Name: in vitro scratch assay to demonstrate effects of arsenic on skin cell migration
Uploaded: 2019-02-23T13:00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration at JoVE.com

Исследования в этой публикации было поддержано национального института здоровья меньшинств и неравенства в области здравоохранения национальных институтов здоровья под награду номер U54MD012388. Содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения национальных институтов здоровья.

<ol>
	<li>Diegelmann, R., Evans, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing:+an+overview+of+acute,+fibrotic+and+delayed+healing.">Wound healing: an overview of acute, fibrotic and delayed healing.</a> Frontiers in BioScience. 9, 283-289 (2004).</li><li>Braiman-Wiksman, L., Solomonik, I., Spira, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+into+wound+healing+sequence+of+events.">Novel insights into wound healing sequence of events.</a> Toxicologic Pathology. 35, 767-779 (2007).</li><li>Michelson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Platelets. , (2013).</li><li>Aikawa, M., Schoenbechler, M. J., Barbaro, J. F., Sadun, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+rabbit+platelets+and+leukocytes+in+the+release+of+histamine.+Electron+microscopic+observations.">Interaction of rabbit platelets and leukocytes in the release of histamine. Electron microscopic observations.</a> American Journal of Pathology. 63 (1), 85-98 (1971).</li><li>Liang, C., Park, A., Guan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+scratch+assay:+A+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro.">In vitro scratch assay: A convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nature Protocols. , 329-333 (2007).</li><li>Pinto, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bench-top+in+vitro+wound+assay+to+evaluate+wound+closure.+Applied.">A bench-top in vitro wound assay to evaluate wound closure. Applied.</a> In Vitro Toxicology. 2 (3), 151-156 (2016).</li><li>Pinto, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+mitigates+the+negative+effects+of+arsenic+contamination+in+an+in+vitro+wound+model.">Estrogen mitigates the negative effects of arsenic contamination in an in vitro wound model.</a> Applied In Vitro Toxicology. 4 (1), 24-29 (2018).</li><li>Roubelakis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-rich+plasma+(PRP)+promotes+fetal+mesenchymal+stem/stromal+cell+migration+and+wound+healing+process.">Platelet-rich plasma (PRP) promotes fetal mesenchymal stem/stromal cell migration and wound healing process.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 417-428 (2014).</li><li>Shibata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adiponectin+regulates+cutaneous+wound+healing+by+promoting+keratinocyte+proliferation+and+migration+via+the+ERK+signaling+pathway.">Adiponectin regulates cutaneous wound healing by promoting keratinocyte proliferation and migration via the ERK signaling pathway.</a> Journal of Immunology. 189 (6), 3231-3241 (2012).</li><li>Mendonca, R. J., Coutinho-Netto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+aspects+of+wound+healing.">Cellular aspects of wound healing.</a> Anais Brasileiros de Dermatologia. 84 (3), 257-262 (2009).</li><li>Beem, E., Segal, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+stability+and+sensitivity+of+cell+fluorescent+labels+when+used+for+cell+migration.">Evaluation of stability and sensitivity of cell fluorescent labels when used for cell migration.</a> Journal of Fluorescence. 23 (5), 975-987 (2013).</li><li>Gentry, P. R., Clewell, H. J., Greene, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+recent+advances+in+research+on+arsenic+cancer+risk+assessment.">The impact of recent advances in research on arsenic cancer risk assessment.</a> Regulatory Toxicology and Pharmacology. 69, 91-104 (2014).</li><li>Beamer, P. I., Klimecki, W. T., Loh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+children's+urinary+CC16+levels+with+arsenic+concentrations+in+multiple+environmental+media.">Association of children's urinary CC16 levels with arsenic concentrations in multiple environmental media.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health.pii: E521.2016:13. , (2016).</li><li>Robertson, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arsenic+in+ground-water+under+oxidizing+conditions,+southwest+United+States.">Arsenic in ground-water under oxidizing conditions, southwest United States.</a> Environmental Geochemistry and Health. 11, 3-4 (1989).</li><li>Foust, R. D., Mohapatra, P., Compton-O'Brian, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Groundwater+arsenic+in+the+Verde+Valley+in+central+Arizona,+USA.">Groundwater arsenic in the Verde Valley in central Arizona, USA.</a> Applied Geochemistry. 19, 251-255 (2004).</li><li>Uhlman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Arsenic in Arizona Ground Water: Source and Transport Characteristics. , (2008).