Name: in vitro scratch assay to demonstrate effects of arsenic on skin cell migration
Uploaded: 2019-02-23T13:00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration at JoVE.com

Pesquisa reportada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional sobre saúde das minorias e as disparidades de saúde do institutos nacionais da saúde sob prêmio número U54MD012388. O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do institutos nacionais da saúde.

<ol>
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Applied.</a> In Vitro Toxicology. 2 (3), 151-156 (2016).</li><li>Pinto, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+mitigates+the+negative+effects+of+arsenic+contamination+in+an+in+vitro+wound+model.">Estrogen mitigates the negative effects of arsenic contamination in an in vitro wound model.</a> Applied In Vitro Toxicology. 4 (1), 24-29 (2018).</li><li>Roubelakis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-rich+plasma+(PRP)+promotes+fetal+mesenchymal+stem/stromal+cell+migration+and+wound+healing+process.">Platelet-rich plasma (PRP) promotes fetal mesenchymal stem/stromal cell migration and wound healing process.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 417-428 (2014).</li><li>Shibata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adiponectin+regulates+cutaneous+wound+healing+by+promoting+keratinocyte+proliferation+and+migration+via+the+ERK+signaling+pathway.">Adiponectin regulates cutaneous wound healing by promoting keratinocyte proliferation and migration via the ERK signaling pathway.</a> Journal of Immunology. 189 (6), 3231-3241 (2012).</li><li>Mendonca, R. 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Os autores não têm nada para divulgar.

