Name: in vitro scratch assay to demonstrate effects of arsenic on skin cell migration
Uploaded: 2019-02-23T13:00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration at JoVE.com

Forskningen i denne publikasjonen ble støttet av National Institute on minoritet helse og helse forskjeller i National Institutes of Health under prisen nummer U54MD012388. Innholdet er ansvar forfattere og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synet til National Institutes of Health.

<ol>
	<li>Diegelmann, R., Evans, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing:+an+overview+of+acute,+fibrotic+and+delayed+healing.">Wound healing: an overview of acute, fibrotic and delayed healing.</a> Frontiers in BioScience. 9, 283-289 (2004).</li><li>Braiman-Wiksman, L., Solomonik, I., Spira, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+into+wound+healing+sequence+of+events.">Novel insights into wound healing sequence of events.</a> Toxicologic Pathology. 35, 767-779 (2007).</li><li>Michelson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Platelets. , (2013).</li><li>Aikawa, M., Schoenbechler, M. J., Barbaro, J. F., Sadun, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+rabbit+platelets+and+leukocytes+in+the+release+of+histamine.+Electron+microscopic+observations.">Interaction of rabbit platelets and leukocytes in the release of histamine. Electron microscopic observations.</a> American Journal of Pathology. 63 (1), 85-98 (1971).</li><li>Liang, C., Park, A., Guan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+scratch+assay:+A+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro.">In vitro scratch assay: A convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nature Protocols. , 329-333 (2007).</li><li>Pinto, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bench-top+in+vitro+wound+assay+to+evaluate+wound+closure.+Applied.">A bench-top in vitro wound assay to evaluate wound closure. Applied.</a> In Vitro Toxicology. 2 (3), 151-156 (2016).</li><li>Pinto, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+mitigates+the+negative+effects+of+arsenic+contamination+in+an+in+vitro+wound+model.">Estrogen mitigates the negative effects of arsenic contamination in an in vitro wound model.</a> Applied In Vitro Toxicology. 4 (1), 24-29 (2018).</li><li>Roubelakis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-rich+plasma+(PRP)+promotes+fetal+mesenchymal+stem/stromal+cell+migration+and+wound+healing+process.">Platelet-rich plasma (PRP) promotes fetal mesenchymal stem/stromal cell migration and wound healing process.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 417-428 (2014).</li><li>Shibata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adiponectin+regulates+cutaneous+wound+healing+by+promoting+keratinocyte+proliferation+and+migration+via+the+ERK+signaling+pathway.">Adiponectin regulates cutaneous wound healing by promoting keratinocyte proliferation and migration via the ERK signaling pathway.</a> Journal of Immunology. 189 (6), 3231-3241 (2012).</li><li>Mendonca, R. J., Coutinho-Netto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+aspects+of+wound+healing.">Cellular aspects of wound healing.</a> Anais Brasileiros de Dermatologia. 84 (3), 257-262 (2009).</li><li>Beem, E., Segal, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+stability+and+sensitivity+of+cell+fluorescent+labels+when+used+for+cell+migration.">Evaluation of stability and sensitivity of cell fluorescent labels when used for cell migration.</a> Journal of Fluorescence. 23 (5), 975-987 (2013).</li><li>Gentry, P. R., Clewell, H. J., Greene, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+recent+advances+in+research+on+arsenic+cancer+risk+assessment.">The impact of recent advances in research on arsenic cancer risk assessment.</a> Regulatory Toxicology and Pharmacology. 69, 91-104 (2014).</li><li>Beamer, P. I., Klimecki, W. T., Loh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+children's+urinary+CC16+levels+with+arsenic+concentrations+in+multiple+environmental+media.">Association of children's urinary CC16 levels with arsenic concentrations in multiple environmental media.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health.pii: E521.2016:13. , (2016).</li><li>Robertson, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arsenic+in+ground-water+under+oxidizing+conditions,+southwest+United+States.">Arsenic in ground-water under oxidizing conditions, southwest United States.</a> Environmental Geochemistry and Health. 11, 3-4 (1989).</li><li>Foust, R. D., Mohapatra, P., Compton-O'Brian, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Groundwater+arsenic+in+the+Verde+Valley+in+central+Arizona,+USA.">Groundwater arsenic in the Verde Valley in central Arizona, USA.</a> Applied Geochemistry. 19, 251-255 (2004).</li><li>Uhlman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Arsenic in Arizona Ground Water: Source and Transport Characteristics. , (2008).</li><li>Agusa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+exposure+to+arsenic+from+drinking+water+in+Vietnam.">Human exposure to arsenic from drinking water in Vietnam.</a> Science of the Total Environment. , (2014).</li><li>Ayotte, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+temporal+variability+of+arsenic+in+groundwater+used+for+drinking+water+supply+in+the+United+States.">Factors affecting temporal variability of arsenic in groundwater used for drinking water supply in the United States.</a> Science of the Total Environment. , (2014).</li><li>Dummer, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geostatistical+modeling+of+arsenic+in+drinking+water+wells+and+related+toenail+arsenic+concentrations+across+Nova+Scotia,+Canada.">Geostatistical modeling of arsenic in drinking water wells and related toenail arsenic concentrations across Nova Scotia, Canada.</a> Science of the Total Environment. , (2014).</li><li>Sorg, T. J., Chen, A. S., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arsenic+species+in+drinking+water+wells+in+the+USA+with+high+arsenic+concentrations.">Arsenic species in drinking water wells in the USA with high arsenic concentrations.</a> Water Research. 48, 156-169 (2014).</li><li>Beamer, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+Children's+Urinary+CC16+Levels+with+Arsenic+Concentrations+in+Multiple+Environmental+Media.">Association of Children's Urinary CC16 Levels with Arsenic Concentrations in Multiple Environmental Media.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health. 13, (2016).</li><li>Pomari, E., Dalla Valle, L., Pertile, P., Colombo, L., Thornton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracrine+sex+steroid+synthesis+and+signaling+in+human+epidermal+keratinocytes+and+dermal+fibroblasts.">Intracrine sex steroid synthesis and signaling in human epidermal keratinocytes and dermal fibroblasts.</a> The FASEB Journal. 29 (2), 508-524 (2015).</li><li>Gotsulyak, Y., Kosach, R., Cherednyk, V., Tykhonkova, O., Khoruzhenka, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+cell+motility+evaluation+in+scratch+assay.">Optimization of cell motility evaluation in scratch assay.</a> Biopolymers and Cell. 30, 223-228 (2014).</li><li>Goetsch, K. P., Niesler, C. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+scratch+assay+for+in+vitro+skeletal+muscle+wound+healing+analysis.">Optimization of the scratch assay for in vitro skeletal muscle wound healing analysis.</a> Analytical Biochemistry. 411, 158-160 (2011).</li><li>Harishkumar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+the+mechanism+of+in+vitro+wound+healing+properties+of+citrus+tamurana+extract.">Revealing the mechanism of in vitro wound healing properties of citrus tamurana extract.</a> BioMed Research International. 13, (2013).</li><li>Johnston, S. T., Simpson, M. J., McElwain, D. L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+much+information+can+be+obtained+from+tracking+the+position+of+the+leading+edge+in+a+scratch+assay?.">How much information can be obtained from tracking the position of the leading edge in a scratch assay?.</a> Journal of the Royal Society Interface. 11, 1-9 (2014).</li></ol>