</li><li>Agusa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+exposure+to+arsenic+from+drinking+water+in+Vietnam.">Human exposure to arsenic from drinking water in Vietnam.</a> Science of the Total Environment. , (2014).</li><li>Ayotte, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+temporal+variability+of+arsenic+in+groundwater+used+for+drinking+water+supply+in+the+United+States.">Factors affecting temporal variability of arsenic in groundwater used for drinking water supply in the United States.</a> Science of the Total Environment. , (2014).</li><li>Dummer, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geostatistical+modeling+of+arsenic+in+drinking+water+wells+and+related+toenail+arsenic+concentrations+across+Nova+Scotia,+Canada.">Geostatistical modeling of arsenic in drinking water wells and related toenail arsenic concentrations across Nova Scotia, Canada.</a> Science of the Total Environment. , (2014).</li><li>Sorg, T. J., Chen, A. S., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arsenic+species+in+drinking+water+wells+in+the+USA+with+high+arsenic+concentrations.">Arsenic species in drinking water wells in the USA with high arsenic concentrations.</a> Water Research. 48, 156-169 (2014).</li><li>Beamer, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+Children's+Urinary+CC16+Levels+with+Arsenic+Concentrations+in+Multiple+Environmental+Media.">Association of Children's Urinary CC16 Levels with Arsenic Concentrations in Multiple Environmental Media.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health. 13, (2016).</li><li>Pomari, E., Dalla Valle, L., Pertile, P., Colombo, L., Thornton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracrine+sex+steroid+synthesis+and+signaling+in+human+epidermal+keratinocytes+and+dermal+fibroblasts.">Intracrine sex steroid synthesis and signaling in human epidermal keratinocytes and dermal fibroblasts.</a> The FASEB Journal. 29 (2), 508-524 (2015).</li><li>Gotsulyak, Y., Kosach, R., Cherednyk, V., Tykhonkova, O., Khoruzhenka, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+cell+motility+evaluation+in+scratch+assay.">Optimization of cell motility evaluation in scratch assay.</a> Biopolymers and Cell. 30, 223-228 (2014).</li><li>Goetsch, K. P., Niesler, C. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+scratch+assay+for+in+vitro+skeletal+muscle+wound+healing+analysis.">Optimization of the scratch assay for in vitro skeletal muscle wound healing analysis.</a> Analytical Biochemistry. 411, 158-160 (2011).</li><li>Harishkumar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+the+mechanism+of+in+vitro+wound+healing+properties+of+citrus+tamurana+extract.">Revealing the mechanism of in vitro wound healing properties of citrus tamurana extract.</a> BioMed Research International. 13, (2013).</li><li>Johnston, S. T., Simpson, M. J., McElwain, D. L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+much+information+can+be+obtained+from+tracking+the+position+of+the+leading+edge+in+a+scratch+assay?.">How much information can be obtained from tracking the position of the leading edge in a scratch assay?.</a> Journal of the Royal Society Interface. 11, 1-9 (2014).</li></ol>

Авторы не имеют ничего сообщать.

Применение этот assay обеспечивает высокой пропускной способностью и своевременной оценки клеточной миграции и может непосредственно перевод сложных физиологических систем5,6,7. По этой причине предлагаемых скамейка топ-модель настроены и практикуется для оценки воздействия различных терапевтических агентов и токсинов окружающей среды на6ранозаживляющее. Концентрации мышьяка, используемых в текущем исследовании были сочтены экологически значимых через обширную литературу Поиск известных концентрациях и от ретроспективный обзор различных данных баз14,15, 16,,1718,19,,2021. Использование этого в vitro скретч пробирного показал что воздействие концентрации мышьяка в высокий, но экологически значимых диапазон, задержка закрытия РАН (клеточной миграции).
Это скамейке топ-модель также использовалась изолировать и изучения отдельных клеток линии (фибробласты) для более глубокого понимания как миграции фибробластов способствует раны лечебные результаты. Кроме того трудно изучить функции отдельной ячейки линии в комплекс в vivo системах со многими другими клеток и тканей в настоящее время, что может помешать с анализом. Кроме того assay предоставляет средства достижения полуколичественного процент рану закрытия данных, которые могут использоваться для целевых конкретных клеточных механизмов, через которые соединений может повлиять на заживление ран. Например, клетки, используемые в скретч assay может собраны и хранятся в желаемой реагента и используется в выражении гена (сигнал мРНК) или выражения протеина assays22. Эта информация может быть полезной для следователя, если они стремятся понять, какие сигналы или белков может во многом способствовать изменения в клеточной миграции при наличии различной обработки (то есть, мышьяк)22.