Aplicação deste ensaio fornece uma avaliação oportuna e de alta produtividade de migração celular e pode traduzir diretamente para sistemas fisiológicos complexos5,6,7. Por esta razão, o modelo proposto de bancada foi afinado e praticado para avaliar os efeitos de vários agentes terapêuticos e toxinas ambientais na ferida cura6. As concentrações de arsénio, usado no estudo atual foram considerados ambientalmente relevantes através de pesquisa extensa literatura dos níveis de exposição conhecida e de uma revisão retrospectiva de vários dados bases14,15, 16,17,18,19,20,21. Uso este ensaio zero em vitro demonstraram que a exposição a uma concentração de arsênio dentro do alto, mas a gama ambientalmente relevante, atrasar o fechamento da ferida (migração celular).
Este modelo de topo do banco também foi empregado para isolar e estudar uma linhagem de células individuais (fibroblasto) para se perceber como a migração de fibroblastos contribui para ferir os resultados de curativas. Além disso, é difícil de estudar as funções de uma linhagem de células individuais em sistemas complexos na vivo com muitas outras células e tecidos presentes que possam interferir com a análise. Além disso, o ensaio fornece um meio de alcançar dados de encerramento semi-quantitativa por cento ferida que podem ser usados para atingir mecanismos celulares específicos através dos quais compostos podem influenciar a cicatrização de feridas. Por exemplo, células utilizadas no ensaio de risco podem ser coletadas e armazenadas em um reagente desejado e usadas na expressão gênica (sinal do mRNA) ou a expressão da proteína ensaios22. Esta informação pode ser útil ao investigador se eles buscam compreender o que sinais ou proteínas podem ser largamente contribuindo para mudanças na migração celular na presença de diferentes tratamentos (i.e., arsênico)22.
Fibroblastos dérmicos neonatais humanos foram selecionados para este trabalho, com base no seu papel de destaque na cicatrização de feridas. No entanto, este protocolo de ensaio zero foi implementado usando vários tipos de células e para uma variedade de fins de pesquisa. Por exemplo, o ensaio de zero foi adotado no campo da oncologia para estudar a inibição da migração de drogas de quimioterapia23; para a migração de células do músculo esquelético, proliferação e difusão24; para estudar o efeito de extratos vegetais na migração celular25; e para entender como a proliferação e migração de queratinócitos contribuem para ferida cura9. Além disso, um papel anterior por Pinto et al avaliou os efeitos do urânio (U) e plasma rico em plaquetas (PRP) na migração de hDFn usando o ensaio zero6. O objetivo deste trabalho foi compreender a extensão a que este ensaio poderia testar o efeito de um agente pensado para retardar a migração celular (U), bem como um agente pensado para acelerar a migração celular (PRP). Como pode ser visto no trabalho acima mencionado e pesquisa por outros investigadores, aplicação do ensaio zero tem alto potencial para uso em vários modelos experimentais26. Apesar do detalhe fornecido dentro os métodos, a variância deve ser esperada entre investigadores e experimentos. Por exemplo, taxas de migração celular provavelmente irão variar com base na linha de celulares em uso, além dos micronutrientes necessários necessários para tipos exclusivos de célula. Muitas das observações importantes para auxiliar na viabilidade e rendimento de célula são listadas como notas ao longo do presente protocolo. No entanto, é altamente recomendável que os investigadores seguem as recomendações do fabricante para condições de crescimento ideal e para usar esse método como instrução complementar para trabalho de cultura celular geral.
Embora o risco é extremamente versátil para estudo da atividade celular; enviesamentos imprevistos podem surgir em técnicas de medição. Por exemplo, ao usar o ImageJ para traçar manualmente as frentes de migração celular, variação que pode existir entre os usuários, que podem limitar a precisão e a coleta de dados representativos. Também deve ser notado que as frentes de migração devem ser lido cegos para o tratamento para minimizar o viés de usuário. Além disso, manualmente identificar frentes de migração pode resultar em erro de cálculo da distância média percorrida devido à formação de pseudopod por células e a sua capacidade para chegar a adesões de forma focal, que podem ser visualmente enganosas. Da mesma forma, o uso de fluorescentes "rastreador de celular" corantes na superfície de células ou proteínas nucleares para detectar migração involuntariamente podem fixar células resultando em imprecisões ao medir a migração celular ao longo do tempo. É recomendável que os controlos adequados em positivos ou negativos estar matriculado dentro do experimento para avaliar completamente o efeito do tratamento sobre as linhas de célula. Prática deste ensaio deve ser concluída em reconhecimento de suas limitações. Este ensaio não garante que os resultados de migração celular obtidos através da experimentação em vitro diretamente se traduzirá na vivo resultados. Ferida a migração celular e cura em um sistema complexo vivo envolve uma infinidade de tipos de células e sinais moleculares; cada qual tem o potencial para influenciar as respostas de curativas.
Em resumo, o ensaio de zero foi encontrado para fornecer a seleção da elevado-produção de migração celular em resposta às mudanças ambientes6,25. Especificamente utilizamos este protocolo para detectar com sucesso as mudanças na migração celular como resultado de exposição ao arsênico em várias doses ambientalmente relevantes. Estes dados forneceram a justificativa para usar o ensaio de zero para mais estudo e avaliar os caminhos mecanicistas da migração celular neste ensaio e como estes caminhos são alterados por exposição ao arsênico.

