombreuses étapes de la cicatrisation des plaies, le processus de migration cellulaire a été jugé critique lors de l’évaluation de guérison taux2. Migration cellulaire peut être observée dans toutes les phases de la cicatrisation des plaies et donc nécessite davantage de comprendre comment des altérations de la migration cellulaire peuvent avoir des répercussions refermer les plaies. Par exemple, la migration cellulaire est vu dans les deux inflammation de début et de fin de phase, avec agrégation de coagulation et des plaquettes de sang à la plaie site3. Ces événements prévenir la perte excessive de sang en formant un blocage temporaire pour combler les blessés des zones dépourvues de tissus3. Plaquettes en circulation vont synthétiser et sécréter des médiateurs vasoactifs ainsi que de facteurs chimiotactiques, quel signal ensemble pour la migration des leucocytes inflammatoires (globules blancs) dans les tissus blessés pour réparer4. Réépithélialisation survient dans les heures suivant la lésion tissulaire et implique couvrant la plaie par l’activité et la migration des kératinocytes épithéliales pour prévenir toute nouvelle contamination ou invasion de particules étrangères à la plaie site2. Ces exemples de capturer seulement quelques-uns de la migration cellulaire nombreuses fonctions associées à la guérison des plaies.
Le dosage zéro a été décrit et utilisé pour mieux comprendre la migration cellulaire et ses nombreux rôles dans la cicatrisation des5,6. Cet essai est considéré comme simpliste, offre haut-débit et permet à l’enquêteur recueillir des données de migration des cellules représentant. Les essais de migration ont réussi à démontrer que certains composés peuvent accélérer ou ralentir le rythme de migration cellulaire6. En outre, ces résultats d’analyses renseignent translationnelle physiologique qui peut être utilisé pour formuler des traitements de cible, dosage des concentrations et des gènes d’intérêt avant in vivo de l’expérimentation. Le test requiert des techniques de culture de cellule de base et de fournitures, d’une lignée cellulaire de choix et une technologie d’imagerie pour capturer le mouvement avec le temps ou le mouvement en réponse aux traitements.
Le dosage peut être facilement manipulé ou adapté pour répondre aux besoins de l’enquêteur. Cependant, il y a quatre questions de base à considérer avant l’expérimentation. Quelles questions générales ou particulières sont/sont le chercheur tente de répondre ? Cela est vrai pour la plupart des hypothèses axé sur la recherche ; Toutefois, il est essentiel de ce test car elle déterminera plusieurs paramètres nécessaires à avec précision et répondre complètement à la question (s). Quelle lignée de cellules ou lignées de cellules (si plusieurs) devraient être utilisées pour représenter le système physiologique étudié ? Par exemple, dans une cutanée plaie étude guérison, fibroblastes dermiques5,6,7, cellules souches,8, ou les kératinocytes épidermiques9 pourrait être considérée comme représentant des populations de cellules qui se trouvent normalement en abondance dans les tissus de la peau10. Alternativement, les neutrophiles, les macrophages ou les autres cellules inflammatoires peuvent être évaluées dans ce système pour représenter la migration cellulaire des autres composantes de la cicatrisation dans les tissus de peau10. En outre, identification de la ligne de cellule spécifique en cours d’évaluation vous aidera à identifier quels réactifs sont optimales d’utiliser pour promouvoir l’activité métabolique des cellules. Comment la migration cellulaire sera suivi/image ? Il y a un certain nombre de techniques utilisées pour observer la migration cellulaire dans une assiette ou un ballon. Par exemple, la teinture ou fluorescent marquage des cellules et en utilisant la fluorescence ou imagerie confocale pour suivre les cellules fournit un fort contraste, qui permet au chercheur de définir clairement les cellulaires contre des endroits non alvéolaire et mouvement cellulaire11 . Une autre technique courante, décrite dans cette étude, est l’utilisation de la microscopie inversée avec contraste de phase6,7. Cette alternative aux colorants de la cellule et la fluorescence permet à l’utilisateur de vivre les cellules de piste sans avoir à fixer en position terminale cellules avant l’imagerie et permet aussi de capturer des images de la même puits individuels contenant blessés monocouches de cellules dans l’ensemble de points dans le temps. Quel résultat mesure sera utilisé pour l’analyse ? En utilisant les images recueillies tout au long de l’étude, données peuvent être générées dans lequel les changements aux taux de migration cellulaire peuvent être comprises. Dans notre laboratoire, microscopiques images capturées sur le microscope photonique inversé sont téléchargés vers le logiciel d’analyse image et la fermeture de la plaie pour cent et la somme aire sous la courbe (AUC) sont calculés.
Nous mettrons en évidence l’utilisation spécifique de ce test pour élucider les changements à la migration des fibroblastes dermiques en présence d’un contaminant environnemental connu, l’arsenic. L’arsenic est un métalloïde naturel trouvé au sein de la croûte terrestre. Divers endroits ont été trouvés avec des niveaux élevés d’arsenic, qui pose un risque pour les personnes qui vivent près de ces endroits. Ainsi, les sources de nourriture et d’eau ont démontré avoir augmenté les niveaux de contamination par l’arsenic, ce qui augmente la probabilité pour les individus à devenir exposés à l’arsenic. Exposition à l’arsenic environnementale s’est avérée avoir des conséquences à long terme sur la santé dans les populations humaines au-dessus ou même inférieure à l’actuelle United States Environmental Protection Agency (USEPA) Max Contaminant niveau (MCL) de 10 ppb (10 µg/L)12, 13. bien que l’USEPA a mis cette MCL et jugeait potable des limites, des concentrations d’arsenic qui dépassent cette limite ne sont pas rares dans les sources d’eau dans le monde entier. Dans le sud-ouest des États-Unis, les nombreuses eaux souterraines, l’eau des puits et sources ont été documentés pour contenir en ce qui concerne les niveaux d’arsenic14. Par exemple, à Verde Valley, AZ, Montezuma Well contient 210 µg/L de l’arsenic15. Eaux souterraines autour du fleuve Verde, AZ contient 16 µg/L d’arsenic en moyenne, avec des valeurs maximales atteignant 1,3 mg/L15,16. Notamment, des concentrations d’arsenic dans plusieurs puits dans le hangar de l’eau de rivière-vert dépassent 50 µg/L15,16. Avec cette connaissance, les concentrations d’arsenic ont été sélectionnés qui vont en bas de la MCL à 0,1 µM (7,5 ppm), pour au-dessus de la MCL à 10 µM (750 ppb) dans le courant étudier14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 .
Les informations recueillies par ces expériences servira comme un indicateur précoce des changements potentiels pour les taux de migration cellulaire dans in vivo blessure contaminé par l’arsenic. Par la suite, peuvent être sélectionnés les molécules de signalisation basé sur leur rôle en facilitant la cicatrisation et la migration cellulaire, et future polymérase quantitative PCR (qPCR) basé gene expression expériences peuvent être mis en place à la fin de l’actuelle études. Si les taux de migration dans ce test changent en présence de l’arsenic, spécifiques de gènes cibles impliqués dans la migration cellulaire peuvent être la cible des effets délétères de l’arsenic et peuvent donc le mécanisme de la perturbation.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Class II A/B3 Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td>15201-816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile Gloves</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>55082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Precision</td>
			<td>Model 182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Q080318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPR Centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>349702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Scale</td>
			<td>Ohaus</td>
			<td>I093 1125062111P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighting paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>H351125781212A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biohazard bags</td>
			<td>Fisherbran</td>
			<td>01-830A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Jacketed CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>309739-31053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10566-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Pipettor</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>140685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p200 Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p20 Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denominator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D59707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 tissue flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430725U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tube</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-539-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Marker</td>
			<td>Securline</td>
			<td>92167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wipes</td>
			<td>Kintech</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>63-67-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Filter Pipet Tips</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>16160210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Great Value</td>
			<td>220-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovial Rack</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>5030-0505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Gizmo Supply</td>
			<td>B00SCOGY56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube Rack</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waste Beaker</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Edge Ruler</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human neonatal dermal fibroblasts (hDFn)</td>
			<td>lot: 1734, 2902</td>
			<td>106-05n</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rstudio Statistical Software</td>
			<td></td>
			<td>ver: 3.5.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>NIH</td>
			<td>ver: 1.8.0_112</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro scratch assay to demonstrate effects of arsenic on skin cell migration