Фибробластов дермы новорожденных были выбраны для этой работы, основанной на их важную роль в заживлении ран. Однако, этот протокол assay скретч была выполнена с использованием различных типов клеток и для целого ряда научно-исследовательских целей. К примеру скретч assay была принята в области онкологии для изучения миграции ингибирование химиотерапии наркотиков23; для миграции клеток скелетных мышц, распространения и распространение24; изучить влияние экстрактов растений на клеточной миграции25; и чтобы понять как кератиноцитов миграции и пролиферации способствуют раны исцеления9. Кроме того предыдущий документ Пинто et al. оценивали воздействие уран (U) и тромбоцитов богатые плазмы (PRP) на hDFn миграции с помощью скретч пробирного6. Целью этой работы было понять степень, в которой этот assay может проверить действие агент считается медленным клеточной миграции (U), а также агента предполагается ускорить клеточной миграции (PRP). Как видно в вышеупомянутой работе и исследования других следователей, применение скретч assay имеет высокий потенциал для использования в различных экспериментальных моделей26. Несмотря на деталь, предоставленные в рамках методов следует ожидать разница между следователями и экспериментов. Например уровень клеточной миграции скорее всего будет колебаться по линии клетки используются, помимо необходимых микроэлементов, необходимых для типов уникальных клеток. Многие из важных наблюдений для помощи в ячейке урожайность и жизнеспособности перечислены как Примечания на протяжении настоящего Протокола. Однако настоятельно рекомендуется, что следователи следовать рекомендациям производителя оптимальные условия роста и использовать этот метод как дополнительные инструкции для общей клетки культуры работы.
Хотя царапин assay чрезвычайно разностороннего изучения клеточной активности; в измерительной техники могут возникнуть непредвиденные предубеждения. Например при использовании ImageJ вручную отслеживать фронтах миграции клеток, различия могут существовать среди пользователей, которые могут ограничить точность и репрезентативных данных коллекции. Следует также отметить, что миграция фронтах следует читать слепые обращения к минимуму предвзятость пользователя. Кроме того вручную определения миграции фронтах может привести к просчет среднее расстояние, пройденное за счет формирования pseudopod клеток и их способность выйти на форме фокуса спайки, которые могут быть визуально заблуждение. Подобным образом использование флуоресцентных «трекера ячейки» краски на поверхности клетки или ядерных белков для обнаружения миграции может непреднамеренно исправить клетки, что приводит к неточности при измерении клеточной миграции с течением времени. Рекомендуется, чтобы соответствующие позитивные или негативные элементы быть зачислены в рамках эксперимента, чтобы полностью оценить эффект лечения на линии клеток. Практика этот assay должны быть завершены в знак признания его ограничения. Этот assay не гарантирует, что клеточной миграции результаты, полученные от экспериментов в vitro непосредственно переведет в естественных условиях результаты. Рану исцеления и клеточной миграции в комплекс Живая система включает в себя множество типов клеток и молекулярные сигналы; Каждый из которых имеет потенциал, чтобы повлиять исцеления ответы.
В резюме была обнаружена скретч assay для предоставления высокопроизводительного скрининга клеточной миграции в ответ на изменения среды6,25. Мы специально использовали этот протокол успешно обнаружить изменения в клеточной миграции вследствие воздействия мышьяка в различных экологически значимых дозах. Эти данные предоставили обоснование использования скретч assay для дальнейшего изучения и оценки механистический путей клеточной миграции в этот assay и как эти тропы изменяются под воздействием мышьяка.