Forfatterne ikke avsløre.

Anvendelsen av denne analysen gir en høy gjennomstrømming og rettidig evaluering av mobilnettet migrasjon og kan direkte oversette til komplekse fysiologiske systemer5,6,7. Derfor er foreslått benk toppen modellen innstilt og praktisert for å evaluere effekten av ulike terapeutiske agenter og miljøgifter på sårtilheling6. Konsentrasjonen av arsen i denne studien ble ansett som miljøvennlig relevante gjennom omfattende litteratursøk av kjente eksponeringsnivåer, og fra Retrospektiv gjennomgang av ulike data baser14,15, 16,,17,,18,,19,,20,,21. Bruk av denne i vitro scratch analysen viste at eksponering for en arsen konsentrasjon i høy, men miljømessig relevante området, forsinket såret nedleggelse (mobilnettet migrasjon).
Denne benken toppmodellen var også ansatt å isolere og studere en enkeltcelle linje (fibroblast) for ytterligere å forstå hvordan fibroblast overføring bidrar til sår helbredelse resultater. Det er vanskelig å studere funksjonene i en enkeltcelle linje i komplekse i vivo systemer med mange andre celler og vev tilstede som kan forstyrre analysen. Dessuten gir analysen et middel til å oppnå semi kvantitative prosent såret nedleggelse data som kan brukes til å målrette bestemte cellulære mekanismer som forbindelser kan påvirke sårtilheling. For eksempel cellene i scratch analysen kan samles og lagres i en ønskede reagensen og brukes i genuttrykk (signal mRNA) eller protein uttrykk søk22. Denne informasjonen kan være nyttig å etterforskeren hvis de søker å forstå hva signaler eller proteiner kan i stor grad bidra til endringer i mobilnettet migrasjon i nærvær av varierende behandlinger (dvs. arsen)22.
Menneskelig neonatal dermal fibroblaster ble valgt for dette basert på deres framtredende rolle i sårtilheling. Men denne scratch analysen protokollen er implementert ved hjelp av ulike celletyper og for en rekke forskningsformål. For eksempel er scratch analysen vedtatt i onkologi for å studere migrasjon hemming av kjemoterapi narkotika23; for skjelettlidelser muskel celle migrasjon, spredning og diffusion24; å studere effekten av planteekstrakter på mobilnettet migrasjon25; og for å forstå hvordan keratinocyte migrasjon og spredning bidra til sår helbredelse9. I tillegg evaluert en tidligere artikkel av Pinto et al. virkningene av uran (U) og blodplater-rich plasma (PRP) på hDFn overføring ved hjelp av scratch analysen6. Hensikten med verket var å forstå omfanget som denne analysen kan teste effekten av en agent trodde å bremse mobilnettet overføring (U), samt en agent å fart cellular migrasjon (PRP). Som kan sees i de nevnte arbeidet og forskning av andre etterforskere, anvendelse av scratch analysen har stort potensial for bruk i ulike eksperimentelle modeller26. Til tross for detaljer gitt metodene, bør avvik forventes mellom etterforskere og eksperimenter. For eksempel vil mobilnettet overføring priser trolig variere basert på celle linjen i bruk, i tillegg til nødvendig mikronæringsstoffer kreves for enestående celletyper. Mange av de viktige observasjonene til hjelp i cellen avkastning og levedyktighet er oppført som notater i denne protokollen. Men anbefales det sterkt at etterforskerne følger produsentens anbefalinger for optimale forhold, og bruke denne metoden som supplerende instruksjon for generelle celle kultur arbeid.
Selv om scratch analysen er ekstremt allsidig for studier av cellular aktivitet. uforutsette biases kan oppstå i måling teknikker. For eksempel når du bruker ImageJ å manuelt trace celle migrasjon fronter, kan variasjon finnes blant brukere som kan begrense nøyaktigheten og representant datainnsamling. Det bør også bemerkes at overføringen fronter bør leses blind til behandling å minimere bruker bias. Videre kan manuelt identifisere migrasjon fronter resultere i feilberegning av gjennomsnittlig distanse på grunn av pseudopod dannelsen av celler og deres evne til å nå ut til skjemaet fokal adhesjon, som kan være visuelt villedende. På samme måte, bruk av fluorescerende "celle tracker" fargestoffer på celleoverflaten eller kjernefysiske proteiner å oppdage migrasjon kan utilsiktet fastsette celler som resulterer i feil ved måling av mobilnettet overføring over tid. Det anbefales at aktuelle positiv og/eller negative kontroller være registrert i eksperimentet til helt esler effekten av behandling på cellelinjer. Praktisering av denne analysen må fullføres i erkjennelse av begrensninger. Denne analysen garanterer ikke at mobilnettet migrasjon resultatene i vitro eksperimentering direkte vil oversette til i vivo resultater. Sår helbredelse og mobilnettet migrasjon i en kompleks levende system innebærer en rekke celletyper og molekylære signaler; hver har potensial til å påvirke helbredende svar.
I sammendraget, har scratch analysen blitt funnet for å gi høy gjennomstrømming screening av mobilnettet overføring som svar på endrede miljøer6,25. Vi utnyttet spesielt denne protokollen for å oppdage endringer i mobilnettet migrering som følge av arsen eksponering ved ulike miljømessig relevante doser. Disse dataene har gitt begrunnelse for å bruke scratch analysen videre studier og vurdere mekanistisk veier for mobilnettet denne analysen og hvordan disse veiene er endret av arsen eksponering.