La compréhension des mécanismes physiologiques de la cicatrisation des plaies a fait l’objet des recherches en cours depuis de nombreuses années. Cette recherche se traduit directement l’évolution des normes cliniques utilisés pour le traitement des plaies et de diminuer la morbidité et mortalité pour les patients. La cicatrisation est un processus complexe qui nécessite la fonction et interaction stratégique de cellules et de tissus. Une des nombreuses fonctions extrêmement importantes de cicatrisation est individuelle et collective de migration cellulaire. Sur blessure, diverses cellules du sang, entourant les tissus conjonctifs, épithéliaux et rapidement migrent vers le site de la plaie par des stimuli physiques ou chimiques. Cette réponse de migration peut dicter dans une large mesure les résultats et le succès d’une plaie de guérison. Il est important pour la médecine translationnelle qui peut conduire à des résultats de cicatrisation améliorée de comprendre cette fonction cellulaire spécifique. Nous décrivons ici le protocole utilisé pour mieux comprendre les migrations cellulaires en ce qui concerne la cicatrisation, et comment les changements dans l’environnement cellulaire peuvent altérer considérablement ce processus. Dans cette étude de l’exemple, fibroblastes dermiques ont été cultivés en milieu additionné de sérum fœtal (SVF) comme des cultures monocouches dans des flacons de culture de tissus. Cellules ont été aseptiquement transférés en plaques de 12 puits de culture de tissus traitée, développées au confluent de 100 %. En arrivant à confluence, les cellules de la monocouche étaient verticalement grattés à l’aide d’une pointe de pipette p200. L’arsenic dilué dans les milieux de culture additionné de FBS a été ajouté aux puits individuels à écologiquement pertinentes doses variant de 0,1 à 10 M. Images on a capturé toutes les 4 heures (h) sur une période de 24 h à l’aide d’un microscope inversé de lumière pour observer la migration cellulaire (enroulées fermeture). Des images ont été analysés individuellement à l’aide de logiciels d’analyse image et % plaie fermeture a été calculée. Les résultats montrent que l’arsenic ralentit la cicatrisation des plaies. Cette technique fournit un premier écran rapid et peu coûteux pour l’évaluation des effets des contaminants sur la cicatrisation des plaies.