Заживление ран состоит из сложных серии перекрывающихся шаги, которые включают различные типы клеток, сигнальных молекул и внеклеточного матрикса компонентов1. Вместе эти компоненты работают вместе для достижения резолюции рану или ремонта, который в конечном итоге приводит к образованию защитного фиброзный рубец зависит от степени травмы1. Чтобы захватить отдельных процессов и функций раны исцеление в одном эксперименте трудно; отдельные шаги в рамках процесса заживления раны должны быть определены и испытаны отдельно. Среди многих шагов, заживления ран процесс клеточной миграции считается критическим при оценке лечебные курсы2. Клеточной миграции можно наблюдать на всех стадиях заживления ран и таким образом требует дальнейшего понимания влияния изменения ячейки миграции закрытия раны. К примеру клеточной миграции рассматривается в обоих ранней и поздней фазы воспаления, с крови коагуляции и тромбоцитов агрегирование на рану сайт3. Эти события для предотвращения чрезмерной кровопотери формирования временного блокирования для заполнения раненых областей лишенный ткани3. Тромбоцитов в обращении будет синтезировать и выделяют вазоактивных посредников наряду с эозинофилов факторы, которые вместе сигнал для воспалительных лейкоцитарной миграции (белых клеток крови) для раненых ткани для ремонта4. Эпителизация происходит в течение часов после повреждения тканей и включает в себя покрытие на рану сайт через деятельность и миграцию эпителия кератиноцитов для предотвращения дальнейшего загрязнения или вторжения посторонних частиц на рану сайта2. Эти примеры захватить только несколько из многих миграции клеток, функций, связанных с заживление ран.
Царапинам assay описано и используется для лучше понять ячейки миграции и ее многих ролей в ранозаживляющее5,6. Этот assay считается упрощенным, обеспечивает высокой пропускной способности и позволяет следователю для сбора данных о миграции представитель ячейки. Анализов миграции успешно продемонстрировали, что некоторые соединения могут ускорить или замедлить скорость клеточной миграции6. Кроме того эти результаты анализа обеспечивают поступательное физиологические информацию, которая может использоваться для сформулировать цель лечения, дозирование концентрации и гены интереса до экспериментов в естественных условиях . Assay требует основные клеточные культуры технологии и материалы, клетки линии выбора и технологии визуализации для захвата движения по времени или движения в ответ на лечение.
Assay можно легко манипулировать или соответствующий потребностям следователя. Однако есть четыре основные вопросы для рассмотрения до экспериментов. Какие общие или конкретные вопрос(ы) является/являются investigator(s), пытаясь ответить? Это справедливо для большинства гипотезы инициативе исследования; Однако важно для этот assay, потому что он будет определять многие из параметров необходимо точно и полностью ответить на вопрос (ы). Какие ячейки строки или ячейки линии (если несколько) должны использоваться для представления изучаются физиологические системы? Например, в кожной раны исцеления исследование фибробластов дермы5,6,7, стволовых клеток8, или представлять клеточных популяций, которые обычно могут рассматриваться эпидермальных кератиноцитов9 в изобилии в ткани кожи10. Кроме того нейтрофилы, макрофаги или другие воспалительные клетки могут оцениваться в этой системе для представления ячеек миграции других компонентов заживления ран в ткани кожи10. Кроме того определение конкретных клеток линии оцениваются поможет определить, какие реагенты оптимально использовать для продвижения метаболической активности клеток. Как будет отслеживаться/образы миграции клеток? Существует ряд методов, используемых для наблюдения за миграции клеток в тарелку или настой. Например окраска или дневно пометки ячеек и использование флуоресценции или конфокальный изображений для отслеживания клеток обеспечивает сильный контраст, который позволяет следователю четко определить сотовой против неклеточное мест и клеточного движения11 . Другой распространенный метод, описанный в этом исследовании, является использование Перевернутый световой микроскопии с фазы контраст6,7. Это альтернатива клеток красителей и флуоресценции позволяет пользователю жить трек клетки без необходимости неизлечимо исправить клетки до изображений, а также позволяет для захвата изображений одного и того же отдельных скважин, содержащие раненых монослои клеток через время точки. Какие результаты меры будут использоваться для анализа? С помощью изображений, собрались на протяжении всего исследования, данные могут быть получены в котором может пониматься изменения уровня клеточной миграции. В нашей лаборатории микроскопические изображения, снятые на Перевернутый световой микроскоп, загруженные для анализа изображений программное обеспечение и вычисляется процент рану закрытия и суммируются площадь под кривой (AUC)).