Sårheling består av en kompleks serie av overlappende trinn som involverer ulike celletyper, signalnettverk molekyler og ekstracellulær matrix komponenter1. Sammen jobber disse komponentene sammen å oppnå såret oppløsning eller reparasjon, som til slutt fører til dannelse av et beskyttende fibrotiske arr avhengig av traumer1. For å fange den individuelle prosesser og funksjoner av sår er helbredelse i ett eksperiment vanskelig; enkelttrinn i såret helbredelsesprosessen må identifiseres og testet separat. Blant de mange trinnene av sårheling, prosessen med cellular overføring har vært ansett som kritisk når du vurderer helbredende priser2. Mobilnettet migrasjon kan observeres i alle faser av sårheling, og dermed nødvendiggjør videre forståelse av hvordan endringer i celle migrasjon kan påvirke såret nedleggelse. For eksempel er mobilnettet overføring sett i begge tidlige og sene fasen betennelse, med blod koagulasjon og blodplater samling på såret området3. Disse hendelsene hindre overdreven blodtap ved å danne en midlertidig blokkering for å fylle såret områder uten vev3. Blodplater i omløp vil syntetisere og utsondre vasoactive meglere sammen med chemotactic faktorer, som sammen signalet for inflammatorisk leukocytter migrasjon (hvite blodlegemer) til de sårede vev for reparere4. Re epithelialization oppstår i timene av vev skade og innebærer dekker såret området gjennom aktivitet og migrering av epitelial keratinocytter å hindre videre smitte eller invasjon av fremmede partikler til såret området2. Disse eksemplene ta bare noen av mange celle migrasjon funksjonene tilknyttet sårtilheling.
Scratch analysen er beskrevet og brukes til å forstå celle migrasjon og dens mange roller på sårtilheling5,6. Denne analysen anses forenklede, gir høy gjennomstrømming og gjør etterforskeren samle representant celle migrasjon data. Migrasjon analyser har vist at visse stoffer kan akselerere eller redusere hastigheten av mobilnettet migrasjon6. Videre gir disse analyseresultatene translasjonsforskning fysiologiske informasjon som kan brukes til å formulere målet behandlinger, dosering konsentrasjoner, og gener rundt før i vivo eksperimentering. Analysen krever grunnleggende celle kultur teknikker og forsyninger, en celle linje av valg og bildeteknologi å fange bevegelse over tid eller bevegelse svar på behandlinger.
Analysen kan lett manipulert eller tilpasset behovene til etterforskeren. Men er det fire grunnleggende spørsmål du bør vurdere før eksperimentering. Hvilke generelle eller spesifikke spørsmålet (er) er investigator(s) prøver å besvare? Dette gjelder for de fleste hypoteser drevet forskning; Det er imidlertid avgjørende for denne analysen fordi den vil finne mange av parameterne for å nøyaktig og fullstendig svar på spørsmålene. Hva celle linje eller cellelinjer (Hvis flere) skal brukes til å representere fysiologiske systemet blir studert? For eksempel i en cutaneous sår helbredelse studie, dermal fibroblast5,6,7, Stamcelle8eller epidermal keratinocyte9 kan anses å representere celle populasjoner som normalt finnes i overflod i huden vev10. Alternativt kan nøytrofile, makrofager eller andre inflammatoriske celler evalueres i dette systemet til å representere celle migrasjon av andre komponenter i sårheling innenfor huden vev10. I tillegg vil identifiserer bestemt celle linjen evaluering bidra til å identifisere hvilke reagenser er optimal å bruke å fremme cellen metabolsk aktivitet. Hvordan blir celle migrasjon sporet/fotografert? Det finnes en rekke teknikker brukes til å observere celle migrasjon i en tallerken eller kolbe. Inneholder for eksempel en sterk kontrast, som lar etterforskeren klart definere mobilnettet vs ikke-mobilnettet steder og mobilnettet bevegelse11 farging eller fluorescently merking celler og bruker fluorescens eller AC confocal imaging for å spore celler . En annen vanlig teknikk, beskrevet i denne studien er bruken av omvendte * lys med fase kontrast6,7. Dette alternativ til celle fargestoffer og fluorescens lar brukeren live spor celler uten å måtte fikse terminalt celler før bildebehandling og også kan fange bilder av samme individuelle brønner som inneholder sårede monolayers celler over tidspunkt. Hva utfallet tiltak vil bli brukt for analyse? Bruker bildene samlet gjennom hele studiet, data kan genereres som endringer i mobilnettet overføring priser kan forstås. I vår lab, mikroskopiske bilder på invertert lys mikroskopet er lastet opp til analyseprogramvare og prosent såret nedleggelse og summerte området under kurven (AUC) beregnes.