Cicatrização de feridas é composto de uma série complexa de sobreposição de etapas que envolvem vários tipos de células, moléculas sinalizadoras e matriz extracelular componentes1. Juntos, esses componentes trabalham em conjunto para alcançar a resolução de ferida ou reparação, que acaba por conduzir à formação de uma cicatriz fibrótica protetora dependendo do grau de trauma1. Para capturar os processos individuais e funções da ferida em uma experiência de cura é difícil; etapas individuais dentro da processo de cicatrização de feridas precisam de ser identificados e testados separadamente. Entre as muitas etapas da cicatrização de feridas, o processo de migração celular foi considerado crítico ao avaliar cura taxas2. Migração celular pode ser observada em todas as fases da cicatrização de feridas e, portanto, necessita de mais compreensão de como alterações a migração celular podem afetar o fechamento da ferida. Por exemplo, migração celular é vista em ambos inflamação fase precoce e tardia, com sangue coagulação e agregação plaquetária ferida local3. Esses eventos evitar perda excessiva de sangue, formando um bloqueio temporário para preencher áreas feridas desprovida de tecido3. Plaquetas na circulação serão sintetizam e segregam vasoativas mediadores junto com Fatores Quimiotáticos, qual sinal junto para migração inflamatória dos leucócitos (glóbulos brancos) no tecido ferido para reparar4. Re-epitelização ocorre dentro de horas de lesão tecidual e envolve cobrindo o local da ferida através de atividade e migração de queratinócitos epiteliais de evitar a contaminação ou invasão de partículas estranhas ao ferimento local2. Estes exemplos capturam somente alguns da migração celular muitas funções associadas com cicatrização de feridas.
O ensaio de zero foi descrito e usado para compreender melhor a migração celular e seus muitos papéis em5,6de cicatrização de feridas. Este ensaio é considerado simplista, proporciona alta produtividade e permite que o investigador coletar dados de migração de células representativas. Ensaios de migração com sucesso têm demonstrado que certos compostos podem acelerar ou retardar a taxa de migração celular6. Além disso, estes resultados de ensaio fornecem translacional informação fisiológica que pode ser usada para formular tratamentos alvo, dosagem de concentrações e genes de interesse antes da experimentação na vivo . O ensaio requer técnicas de cultura de célula básica e suprimentos, uma linha de celular de escolha e tecnologia de imagem para capturar o movimento ao longo do tempo ou movimento em resposta aos tratamentos.
O ensaio pode ser facilmente manipulado ou adaptado para satisfazer as necessidades do investigador. No entanto, existem quatro perguntas básicas a considerar antes da experimentação. Que pergunta geral ou específico (s) é (é) o investigador tentando responder? Isto prende verdadeiro para a maioria das hipóteses conduzido pesquisas; no entanto, é fundamental para este ensaio porque, irá determinar muitos dos parâmetros necessários para precisão e responder completamente as questÃ µ es. Que linha de células ou linhas de células (se vários) devem ser usados para representar o sistema fisiológico sendo estudado? Por exemplo, em um cutâneo ferida cura estudo de células-tronco8, fibroblastos dérmicos5,6,7, ou queratinócitos epidérmicos9 pode ser considerado para representar populações de células que normalmente são encontradas em abundância na pele tecido10. Alternativamente, os neutrófilos, macrófagos ou outras células inflamatórias poderiam ser avaliadas neste sistema para representar a migração celular dos outros componentes da cicatrização de feridas na pele tecido10. Além disso, identificar a linha de célula específica sendo avaliada ajudará a identificar quais os reagentes são ideais para usar para promover a atividade metabólica celular. Como será a migração celular rastreado/fotografada? Há um número de técnicas utilizadas para observar a migração celular dentro de um balão ou placa. Por exemplo, tingimento ou fluorescente marcação de células e usando fluorescência ou imagem latente confocal para rastrear as células fornecem um contraste forte, o que permite que o investigador definir claramente o celular vs não-celulares locais e movimento celular11 . Outra técnica comum, descrita no presente estudo, é o uso da microscopia de luz invertido com contraste de fase6,7. Esta alternativa aos corantes de célula e fluorescência permite ao usuário viver faixa células sem ter que corrigir terminalmente células antes da imagem e também permite a captura de imagens dos mesmos poços individuais contendo feridas monocamadas de células através de pontos de tempo. As medidas que resultado serão usado para análise? Usando as imagens recolhidas ao longo do estudo, dados podem ser gerados em que alterações em taxas de migração celular podem ser entendidas. Em nosso laboratório, microscópicas imagens capturadas sobre o microscópio invertido são enviadas para o software de análise de imagem e o fechamento da ferida por cento e resumiu a área sob a curva (AUC) são calculados.
Destacaremos o uso específico deste teste para elucidar alterações à migração de fibroblastos dérmicos na presença de um contaminante ambiental conhecido, arsênico. Arsênio é um metaloide ocorre naturalmente encontrado dentro da crosta terrestre. Foram encontrados vários locais com níveis elevados de arsênico, que constitui um risco para os indivíduos que vivem perto desses locais. Como resultado, fontes de alimento e água foram mostradas para ter aumentado os níveis de contaminação de arsênio, que aumenta a probabilidade para que os indivíduos se tornam expostos ao arsênico. Exposição ao arsênico ambiental foi mostrada para ter consequências a longo prazo da saúde nas populações humanas acima ou até mesmo abaixo da atual agência de proteção ambiental dos Estados Unidos (USEPA) Max contaminante nível (MCL) de 10 ppb (10 µ g/L)12, 13. embora a USEPA estabeleceu este MCL e é considerado seguro para limites de consumo, as concentrações de arsénio que exceda esse limite não são incomuns em fontes de água em todo o mundo. Nos Estados Unidos do sudoeste, numerosos solo-água, água de poço e molas foram documentadas para conter sobre níveis de arsênico14. Por exemplo, no Vale Verde, AZ, Montezuma bem contém 210 de arsênico15µ g/L. Águas subterrâneas ao redor do Rio Verde, AZ contém 16 µ g/L de arsênico em média, com valores de pico, atingindo 1,3 mg/L de15,16. Notavelmente, a concentração de arsênio em muitos poços no galpão Rio Verde água excede 50 µ g/L,15,16. Com esse conhecimento, as concentrações de arsénio ambientalmente relevantes foram selecionados que vão abaixo o MCL no 0.1 µM (7,5 ppb), acima do MCL no 10 µM (750 ppb) na atual estudar14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 .
As informações recolhidas a partir dessas experiências serão usadas como um indicador precoce de potenciais alterações em taxas de migração celular em um na vivo ferida contaminado com arsênico. Depois, sinalização moléculas podem ser selecionadas com base em seu papel em facilitar a cicatrização de feridas e migração celular e futuro polimerase quantitativo reação em cadeia (qPCR) baseado gene expressão experimentos podem ser instituídos após a conclusão da corrente estudos. Se taxas de migração neste ensaio alterar na presença de arsénio, alvos de genes específicos envolvidos na migração celular podem ser o alvo para efeitos deletérios de arsênico e assim podem ser o mecanismo de interrupção.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Class II A/B3 Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td>15201-816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile Gloves</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>55082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Precision</td>
			<td>Model 182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Q080318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPR Centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>349702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Scale</td>
			<td>Ohaus</td>
			<td>I093 1125062111P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighting paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>H351125781212A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biohazard bags</td>
			<td>Fisherbran</td>
			<td>01-830A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Jacketed CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>309739-31053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10566-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Pipettor</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>140685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p200 Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p20 Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denominator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D59707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 tissue flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430725U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tube</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-539-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Marker</td>
			<td>Securline</td>
			<td>92167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wipes</td>
			<td>Kintech</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>63-67-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Filter Pipet Tips</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>16160210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Great Value</td>
			<td>220-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovial Rack</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>5030-0505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Gizmo Supply</td>
			<td>B00SCOGY56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube Rack</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waste Beaker</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Edge Ruler</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human neonatal dermal fibroblasts (hDFn)</td>
			<td>lot: 1734, 2902</td>
			<td>106-05n</td>
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in vitro scratch assay to demonstrate effects of arsenic on skin cell migration