Мы будем выделить конкретные использования этот assay для выяснения изменений для миграции фибробластов дермы в присутствии известных экологических загрязнений, мышьяка. Мышьяк является естественным металлоида найдены в земной коре. Различные места были обнаружены с повышенными уровнями мышьяка, который создает угрозу для лиц, проживающих вблизи этих мест. В результате продовольствия и воды источников было показано увеличили уровни загрязнения мышьяком, который увеличивает вероятность для людей, чтобы стать подвергается мышьяка. Воздействия окружающей среды мышьяком было показано, имеют долгосрочные последствия для здоровья в человеческих популяциях выше или даже ниже текущего агентства по охране окружающей среды Соединенных Штатов (АООС) Макс загрязнителем уровень (мкл) 10 ppb (10 мкг/Л)12, 13. Хотя АООС США этот MCL и считается безопасной для питья пределов, мышьяк концентрации, которые превышают этот лимит не являются редкостью в воде источников во всем мире. В юго-западной части Соединенных Штатов, многочисленные грунтовые воды, воду и источники были задокументированы содержат относительно уровня мышьяка14. Например в долине Верде, AZ, Монтесума также содержит 210 мкг/Л мышьяка15. Грунтовых вод вокруг реки Верде, AZ содержит 16 мкг/Л мышьяка в среднем, с максимальными значениями, достигнув 1,3 мг/Л,1516. В частности концентрации мышьяка в многие скважины в реку Верде водой сарая превышать 50 мкг/Л15,16. С этим знанием, экологически значимых концентраций мышьяка были отобраны, начиная снизу MCL на 0,1 мкм (7,5 млрд.), учиться выше ПДК в 10 мкм (750 млрд.) в текущем14,,1516 , 17 , 18 , 19 , 20 .
Информация, полученная из этих экспериментов будет использоваться как ранним признаком потенциальных изменений показателей клеточной миграции в в естественных условиях раны загрязненных мышьяком. Потом сигнальные молекулы могут быть выбраны на основе их роли в деле содействия заживления ран и клеточной миграции, и будущих количественных полимеразной цепной реакции (ПЦР) на основе гена выражение эксперименты могут быть созданы после завершения текущего исследования. Если уровень миграции в этот assay изменить в присутствии мышьяка, цели конкретных генов, участвующих в клеточной миграции может быть мишенью для вредного воздействия мышьяка и таким образом может быть механизмом нарушения.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Class II A/B3 Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td>15201-816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile Gloves</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>55082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Precision</td>
			<td>Model 182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Q080318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPR Centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>349702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Scale</td>
			<td>Ohaus</td>
			<td>I093 1125062111P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighting paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>H351125781212A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biohazard bags</td>
			<td>Fisherbran</td>
			<td>01-830A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Jacketed CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>309739-31053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10566-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Pipettor</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>140685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p200 Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p20 Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denominator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D59707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 tissue flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430725U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tube</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-539-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Marker</td>
			<td>Securline</td>
			<td>92167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wipes</td>
			<td>Kintech</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>63-67-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Filter Pipet Tips</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>16160210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Great Value</td>
			<td>220-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovial Rack</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>5030-0505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Gizmo Supply</td>
			<td>B00SCOGY56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube Rack</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waste Beaker</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Edge Ruler</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human neonatal dermal fibroblasts (hDFn)</td>
			<td>lot: 1734, 2902</td>
			<td>106-05n</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rstudio Statistical Software</td>
			<td></td>
			<td>ver: 3.5.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>NIH</td>
			<td>ver: 1.8.0_112</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro scratch assay to demonstrate effects of arsenic on skin cell migration

Понимание физиологические механизмы заживления ран был в центре внимания проводимых исследований на протяжении многих лет. Это исследование напрямую переводит в изменения в клинических стандартов, используемых для лечения ран и уменьшения заболеваемости и смертности для пациентов. Заживление ран — сложный процесс, который требует стратегического взаимодействия клеток и тканей и функции. Одна из многих критически важных функций заживления ран — индивидуального и коллективного клеточной миграции. После травмы Различные клетки из крови, окружающих связующих и эпителиальных тканей быстро мигрируют к месту раны путем химического и/или физические раздражители. Этот ответ миграции во многом может диктовать результаты и успех заживления раны. Понимание этой конкретной сотовой функция имеет важное значение для трансляционной медицины, которая может привести к улучшение заживления результатов. Здесь мы описываем протокол, используемый для лучше понять клеточной миграции, как он относится к заживление ран, и как изменения клеточной среды может значительно изменить этот процесс. В этом примере исследовании фибробласты дермы были выращены в СМИ, дополнена плода бычьим сывороточным (ФБС) как монослоя культур в колбах культуры ткани. Асептически клетки были переведены в тканевой культуры лечение 12-ну пластины и выросла до 100% слияния. Дойдя до слияния, клетки в монослое были вертикально почесал с помощью кончика пипетки p200. Мышьяк, разбавленных в культуре средств массовой информации с FBS был добавлен в отдельных скважин на экологически соответствующие дозы диапазоне 0.1-10 м. изображения были захвачены каждые 4 часа (h) в течение 24 ч с помощью Перевернутый световой микроскоп, соблюдать клеточной миграции (ранение закрытие). Изображения индивидуально анализировались с помощью программного обеспечения для анализа изображений, и процент ушивание была рассчитана. Результаты показывают, что мышьяк замедляет заживление ран. Этот метод обеспечивает быстрый и недорогой первый экран для оценки воздействия загрязнителей на заживление ран.