Vi vil markere bestemt bruk av denne analysen å belyse endringer dermal fibroblast overføring i nærvær av en kjent miljømessige miljøgifter, arsen. Arsen er en naturlig forekommende metalloid funnet i jordskorpen. Forskjellige steder er funnet med forhøyede nivåer av arsen, som utgjør en risiko for personer som bor i nærheten av disse stedene. Som et resultat, har mat og vann kilder vist har økte nivåer av arsen forurensning, noe som øker sannsynligheten for enkeltpersoner å bli utsatt for arsen. Miljømessige arsen eksponering har vist seg å ha langsiktige helsemessige konsekvenser i menneskelige populasjoner over eller selv under den gjeldende USA Environmental Protection Agency (USEPA) Max miljøgifter nivå (MCL) 10 ppb (10 µg/L)12, 13. selv om USEPA har satt denne MCL og ansett det trygt for drikkevann grenser, arsen konsentrasjoner som overstiger denne grensen er ikke uvanlig i vannkilder over hele verden. I det sørvestlige USA, er mange grunnvann, godt vann og kilder dokumentert for å inneholde om nivåer av arsen14. I Verde Valley, AZ inneholder for eksempel Montezuma godt 210 µg/L arsen15. Grunnvann rundt elven Verde, AZ inneholder 16 µg/L av arsen i gjennomsnitt med topp verdier nå 1.3 mg/L15,16. Spesielt overstige arsen konsentrasjoner i mange brønner i Verde elva vann skjulet 50 µg/L15,16. Med denne kunnskapen, miljømessig relevante arsen konsentrasjoner ble valgt som spenner fra under MCL på 0,1 µM (7,5 ppb), over MCL på 10 µM (750 ppb) i gjeldende studere14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 .
Informasjonen som samles inn fra disse eksperimentene vil bli brukt som en tidlig indikator på mulige endringer til mobilnettet overføring priser i en i vivo sår forurenset med arsen. Etterpå signalnettverk molekyler kan velges basert på deres rolle i tilrettelegge sårheling og mobilnettet migrasjon, og fremtidige kvantitative polymerase kjedereaksjon (qPCR) basert gene expression eksperimenter kan settes opp ved gjennomføring av gjeldende studier. Hvis overføring priser i denne analysen endrer i nærvær av arsen, bestemte genet mål involvert i cellulær migrasjon være for skadelige effekter av arsen, og dermed kan være mekanisme avbrudd.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Class II A/B3 Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td>15201-816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile Gloves</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>55082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Precision</td>
			<td>Model 182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Q080318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPR Centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>349702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Scale</td>
			<td>Ohaus</td>
			<td>I093 1125062111P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighting paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>H351125781212A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biohazard bags</td>
			<td>Fisherbran</td>
			<td>01-830A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Jacketed CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>309739-31053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10566-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Pipettor</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>140685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p200 Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p20 Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denominator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D59707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 tissue flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430725U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tube</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-539-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Marker</td>
			<td>Securline</td>
			<td>92167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wipes</td>
			<td>Kintech</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>63-67-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Filter Pipet Tips</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>16160210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Great Value</td>
			<td>220-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovial Rack</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>5030-0505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Gizmo Supply</td>
			<td>B00SCOGY56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube Rack</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waste Beaker</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Edge Ruler</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human neonatal dermal fibroblasts (hDFn)</td>
			<td>lot: 1734, 2902</td>
			<td>106-05n</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rstudio Statistical Software</td>
			<td></td>
			<td>ver: 3.5.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>NIH</td>
			<td>ver: 1.8.0_112</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro scratch assay to demonstrate effects of arsenic on skin cell migration