Compreender os mecanismos fisiológicos de cicatrização de feridas tem sido o foco da investigação em curso há muitos anos. Esta pesquisa diretamente se traduz em alterações em padrões clínicos utilizados no tratamento de feridas e diminuir a morbidade e mortalidade para pacientes. Cicatrização de feridas é um processo complexo que requer a função e interação estratégica de célula e tecido. Uma das muitas funções criticamente importantes da cicatrização é individual e coletiva de migração celular. Após lesão, várias células do sangue, em torno de tecidos conjuntivo e epiteliais rapidamente migram para o local da ferida por meio de estímulos químicos e/ou físicos. Esta resposta de migração pode ditar em grande parte os resultados e o sucesso de uma cura ferida. Compreender esta função celular específica é importante para a medicina translacional que pode levar a ferida melhorou os resultados de cura. Aqui, descrevemos um protocolo usado para compreender melhor a migração celular no que tange a cicatrização de feridas, e como as mudanças no ambiente celular podem alterar significativamente este processo. Neste estudo de exemplo, fibroblastos dérmicos foram cultivados em meios suplementados com soro fetal bovino (FBS) como culturas monocamada em frascos de cultura de tecidos. As células foram assepticamente transferidas para placas de cultura de tecidos tratada 12-poços e crescidas a confluência de 100%. Ao atingir a confluência, as células a monocamada foram riscadas verticalmente usando uma ponta da pipeta p200. Arsénio diluído em meio de cultura suplementado com FBS foi adicionado para poços individuais no ambientalmente relevantes doses variando de 0.1-10 M. imagens foram capturadas a cada 4 horas (h) durante um período de 24 h, usando um microscópio invertido observar a migração celular (ferida encerramento). Imagens foram analisadas individualmente usando software de análise de imagem, e por cento ferida encerramento foi calculado. Os resultados demonstram que o arsênico retarda cicatrização de feridas. Esta técnica fornece uma rápida e barata a primeira tela para avaliação dos efeitos dos contaminantes na cicatrização de feridas.