Taille des échantillons (n) pour tous les groupes de traitement a été n = 28. Les cellules sont cultivées avec succès suivant les techniques aseptiques et les protocoles de laboratoire (Figure 1). Rayures uniformes ont été observées dans tous les groupes de traitement avec la largeur de rayure moyenne mesurant mm 0,8 0,4 mm (Figure 2). Groupes témoins avaient une superficie moyenne de somme inférieur à la valeur de la courbe de 1,355.83 ; 0,01 µM que groupes traités avaient une moyenne a résumé les superficies de la valeur de la courbe de 1,366.21 ; 0,1 µM que groupes traités avait une moyenne a résumé zone inférieur à la valeur de la courbe de 1,326.24, 1,0 µM dans le groupe de traitement a eu une moyenne a résumé les superficies de la valeur de la courbe de 1,295.10 ; et enfin les 10 µM comme groupe de traitement était une superficie cumulée moyenne inférieur à la valeur de courbe de 535.12, qui était statistiquement plus faible par rapport à tous les autres groupes (p < 0,05) (Figure 3). R-programme pour l’analyse statistique a été utilisé pour exécuter une ANOVA à un ajustement de post hoc Tukey pour déterminer les différences statistiques entre les groupes de traitement (p < 0,05).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58838/58838fig2.jpg"> Figure 2 : images de dosage zéro représentant sur une période de 20 h. Images A à D représentent la migration cellulaire des cellules de contrôle ; images E-H représentent la migration cellulaire des cellules contaminées par 1,0 µM images I-L représentent la migration cellulaire des cellules contaminées avec 10 µM comme. Parmi ces images, il est clair que la migration cellulaire est ralentie en présence de l’arsenic. Les images de contrôle montrent une égratignure totalement « guéri » après 20 h, alors que les deux autres groupes comme traitement n’étaient pas « guéries ». Les 10 µM comme traitement inhibe la fermeture complète au total après 24 h. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58838/58838fig2large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58838/58838fig3.jpg"> Figure 3 : Arsenic ralentit la migration cellulaire dans le dosage zéro. Des images ont été capturés pendant une période de 24 h pour observer les changements de taux de migration cellulaire en présence de diverses concentrations d’arsenic. Les images brutes ont été analysées à l’aide d’un logiciel automatisé (par exemple, dans MATLAB), quelle largeur de plaie initialement mesurée, puis calculé fermeture pour cent et, enfin, aire sous la courbe (AUC). Barres d’erreur représentent erreur type de la moyenne. Les 10 µM en tant que groupe de traitement ralenti statistiquement la migration cellulaire des fibroblastes dermiques humains néonatales (hDFn), indiqué par une valeur AUC statistiquement plus faible, par rapport à tous les autres groupes de traitement à l’aide d’une ANOVA à avec un ajustement de post hoc Tukey (p) < 0,05). Des différences statistiques sont représentés par les lettres « A » et « B », qui ont été obtenus grâce à l’utilisation de la méthode d’affichage de lettre Compact disponible en R-programme. Les traitements qui ne partagent pas une lettre commune sont statistiquement significatives de l’autre (p < 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58838/58838fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