Forstå fysiologiske mekanismene av sårheling har vært fokus for pågående forskning i mange år. Denne forskningen oversettes direkte endringer i kliniske standarder som brukes til behandling av sår og redusere sykelighet og dødelighet for pasienter. Sårheling er en komplisert prosess som krever strategiske celler og vev samhandling og funksjon. En av mange kritisk viktige funksjoner av sårheling er individuelle og kollektive mobilnettet migrasjon. Ved skade overføre ulike celler fra blodet, omkringliggende connective og epitel vev raskt til såret området ved hjelp av kjemiske og/eller fysiske stimuli. Dette migrasjon svaret kan i stor grad diktere resultater og suksess av en healing sår. Forstå denne bestemte cellulære funksjoner er viktig for translasjonsforskning medisin som kan føre til forbedret sårheling resultater. Her beskriver vi brukes til å forstå mobilnettet overføring som gjelder sårheling, og hvordan endringer i mobilnettet miljø kan betydelig endre denne prosessen. I denne eksempel studien var dermal fibroblaster vokst i media med fosterets bovin serum (FBS) som monolayer kulturer i vev kultur flasker. Cellene ble tas aseptisk overført til vev kultur behandlet 12-vel plater og vokst til 100% samløpet. Ved å nå samløpet, var cellene i monolayer vertikalt riper bruker et p200 Pipetter tips. Arsen fortynnet i kultur medier med FBS ble lagt til individuelle brønner på miljømessig relevante doser alt 0.1-10 M. bilder ble tatt hver 4 timer (h) over en 24-timers periode med en invertert lys mikroskop å observere mobilnettet overføring (sår nedleggelsen). Bildene ble individuelt analysert ved hjelp av analyseprogramvare og prosent sår nedleggelsen ble beregnet. Resultatene viser at arsen bremser ned sårtilheling. Denne teknikken gir en rask og billig første skjermen for evaluering av effekter av miljøgifter på sårtilheling.