Tamanhos de amostra (n) para todos os grupos de tratamento foi de n = 28. As células foram cultivadas com sucesso seguintes técnicas assépticas e protocolos de laboratório (Figura 1). Uniformes arranhões foram observados em todos os grupos de tratamento com a largura zero média medindo 0,8 mm 0,4 mm (Figura 2). Grupos de controle tinham uma área média resumiu sob o valor de curva de 1,355.83; 0,01 µM como grupos de tratamento teve uma média somada a área sob o valor de curva de 1,366.21; 0.1 µM como grupos de tratamento teve uma média somada a área sob o valor de curva de 1,326.24, 1,0 µM como grupo de tratamento teve uma média somada a área sob o valor de curva de 1,295.10; e finalmente a 10 µM como grupo do tratamento tinha uma área média resumiu sob o valor de curva de 535.12, que foi estatisticamente menor em comparação com todos os outros grupos (p < 0,05) (Figura 3). R-programa para a análise estatística foi usado para executar uma ANOVA One-Way com um ajuste de post hoc de Tukey para determinar diferenças estatísticas entre os grupos de tratamento (p < 0,05).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58838/58838fig2.jpg"> Figura 2: zero representativo do ensaio imagens ao longo de um período de 20 h. Imagens de A-D representam migração celular de células de controle; imagens E-H representam migração celular de células contaminadas com 1,0 µM como; imagens-L representam migração celular de células contaminadas com 10 µM como. Por essas imagens, é evidente que a migração celular é retardada na presença de arsênico. As imagens de controle mostram um arranhão completamente "curado" depois de 20 h, enquanto os outros dois grupos como tratamento não foram "curados". A 10 µM como tratamento inibiu o encerramento total completamente após 24 h. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58838/58838fig2large.jpg" target="_blank">, por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58838/58838fig3.jpg"> Figura 3: Arsênico atrasa a migração celular no ensaio zero. Imagens foram capturadas durante um período de 24 h para observar alterações em taxas de migração celular na presença de diferentes concentrações de arsênico. Imagens RAW foram analisadas utilizando um software automatizado (por exemplo, em MATLAB), qual largura da ferida inicialmente medido, calculado em seguida encerramento por cento e, finalmente, a área sob a curva (AUC). Barras de erro representam o erro padrão da média. A 10 µM como grupo do tratamento estatisticamente diminuiu a migração celular de humanas fibroblastos dérmicos neonatais (hDFn), indicado por um valor AUC estatisticamente inferior, em comparação com todos os outros grupos de tratamento usando uma One-Way ANOVA com um ajuste de post hoc de Tukey (p < 0,05). Diferenças estatísticas são representadas pelas letras "A" e "B", que foram obtidos usando o método de visualização de carta compacto disponível no R-programa. Tratamentos que não compartilham uma carta comum são estatisticamente significantes do outro (p < 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58838/58838fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration

In Vitro Arranhar o ensaio para demonstrar os efeitos de arsênico na migração de células de pele

Este estudo centra-se em um modelo em vitro de ferida cura (zero ensaio) como um mecanismo para determinar contaminantes como ambientais tais como migração celular de influência de arsênico. Os resultados demonstram que este ensaio in vitro fornece indicações rápidas e precoce de alterações à migração celular antes da experimentação na vivo .