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In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration

In Vitro Scratch test pour démontrer les effets de l’Arsenic sur la Migration cellulaire de la peau

Cette étude porte sur un modèle in vitro de plaie guérison (zéro dosage) comme un mécanisme pour déterminer les contaminants environnementaux tels que les migrations cellulaires d’influence de l’arsenic. Les résultats démontrent que ce test in vitro fournit des indications rapides et précoces des changements à la migration cellulaire avant in vivo de l’expérimentation.

Understanding the physiologic mechanisms of wound healing has been the focus of ongoing research for many years. This research directly translates into ...

La migration cellulaire est un processus critique de cicatrisation des plaies qui peut modifier radicalement le résultat d’une blessure curative. Ce protocole permet aux chercheurs de mieux comprendre l’effet de divers composés sur la migration cellulaire pendant la cicatrisation des plaies. Ce qui peut souvent conduire à des stratégies de traitement ciblées pour la médecine clinique.L’analyse à gratter est une approche rentable et à haut débit pour générer des données significatives sur la cicatrisation des plaies avant des tests in vivo coûteux et longs. L’analyse à gratter comme méthode est particulièrement pertinente dans les applications de cicatrisation des plaies. Plus précisément, la peau.Cependant, l’analyse est vraiment un test de migration, et pourrait être appliquée à n’importe quel type de cellule où la migration des cellules est d’intérêt à mesurer ou à capturer. Semblable à la culture classique de cellules et de tissu, procédures d’opération standard, formation, technique, et pratique, pratique, pratique. Ceux-ci sont la clé du succès avec l’analyse scratch.Nathan Cruz, étudiant à la maîtrise, et Oscar Lujan, chercheur de premier cycle, démontreront la procédure. Pour commencer cette procédure, préparez l’armoire biosécurité II à l’aide d’une solution aqueuse à 70 % d’isopropyle pour effectuer un lingette sanitaire, en commençant par les parois arrière et latérale, et en travaillant jusqu’à la plaque de base. Essuyez également tous les matériaux qui seront utilisés dans l’analyse avant de les placer dans l’armoire.Ensuite, obtenez des flacons contenant la lignée cellulaire cryopréservée désirée, et placez-en un dans un bain d’eau d’un centimètre de profondeur à 37 degrés Celsius pour décongeler. Ajouter 10 millilitres de milieu complété avec 10%FBS dans un flacon de culture tissulaire T75. Ouvrez le flacon contenant le stock cellulaire et aspirez soigneusement la solution.Ensuite, transférez les cellules dans le flacon T75. Retirez un millilitre de supports du flacon et transférez-le de nouveau dans le flacon, puis transférez-le dans le flacon pour maximiser le rendement cellulaire du flacon. Serrez le capuchon du flacon et secouez-le doucement pour disperser uniformément les cellules en suspension sur toute la surface.Après cela, étiquetez le flacon avec les informations affichées ici, et placez-le dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 72 heures. Tout d’abord, récupérer le flacon de culture tissulaire de l’incubateur, et d’observer les cellules adhérentes comme décrit dans le protocole de texte. Aspirez tout le volume de supports du flacon et transférez-le dans un conteneur à déchets.Ajoutez cinq millilitres de solution de sel équilibrée au flacon et secouez-le doucement pour rincer tout excès de médias, de cellules mortes ou de déchets. Retirez ensuite tout le volume de solution de sel du flacon et jetez-le dans un conteneur à déchets. Ensuite, ajoutez deux millilitres de trypsine au flacon et secouez-le doucement pour disperser l’enzyme sur les cellules adhérentes.Assurez-vous que la surface adhérente est complètement saturée et placez le flacon de tissu dans l’incubateur pendant deux à trois minutes. Après cela, appuyez doucement sur le côté du flacon trois à cinq fois pour faciliter le détachement cellulaire. Essuyez le flacon avec 70% d’alcool, et placez-le dans l’armoire de biosécurité.Ajouter cinq millilitres de bouillon de médias à la fiole de tissu pour arrêter la réaction du substrat enzymatique. Aspirez tout le volume de liquide du flacon et transférez-le dans un tube conique stérile de 15 millilitres. Centrifugeuse à 200 fois g et à 25 degrés Celsius pendant cinq minutes.Ensuite, utilisez 70% d’alcool pour essuyer le tube contenant les cellules granulées, et placez-le à l’intérieur de l’armoire de biosécurité. Pipette hors des médias, laissant derrière lui environ 250 microlitres de liquide avec la pastille cellulaire. Exécutez le fond du tube conique à travers les fentes de flacon d’un support de tube de microcentrifugeuse pour créer une vibration rapide et déranger et résuspendre la pastille cellulaire.Une fois terminée correctement, la nouvelle