Utvalgsstørrelsene (n) for alle behandlingsgrupper var n = 28. Celler var vellykket kulturperler følgende aseptiske teknikker og lab protokoller (figur 1). Uniform riper ble observert alle behandling grupper med mener scratch bredden måler 0,8 mm 0.4 mm (figur 2). Kontrollgruppe hadde en gjennomsnittlig summerte området under kurven verdien av 1,355.83; 0,01 µM som behandlingsgrupper hadde et gjennomsnitt oppsummerte området under kurven verdien av 1,366.21; 0,1 µM som behandlingsgrupper hadde en gjennomsnittlig oppsummerte området under kurven verdien av 1,326.24, 1.0 µM som behandlingsgruppe hadde et gjennomsnitt oppsummerte området under kurven verdien av 1,295.10; og endelig den 10 µM behandlingsgruppe hadde en gjennomsnittlig summerte området under kurven verdien av 535.12, som var statistisk lavere sammenlignet med alle andre grupper (p < 0,05) (Figur 3). R-programmet for statistisk analyse ble brukt til å kjøre en enveis VARIANSANALYSE med en Tukey legge hoc justering til å finne statistiske forskjellen blant behandling (p < 0,05).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58838/58838fig2.jpg"> Figur 2: representant grunnen analysen bilder løpet 20t. Bilder ad representerer mobilnettet overføring av kontroll celler. bildene eh representerer mobilnettet migrering av celler forurenset med 1,0 µM som; bilder jeg-L representerer mobilnettet migrering av celler forurenset med 10 µM som. Fra disse bildene er det klart at mobilnettet overføring er redusert i nærvær av arsen. Kontroll bildene viser en fullstendig "helbredet" avlyse etter 20 h, mens de to andre som behandling gruppene ikke ble "helbredet". Den 10 µM som behandling inhibited komplett nedleggelse helt etter 24 h. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58838/58838fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58838/58838fig3.jpg"> Figur 3: arsen bremser mobilnettet migrasjon i scratch analysen. Bildene ble tatt over en 24-timers periode å observere endringer i mobilnettet overføring priser i nærvær av varierende konsentrasjoner av arsen. RAW-bilder ble analysert ved hjelp av en automatisert programvare (f.eksi MATLAB), hvilke opprinnelig målte såret bredde, så beregnet prosent nedleggelse og endelig området under kurven (AUC). Feilfelt representerer standard feil av gjsnitt. Den 10 µM som behandlingsgruppe statistisk bremset mobilnettet migrering av menneskelig dermal fibroblaster neonatal (hDFn), vist av en statistisk lavere AUC verdi, sammenlignet med alle andre behandlingsgrupper med en én-veis VARIANSANALYSE med en Tukey legge hoc justering (p < 0,05). Statistisk forskjeller representeres av bokstavene "A" og "B", som ble oppnådd gjennom bruk av Compact brev visningsmetoden tilgjengelig i R-programmet. Behandlinger som ikke deler et felles brev er statistisk signifikant fra hverandre (p < 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58838/58838fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration at JoVE.com

In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration

In Vitro Scratch analysen for å vise effekten av arsen på huden celle migrasjon

Denne studien fokuserer på en i vitro modell av sår helbredelse (scratch analysen) som en mekanisme for å bestemme hvordan miljøgifter som arsen innflytelse mobilnettet migrasjon. Resultatene viser at denne i vitro analysen gir rask og tidlige indikasjoner på endringer i mobilnettet overføringen før i vivo eksperimentering.

Understanding the physiologic mechanisms of wound healing has been the focus of ongoing research for many years. This research directly translates into ...