Understanding the physiologic mechanisms of wound healing has been the focus of ongoing research for many years. This research directly translates into ...

A migração celular é um processo crítico de cicatrização de feridas que pode alterar drasticamente o resultado de uma ferida cicatrizante. Este protocolo permite que os pesquisadores entendam melhor o efeito de vários compostos na migração celular durante a cicatrização de feridas. O que muitas vezes pode levar a estratégias de tratamento direcionadas para a medicina clínica.O ensaio de arranhões é uma abordagem econômica e de alto rendimento para gerar dados significativos de cicatrização de feridas antes de testes in vivo caros e demorados. O ensaio de arranhões como método é particularmente relevante em aplicações de cicatrização de feridas. Mais especificamente, a pele.No entanto, o ensaio é realmente um ensaio de migração, e pode ser aplicado a qualquer tipo de célula onde a migração de células é de interesse para medir ou capturar. Semelhante à cultura clássica de células e tecidos, procedimentos operacionais padrão, treinamento, técnica e prática, prática, prática. Essas são a chave para o sucesso com o ensaio de arranhões.Demonstrando o procedimento estarão Nathan Cruz, um estudante de mestrado, e Oscar Lujan, pesquisador de graduação. Para iniciar este procedimento, prepare o gabinete de biossegurança II usando uma solução aquosa isopropílico de 70% para realizar um lenço de saneamento, começando nas paredes traseira e lateral, e trabalhando até a placa base. Limpe também todos os materiais que serão usados no ensaio antes de colocá-los no armário.Em seguida, obtenha frascos contendo a linha celular criopreservada desejada, e coloque um em um banho de água de um centímetro de profundidade a 37 graus Celsius para descongelar. Adicione 10 mililitros de médio suplementado com 10% FBS em um frasco de cultura de tecido T75. Abra o frasco contendo o caldo celular e aspire cuidadosamente a solução.Em seguida, transfira as células para o frasco T75. Remova um mililitro de mídia do frasco, e transfira-o de volta para o frasco, e depois transfira-o de volta para o frasco para maximizar o rendimento da célula do frasco. Aperte a tampa do frasco e balance-a suavemente para dispersar uniformemente as células em suspensão por toda a superfície.Depois disso, rotule o frasco com as informações aqui mostradas, e coloque-o em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 72 horas. Primeiro, recupere o frasco de cultura tecidual da incubadora e observe as células aderidas conforme descrito no protocolo de texto. Aspire todo o volume de mídia do frasco e transfira-o para um recipiente de lixo.Adicione cinco mililitros de solução de sal balanceada ao frasco, e balance-o suavemente para enxaguar qualquer excesso de mídia, células mortas ou resíduos. Em seguida, remova todo o volume de solução de sal do frasco e descarte-o em um recipiente de resíduos. Em seguida, adicione dois mililitros de trippsina ao frasco, e balance-o suavemente para dispersar a enzima sobre as células aderidas.Certifique-se de que a superfície aderente está completamente saturada, e coloque o frasco de tecido na incubadora por dois a três minutos. Depois disso, toque suavemente na lateral do frasco três a cinco vezes para ajudar a facilitar o descolamento celular. Limpe o frasco com 70% de álcool, e coloque-o no armário de biossegurança.Adicione cinco mililitros de mídia de estoque ao frasco de tecido para parar a reação do substrato da enzima. Aspire todo o volume de fluido do frasco, e transfira-o para um tubo cônico estéril de 15 mililitros. Centrifugar a 200 vezes g e a 25 graus Celsius por cinco minutos.Em seguida, use 70% de álcool para limpar o tubo contendo as células pelleted, e colocá-lo dentro do armário de biossegurança. Pipeta fora da mídia, deixando para trás aproximadamente 250 microliters de fluido com a pelota celular. Execute a parte inferior do tubo cônico através das ranhuras de frasco de um rack de tubo de microcentrifuuge para criar uma vibração rápida e perturbar e resuspendar a pelota celular.Quando concluída corretamente, a nova solução celular aparecerá como uma mistura nublada sem pelotas restantes. Adicione dois mililitros de mídia à ressuspensão celular. Pipeta as células suavemente para cima e para baixo na lateral do tubo 20 vezes para