Размеры выборки (n) для всех групп лечения был n = 28. Клетки были успешно культивировали следующие методы асептики и протоколы лаборатории (рис. 1). Единой царапины наблюдались во всех группах лечения средняя нуля шириной 0,8 мм, 0,4 мм (рис. 2). Контрольные группы имели средний суммируются площадь под кривой значение 1,355.83; 0,01 мкм как группы лечения в среднем приходилось подвел площадь под кривой значение 1,366.21; 0,1 мкм как группы лечения среднем подвел площадь под кривой значение 1,326.24, 1,0 мкм как группы лечения в среднем приходилось подвел площадь под кривой значение 1,295.10; и наконец 10 мкм как лечение группа имела средний суммируются площадь под кривой значение 535.12, которое было статистически ниже по сравнению с другими группами (p < 0,05) (рис. 3). R-программа для статистического анализа была использована для запуска односторонний дисперсионный анализ с Тьюки пост специальной регулировки для определения статистических различий между группами лечения (p < 0,05).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58838/58838fig2.jpg"> Рисунок 2: представитель нуля пробирного изображения в течение 20 ч. Изображение A-D представляют клеточной миграции клеток контроля; изображения E-H представляют клеточной миграции клеток, загрязненные 1.0 мкм изображения-L представляют клеточной миграции клеток, загрязненные 10 мкм как. Из этих образов становится ясно, что клеточной миграции замедляется в присутствии мышьяка. Элемент управления изображения показывают полностью «исцеление» нуля после 20 h, в то время как две другие группы как лечение не были «исцеление». 10 мкм лечения препятствует полное закрытие altogether после 24 ч. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58838/58838fig2large.jpg" target="_blank">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58838/58838fig3.jpg"> Рисунок 3: мышьяк замедляет клеточной миграции в скретч assay. Изображения были захвачены в течение 24 h наблюдать изменения в уровень клеточной миграции при наличии различной концентрации мышьяка. RAW изображений были проанализированы с использованием автоматизированного программного обеспечения (например, в программе MATLAB), ширина которой первоначально измеренной рану, затем рассчитывается процент закрытия и, наконец, площадь под кривой (AUC)). Планки погрешностей представляют Среднеквадратичная ошибка среднего значения. 10 мкм, как лечение группы статистически замедлился клеточной миграции дермального фибробластов новорожденных (hDFn), показано статистически меньшее значение AUC, по сравнению с всеми другими группами лечения с помощью односторонний дисперсионный анализ с регулировкой, должность Специального Тьюки (p < 0,05). Буквы «A» и «B», которые были получены с помощью метода Compact письмо отображения доступных в R-программы представлены статистические различия. Процедуры, которые не разделяют общее письмо статистически друг от друга (p < 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58838/58838fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration at JoVE.com

In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration

В пробирке Поцарапать Assay для демонстрации воздействия мышьяка на миграции клеток кожи

Это исследование фокусируется на модель в vitro рану исцеления (царапинам assay) как механизм для определения как экологических загрязнителей, таких как мышьяк влияние клеточной миграции. Результаты показывают, что этот assay в пробирке обеспечивает быстрое и ранние признаки изменения клеточной миграции до экспериментов в естественных условиях .

Understanding the physiologic mechanisms of wound healing has been the focus of ongoing research for many years. This research directly translates into ...