Cellulær migrasjon er en kritisk sårhelingsprosess som drastisk kan endre utfallet av et helbredende sår. Denne protokollen gjør det mulig for forskere å bedre forstå effekten av ulike forbindelser på cellulær migrasjon under sårheling. Som ofte kan føre til målrettede behandlingsstrategier for klinisk medisin.Scratch analysen er en kostnadseffektiv og høy gjennomstrømning tilnærming for å generere meningsfulle sårhelingsdata før kostbare og tidskrevende in vivo testing. Scratch analysen som en metode er spesielt relevant i sårheling applikasjoner. Mest spesifikt, huden.Analysen er imidlertid virkelig en overføringsanalyse, og kan brukes på en hvilken som helst celletype der overføring av celler er av interesse for å måle eller fange opp. I likhet med klassisk celle- og vevskultur, standard driftsprosedyrer, trening, teknikk og praksis, praksis, praksis. De er nøkkelen til suksess med scratch analyse.Å demonstrere prosedyren vil være Nathan Cruz, en masterstudent, og Oscar Lujan, en lavere forsker. For å starte denne prosedyren, klargjør biosikkerhet II-kabinettet ved hjelp av en 70% isopropyl vandig løsning for å utføre en sanitærserviett, som begynner på baksiden og sideveggene, og arbeider ned til bunnplaten. Tørk også av alle materialer som skal brukes i analysen før du plasserer dem i skapet.Deretter får du hetteglass som inneholder ønsket kryopreservert cellelinje, og plasserer en i et en centimeter dypt vannbad ved 37 grader Celsius for å tine. Tilsett 10 milliliter medium supplert med 10% FBS i en T75 vevskulturkolbe. Åpne hetteglasset som inneholder cellelageret, og aspirer oppløsningen forsiktig.Deretter overfører cellene til T75 kolben. Fjern en milliliter media fra kolben, og overfør den tilbake til hetteglasset, og overfør den deretter tilbake til kolben for å maksimere celleutbyttet fra hetteglasset. Stram kolbens hette og rist den forsiktig for å jevnt spre cellene i suspensjon over hele overflaten.Etter dette merker du kolben med informasjonen som vises her, og plasserer den i en fuktet inkubator ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid i 72 timer. Først hente vevkulturkolbe fra inkubatoren, og observere de vedleverte cellene som beskrevet i tekstprotokollen. Aspirer hele volumet av medier fra kolben og overfør det til en avfallsbeholder.Tilsett fem milliliter balansert saltløsning i kolben, og rock den forsiktig for å skylle ut overflødige medier, døde celler eller avfallsprodukt. Fjern deretter hele volumet av saltoppløsning fra kolben og kast den i en avfallsbeholder. Deretter legger du til to milliliter trypsin i kolben, og gynger det forsiktig for å spre enzymet over de tilføyde cellene.Sørg for at tilhengeroverflaten er helt mettet, og legg vevkolben i inkubatoren i to til tre minutter. Etter dette, forsiktig trykke på siden av kolben tre til fem ganger for å lette celleavløsning. Tørk av kolben med 70% alkohol, og legg den i biosikkerhetsskapet.Tilsett fem milliliter lagermedier til vevkolben for å stoppe enzymsubstratreaksjonen. Aspirer hele volumet av væske fra kolben, og overfør den til et sterilt konisk rør på 15 milliliter. Sentrifuge på 200 ganger g og ved 25 grader Celsius i fem minutter.Bruk deretter 70% alkohol til å tørke ned røret som inneholder pelleted celler, og plasser den inne i biosikkerhetsskapet. Pipette av media, etterlater ca 250 mikroliter væske med cellepellet. Kjør bunnen av det koniske røret over hetteglasssporene på et mikrocentrifugerørstativ for å skape en rask vibrasjon og forstyrre og gjenbruke cellepelleten.Når den er riktig fullført, vises den nye celleløsningen som en overskyet blanding uten gjenværende pellet. Legg til to milliliter med medier i celleomuspensjonen. Pipette cellene forsiktig opp og ned på siden av røret 20 ganger for å bryte opp noen klumper.Og registrere det totale cellefjæringsvolumet. Deretter bruker du en steril pipette til å legge til 20 mikroliter trypan blå lager til en tom brønn av en 96-brønns plate. Bruk en steril pipettespiss, overfør 20 mikroliter cellelager fra 15-milliliter røret til brønnen som inneholder trypanblå oppløsning.Pipetten forsiktig for å blande innholdet og overføre 10 mikroliter av blandingen mellom dekselet slip og tellekammeret på et hemocytometer. Telle bare cellene i midten og fire hjørne firkanter, separat telle både totalt celleantall og ikke-levedyktig celleantall for de fem identifiserte firkanter. Etter beregning av levedyktig celleantall, markerer du en horisontal linje over bunnen av en 12-brønns plate for å tjene som referansemerke under bildebehandling.Fortynn cellelageret med media til en tetthet på 19 000 celler per milliliter. Deretter frø hver brønn av 12-brønnsplaten med en milliliter av den fortynnede cellemassen, bland cellelageret med jevne mellomrom for å sikre jevn cellesåing på tvers av alle 12 brønner. Merk hver plate med informasjonen som vises her.Og legg den i en inkubator ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid til cellene vokser til 100% samløpet. Hent en 12-brønns plate med celler fra inkubatoren. Bruk et mikroskop med et 10x mål, observere cellene og bestemme samløpet i hver brønn.Deretter aspirerer og disponerer vekstmediene fra hver brønn. Monter en P200 pipetter med en 1-200 mikrolitersteril spiss. I hver brønn, gli pipette spissen over celleoverflaten fra 12:00 sted til 6:00 sted for å produsere en scratch mock sår.Skyll hver brønn med en milliliter balansert saltløsning for å fjerne overflødig rusk og celleklumper. Rock platen fra side til side for å lette vasken. Fjern og kast deretter den balanserte saltløsningen fra hver brønn.Bruk en P1000 pipetter med en 1000 mikroliterspiss, tilsett 1000 mikroliter fra de forberedte arsenlagrene til brønner som er tilfeldig tildelt en behandlingsgruppe. Bruk en ny pipettespiss for hver brønn, og registrer tiden når behandlingene legges til. Inkuber platene ved 37 grader Celsius med 5%karbondioksid.For å se for deg platene, ta bilder av hver brønn ved 10x objektiv forstørrelse hver fjerde time over en 24-timers periode. Se linjen som tidligere er tegnet på bunnen av platen for å bilde samme sted langs ripen i hver brønn på hvert tidspunkt. I denne studien brukes en in vivo scratch testanalyse til å observere effekten av arsen på cellemigrasjon.Ensartede riper observeres på tvers av alle behandlingsgrupper, med en gjennomsnittlig ripebredde på ca. 0,8 millimeter. Kontrollcellene viser en helt helbredet ripe etter 20 timer. De to arsengruppene viser ikke dette nivået av helbredelse.Med 10-mikromolarbehandling hemmende nedleggelse helt i 24 timer. Disse resultatene viser at tilstedeværelsen av arsen bremser cellulær migrasjon. De rå bildene som ble tatt under analysen analyseres ved hjelp av automatisert programvare for å måle sårbredden, og deretter beregne prosentlukkingen, og til slutt beregne området under kurven.Behandlingsgruppen på 10 mikromolar viser statistisk redusert cellulær migrering av humane neonatale dermale fibroblaster sammenlignet med alle andre behandlingsgrupper. Det er viktig å grundig praktisere denne teknikken for å øke konsistensen når du skraper cellene. Utilsiktet variasjon mellom analyser kan potensielt forvrenge data og endre konklusjoner.Ytterligere molekylære teknikker som kvantitativ polymerasekjedereaksjon og enzymkoblede immunosorbentanalyser kan brukes etter scratch analyse for å identifisere messenger signaler og proteiner som kan være målet for endringer i cellemigrasjon observert i analysen. Denne analysen har bidratt til forskernes forståelse av kreftmetastase, nye kreftbehandlinger, stamceller og regenerativ medisin, og mange andre vitenskapelige milepæler.