quebrar qualquer aglomerado.E registo o volume total de suspensão celular. Em seguida, use uma pipeta estéril para adicionar 20 microliters de estoque azul trypan a um poço vazio de uma placa de 96 poços. Usando uma ponta de pipeta estéril, transfira 20 microliters de estoque celular do tubo de 15 mililitros para o poço que contém a solução azul trypan.Pipeta suavemente para misturar o conteúdo e transferir 10 microliters da mistura entre o deslizamento da tampa e a câmara de contagem em um hemócito. Conte apenas as células no centro e quatro quadrados de canto, contando separadamente tanto a contagem total de células quanto a contagem de células não viáveis para os cinco quadrados identificados. Depois de calcular a contagem de células viável, marque uma linha horizontal na parte inferior de uma placa de 12 poços para servir como marca de referência durante a imagem.Diluir o estoque celular com mídia para uma densidade de 19.000 células por mililitro. Em seguida, semeou cada poço da placa de 12 poços com um mililitro do estoque celular diluído, misturando o estoque celular periodicamente para garantir até mesmo a semeadura celular em todos os 12 poços. Rotule cada placa com as informações mostradas aqui.E colocá-lo em uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono até que as células cresçam até 100% de confluência. Recupere uma placa de 12 poços com células da incubadora. Usando um microscópio com um objetivo de 10x, observe as células e determine a confluência dentro de cada poço.Em seguida, aspirar e eliminar a mídia de crescimento de cada poço. Monte uma pipetter P200 com uma ponta estéril de 1-200 microliteres. Em cada poço, deslize a ponta da pipeta através da superfície celular do local das 12:00 até o local das 6:00 para produzir uma ferida simulada de arranhão.Enxágüe cada poço com um mililitro de solução de sal balanceada para limpar o excesso de detritos e aglomerados celulares. Balance a placa de um lado para o outro para facilitar a lavagem. Em seguida, remova e descarte a solução de sal balanceada de cada poço.Usando um pipetter P1000 com uma ponta de 1.000 microliteres, adicione 1.000 microliters dos estoques de arsênico preparados em poços que foram aleatoriamente atribuídos com um grupo de tratamento. Use uma nova ponta de pipeta para cada poço e registe o tempo em que os tratamentos são adicionados. Incubar as placas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.Para imaginar as placas, capture imagens de cada poço em 10x de ampliação objetiva a cada quatro horas durante um período de 24 horas. Consulte a linha anteriormente desenhada na parte inferior da placa para imaginar o mesmo local ao longo do arranhão dentro de cada poço em cada ponto de tempo. Neste estudo, um ensaio de teste de risco in vivo é usado para observar os efeitos do arsênico na migração celular.Arranhões uniformes são observados em todos os grupos de tratamento, com uma largura média de risco de aproximadamente 0,8 milímetros. As células de controle mostram um arranhão completamente curado após 20 horas. Os dois grupos de arsênico não mostram esse nível de cura.Com o tratamento de 10 micromolar inibindo o fechamento por 24 horas. Esses resultados demonstram que a presença de arsênico retarda a migração celular. As imagens brutas capturadas durante o ensaio são analisadas usando software automatizado para medir a largura da ferida, depois calcular o fechamento percentual e, finalmente, calcular a área sob a curva.O grupo de tratamento de 10 micromolares mostra migração celular estatisticamente retardada de fibroblastos deérmicos neonatais humanos em comparação com todos os outros grupos de tratamento. É importante praticar minuciosamente essa técnica para aumentar a consistência ao coçar as células. A variabilidade não intencional entre os ensaios pode potencialmente distorcer dados e alterar conclusões.Outras técnicas moleculares, como a reação quantitativa da cadeia de polimerase e ensaios imunosorbentes ligados à enzima podem ser empregadas em ensaios pós-risco para identificar sinais mensageiros e proteínas que podem ser o alvo para mudanças na migração celular observadas no ensaio. Este ensaio contribuiu para a compreensão dos pesquisadores sobre metástase do câncer, novas terapias emergentes de câncer, células-tronco e medicina regenerativa, e muitos outros marcos científicos.