solution cellulaire apparaîtra comme un mélange nuageux sans granulés restants. Ajouter deux millilitres de médias à la résuspension cellulaire. Pipette les cellules doucement de haut en bas du côté du tube 20 fois pour briser les touffes.Et enregistrez le volume total de suspension cellulaire. Ensuite, utilisez une pipette stérile pour ajouter 20 microlitres de bouillon bleu trypan à un puits vide d’une plaque de 96 puits. À l’aide d’une pointe stérile de pipette, transférez 20 microlitres de stock cellulaire du tube de 15 millilitres au puits contenant la solution bleue trypan.Pipette doucement pour mélanger le contenu et transférer 10 microlitres du mélange entre le bordereau de couverture et la chambre de comptage sur un hemocytomètre. Ne comptez que les cellules au centre et les quatre carrés d’angle, en identifiant séparément le nombre total de cellules et le nombre de cellules non viables pour les cinq carrés identifiés. Après avoir calculé le nombre viable de cellules, marquer une ligne horizontale à travers le fond d’une plaque de 12 puits pour servir de marque de référence pendant l’imagerie.Diluer le stock cellulaire avec du média à une densité de 19 000 cellules par millilitre. Puis ensemencer chaque puits de la plaque de 12 puits avec un millilitre du stock cellulaire dilué, en mélangeant le stock cellulaire périodiquement pour assurer un ensemencement même des cellules dans les 12 puits. Étiquetez chaque plaque avec les informations affichées ici.Et placez-le dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone jusqu’à ce que les cellules se développent à 100% confluence. Récupérer une plaque de 12 puits avec des cellules de l’incubateur. À l’aide d’un microscope avec un objectif de 10 x, observez les cellules et déterminez la confluence à l’intérieur de chaque puits.Ensuite, aspirez et éliminez les médias de croissance de chaque puits. Assembler un pipetter P200 avec une pointe stérile de 1 à 200 microlitres. Dans chaque puits, glissez la pointe de la pipette à travers la surface de la cellule de l’endroit de 12:00 à l’endroit de 6:00 pour produire une blessure simulée à gratter.Rincez chaque puits avec un millilitre de solution de sel équilibrée pour dégager l’excès de débris et les touffes de cellules. Faire basculer la plaque d’un côté à l’autre pour faciliter le lavage. Retirez et jetez ensuite la solution de sel équilibrée de chaque puits.À l’aide d’un pipetter P1000 avec une pointe de 1000 microlitres, ajouter 1000 microlitres des stocks d’arsenic préparés dans des puits qui ont été assignés au hasard avec un groupe de traitement. Utilisez une nouvelle pointe de pipette pour chaque puits et enregistrez l’heure à l’ajout des traitements. Incuber les plaques à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone.Pour imager les plaques, capturez des images de chaque puits à 10x grossissement objectif toutes les quatre heures sur une période de 24 heures. Référez la ligne précédemment tracée sur le fond de la plaque pour l’image au même endroit le long de l’égratignure à l’intérieur de chaque puits à chaque point de temps. Dans cette étude, un test in vivo à gratter est utilisé pour observer les effets de l’arsenic sur la migration cellulaire.Des rayures uniformes sont observées dans tous les groupes de traitement, avec une largeur moyenne d’égratignure d’environ 0,8 millimètre. Les cellules de contrôle montrent une égratignure complètement guérie après 20 heures. Les deux groupes d’arsenic ne montrent pas ce niveau de guérison.Avec le traitement de 10 micromolaires inhibant la fermeture au total pendant 24 heures. Ces résultats démontrent que la présence d’arsenic ralentit la migration cellulaire. Les images brutes capturées pendant l’analyse sont analysées à l’aide d’un logiciel automatisé pour mesurer la largeur de la plaie, puis calculer le pourcentage de fermeture, et enfin calculer la zone sous la courbe.Le groupe de traitement de 10 micromolaires montre la migration cellulaire statistiquement ralentie des fibroblastes cutanés néonatals humains comparés à tous les autres groupes de traitement. Il est important de pratiquer soigneusement cette technique pour augmenter la consistance lors de l’éraflure des cellules. La variabilité involontaire entre les analyses peut potentiellement fausser les données et modifier les conclusions.D’autres techniques moléculaires telles que la réaction en chaîne quantitative de polymésase et les analyses immunosorbents enzymatiques peuvent être employées après l’essai d’éraflure pour identifier des signaux et des protéines messagers qui peuvent être la cible des changements à la migration cellulaire observés dans l’essai. Cet essai a contribué à la compréhension par les chercheurs de la métastase du cancer, des nouvelles thérapies contre le cancer émergentes, des cellules souches et de la médecine régénérative, et de nombreuses autres étapes scientifiques.