Research

JoVE Journal

Environment

In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration

Exploring the Effects of Atmospheric Forcings on Evaporation: Experimental Integration of the Atmospheric Boundary Layer and Shallow Subsurface

Utforsker effekten av atmosfærisk pådriv på Fordamping: Experimental Integrasjon av Atmospheric Boundary Layer og Shallow Subsurface

Evaporation is directly influenced by the interactions between the atmosphere, land surface and soil subsurface. This work aims to experimentally study ...

A CO2 Concentration Gradient Facility for Testing CO2 Enrichment and Soil Effects on Grassland Ecosystem Function

A CO2 Concentration Gradient Facility for Testing CO2 Enrichment and Soil Effects on Grassland Ecosystem Function

En CO<sub&gt; 2</sub&gt; Konsentrasjon Gradient anlegg for testing CO<sub&gt; 2</sub&gt; Berikelse og geoteknikk Effekter på Grass Ecosystem Funksjon

Continuing increases in atmospheric carbon dioxide concentrations (CA) mandate techniques for examining impacts on terrestrial ecosystems. Most ...

A Flow-through Exposure System for Evaluating Suspended Sediments Effects on Aquatic Life

En Gjennomstrømning Eksponering system for evaluering suspenderte sedimenter effekter på akvatisk liv

This paper describes the Fish Larvae and Egg Exposure System (FLEES). The flow-through exposure system is used to investigate the effects of suspended ...

Determination of Inorganic Arsenic in a Wide Range of Food Matrices using Hydride Generation - Atomic Absorption Spectrometry.

Fastsettelse av uorganiske arsen i et bredt utvalg av mat matriser bruker hydrid generasjon - Atomic absorpsjon massespektrometri.

The European Food Safety Authority (EFSA) underlined in its Scientific Opinion on Arsenic in Food that in order to support a sound exposure assessment to ...

Protocol for Assessing the Relative Effects of Environment and Genetics on Antler and Body Growth for a Long-lived Cervid

Protokollen for å vurdere relativ effekten av miljø og genetikk på gevir og kroppens vekst for en lang levetid Cervid

Cervid phenotype can be placed into one of two categories: efficiency, which promotes survival over extravagant morphometric growth, and luxury, which ...

Preparation of DMMTAV and DMDTAV Using DMAV for Environmental Applications: Synthesis, Purification, and Confirmation

Preparation of DMMTAV and DMDTAV Using DMAV for Environmental Applications: Synthesis, Purification, and Confirmation

Utarbeidelse av DMMTAV og DMDTAV bruker DMAV for miljømessige programmer: syntese, rensing og bekreftelse

Dimethylated thioarsenicals such as dimethylmonothioarsinic acid (DMMTAV) and dimethyldithioarsinic acid (DMDTAV), which are produced by the metabolic ...

Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA

Innsamling og utvinning av yrkesmessig Air prøver for analyse av sopp DNA

Traditional methods of identifying fungal exposures in occupational environments, such as culture and microscopy-based approaches, have several ...

An Experimental Protocol for Studying Mineral Effects on Organic Hydrothermal Transformations

En eksperimentell protokoll for å studere Mineral effekter på organisk hydrotermal transformasjoner

Organic-mineral interactions are widely occurring in hydrothermal environments, such as hot springs, geysers on land, and the hydrothermal vents in the ...

Composition and Distribution Analysis of Bioaerosols Under Different Environmental Conditions

Sammensetning og distribusjon analyse av Bioaerosols Under ulike miljøforhold

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, ...

Removal of Arsenic Using a Cationic Polymer Gel Impregnated with Iron Hydroxide

Fjerning av arsen bruke en kationiske polymer gel impregnert med jern natriumhydroksid

In this work, we prepared an adsorbent composed of a cationic polymer gel containing iron hydroxide in its structure designed to adsorb arsenic from ...