Research

JoVE Journal

Environment

In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration

Exploring the Effects of Atmospheric Forcings on Evaporation: Experimental Integration of the Atmospheric Boundary Layer and Shallow Subsurface

Explorando os efeitos de forçantes atmosféricas sobre evaporação: Integração Experimental da Camada Limite Atmosférica e Raso Subsurface

Evaporation is directly influenced by the interactions between the atmosphere, land surface and soil subsurface. This work aims to experimentally study ...

Ambiente

A CO2 Concentration Gradient Facility for Testing CO2 Enrichment and Soil Effects on Grassland Ecosystem Function

A CO2 Concentration Gradient Facility for Testing CO2 Enrichment and Soil Effects on Grassland Ecosystem Function

A CO<sub&gt; 2</sub&gt; Facility Concentração Gradiente para Teste CO<sub&gt; 2</sub&gt; Enriquecimento do solo e efeitos sobre a função da pastagem de Ecossistemas

Continuing increases in atmospheric carbon dioxide concentrations (CA) mandate techniques for examining impacts on terrestrial ecosystems. Most ...

A Flow-through Exposure System for Evaluating Suspended Sediments Effects on Aquatic Life

Um Sistema de Exposição Fluxo através de sedimentação de Efeitos Avaliando suspensos sobre a vida aquática

This paper describes the Fish Larvae and Egg Exposure System (FLEES). The flow-through exposure system is used to investigate the effects of suspended ...

Determination of Inorganic Arsenic in a Wide Range of Food Matrices using Hydride Generation - Atomic Absorption Spectrometry.

Determinação de arsênio inorgânico em uma ampla gama de alimentos matrizes usando a geração de hidreto - espectrometria de absorção atômica.

The European Food Safety Authority (EFSA) underlined in its Scientific Opinion on Arsenic in Food that in order to support a sound exposure assessment to ...

Protocol for Assessing the Relative Effects of Environment and Genetics on Antler and Body Growth for a Long-lived Cervid

Protocolo para avaliar os efeitos relativos do ambiente e da genética na galhada e no crescimento corporal de um cervídeo de vida longa

Cervid phenotype can be placed into one of two categories: efficiency, which promotes survival over extravagant morphometric growth, and luxury, which ...

Preparation of DMMTAV and DMDTAV Using DMAV for Environmental Applications: Synthesis, Purification, and Confirmation

Preparation of DMMTAV and DMDTAV Using DMAV for Environmental Applications: Synthesis, Purification, and Confirmation

Preparação de DMMTAV DMDTAV usando DMAV para aplicações ambientais: síntese, purificação e confirmação

Dimethylated thioarsenicals such as dimethylmonothioarsinic acid (DMMTAV) and dimethyldithioarsinic acid (DMDTAV), which are produced by the metabolic ...

Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA

Coleta e extração de ar ocupacional amostras para análise de DNA fúngico

Traditional methods of identifying fungal exposures in occupational environments, such as culture and microscopy-based approaches, have several ...

An Experimental Protocol for Studying Mineral Effects on Organic Hydrothermal Transformations

Um protocolo Experimental para estudar efeitos Mineral sobre transformações hidrotermais orgânicos

Organic-mineral interactions are widely occurring in hydrothermal environments, such as hot springs, geysers on land, and the hydrothermal vents in the ...

Composition and Distribution Analysis of Bioaerosols Under Different Environmental Conditions

Composição e análise da distribuição de Bioaerossóis sob diferentes condições ambientais

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, ...

Removal of Arsenic Using a Cationic Polymer Gel Impregnated with Iron Hydroxide

Remoção de arsênico usando um gel de polímero catiônico impregnado com hidróxido de ferro

In this work, we prepared an adsorbent composed of a cationic polymer gel containing iron hydroxide in its structure designed to adsorb arsenic from ...