Research

JoVE Journal

Environment

In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration

Exploring the Effects of Atmospheric Forcings on Evaporation: Experimental Integration of the Atmospheric Boundary Layer and Shallow Subsurface

Explorer les effets des forçages atmosphériques sur évaporation: l&#39;intégration expérimentale de la couche limite atmosphérique et de subsurface

Evaporation is directly influenced by the interactions between the atmosphere, land surface and soil subsurface. This work aims to experimentally study ...

Recherche

Environnement

A CO2 Concentration Gradient Facility for Testing CO2 Enrichment and Soil Effects on Grassland Ecosystem Function

A CO2 Concentration Gradient Facility for Testing CO2 Enrichment and Soil Effects on Grassland Ecosystem Function

Un CO<sub&gt; 2</sub&gt; Facilité Concentration de Gradient pour les essais CO<sub&gt; 2</sub&gt; Enrichissement et du sol Effets sur l&#39;écosystème de prairie Fonction

Continuing increases in atmospheric carbon dioxide concentrations (CA) mandate techniques for examining impacts on terrestrial ecosystems. Most ...

A Flow-through Exposure System for Evaluating Suspended Sediments Effects on Aquatic Life

Un système d&#39;exposition accréditives pour l&#39;évaluation de suspension Sédiments effets sur la vie aquatique

This paper describes the Fish Larvae and Egg Exposure System (FLEES). The flow-through exposure system is used to investigate the effects of suspended ...

Determination of Inorganic Arsenic in a Wide Range of Food Matrices using Hydride Generation - Atomic Absorption Spectrometry.

Dosage de l’Arsenic inorganique dans une gamme large de Matrices alimentaires à l’aide d’hydrure - spectrométrie d’Absorption atomique.

The European Food Safety Authority (EFSA) underlined in its Scientific Opinion on Arsenic in Food that in order to support a sound exposure assessment to ...

Protocol for Assessing the Relative Effects of Environment and Genetics on Antler and Body Growth for a Long-lived Cervid

Protocole pour évaluer les effets relatifs de l’environnement et de la génétique sur le cartilage de wapiti pur et la croissance du corps pour une longue durée de vie de cervidés

Cervid phenotype can be placed into one of two categories: efficiency, which promotes survival over extravagant morphometric growth, and luxury, which ...

Preparation of DMMTAV and DMDTAV Using DMAV for Environmental Applications: Synthesis, Purification, and Confirmation

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Préparation des DJIBY92V DMDTAV à l’aide de DMAV pour Applications environnementales : synthèse, la Purification et Confirmation

Dimethylated thioarsenicals such as dimethylmonothioarsinic acid (DMMTAV) and dimethyldithioarsinic acid (DMDTAV), which are produced by the metabolic ...

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Un protocole expérimental pour l’étude des effets minéraux sur les Transformations hydrothermiques organiques

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