Сотовая миграция является критическим процесс заживления ран, который может кардинально изменить исход заживления раны. Этот протокол позволяет исследователям лучше понять влияние различных соединений на клеточной миграции во время заживления ран. Что часто может привести к целенаправленным стратегиям лечения клинической медицины.Анализ царапин является экономически эффективным и высокой пропускной способностью подход для создания значимых данных заживления ран до дорогостоящих и трудоемких in vivo тестирования. Анализ царапин как метод особенно актуален в приложениях для заживления ран. В частности, кожа.Тем не менее, анализ действительно является миграционным анализом, и может быть применен к любому типу клеток, где миграция ячеек представляет интерес для измерения или захвата. Подобно классической клеточной и тканевой культуре, стандартным операционным процедурам, тренировкам, технике и практике, практике, практике. Это ключ к успеху с нуля анализа.Демонстрация процедуры будет Натан Круз, студент магистратуры, и Оскар Луджан, студент исследователь. Чтобы начать эту процедуру, подготовить биобезопасность II кабинет с использованием 70%isopropyl aqueous решение для выполнения санитарии протрите, начиная с задней и боковой стенок, и работает до базовой панели. Также протрите все материалы, которые будут использоваться в анализе, прежде чем поместить их в шкаф.Далее, получить флаконы, содержащие желаемую криоконсервированную линию клеток, и поместите один в один сантиметр-глубокую водяную ванну при 37 градусах по Цельсию, чтобы оттаять. Добавьте 10 миллилитров среды, дополненных 10%FBS, в колбу культуры ткани T75. Откройте флакон, содержащий клеточный бульон, и тщательно аспирировать раствор.Затем перенесите клетки в колбу T75. Удалите один миллилитр мультимедиа из колбы и перенесите его обратно во флакон, а затем перенесите его обратно в колбу, чтобы максимизировать выход ячейки из флакона. Затяните крышку колбы и аккуратно потрясите ее, чтобы равномерно разогнать клетки в подвеске по всей поверхности.После этого, этикетка колбу с информацией, показанной здесь, и поместите его во влажный инкубатор при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа в течение 72 часов. Во-первых, извлекать колбу культуры тканей из инкубатора и наблюдать за прилипаемой клеткой, как указано в текстовом протоколе. Оспирировать весь объем средств массовой информации из колбы и передать его в контейнер для отходов.Добавьте пять миллилитров сбалансированного соленого раствора в колбу и аккуратно потрясите его, чтобы промыть излишки мультимедиа, мертвые клетки или отходы. Затем удалите весь объем соленого раствора из колбы и выбросьте его в мусорный контейнер. Затем добавьте два миллилитров трипсина в колбу и аккуратно потрясите ее, чтобы разогнать фермент над прилипаемыми клетками.Убедитесь, что поверхность адепта полностью насыщена, и поместите колбу ткани в инкубатор на две-три минуты. После этого осторожно коснитесь стороны колбы три-пять раз, чтобы облегчить отслоение клеток. Протрите колбу с 70% алкоголя, и поместите его в шкаф биобезопасности.Добавьте пять миллилитров стоковых средств массовой информации в флябу ткани, чтобы остановить реакцию ферментного субстрата. Аспирировать весь объем жидкости из колбы, и передать его в стерильной 15-миллилитровой конической трубки. Центрифуга при 200 градусах г и при 25 градусах по Цельсию в течение пяти минут.Затем используйте 70% алкоголя, чтобы протереть трубку, содержащую гранулы клеток, и поместить его в шкаф биобезопасности. Pipette от средств массовой информации, оставив после себя около 250 микролитров жидкости с клеточной гранулы. Вы запустите дно конической трубки через флакон слоты микроцентрифуг трубки стойку, чтобы создать быструю вибрацию и беспокоить и повторно использовать ячейки гранулы.После правильного завершения, новый клеточный раствор будет отображаться как облачная смесь без оставшихся гранул. Добавьте два миллилитров мультимедиа в повторное успение клетки. Pipette клетки мягко вверх и вниз по стороне трубки 20 раз, чтобы разбить любые сгустки.И записывают общий объем подвески ячейки. Далее используйте стерильную пипетки, чтобы добавить 20 микролитров трипана синего бульона в пустой колодец из 96-хорошо пластины. Используя стерильный наконечник пипетки, перенесите 20 микролитров клеточного запаса из 15-миллилитровой трубки в колодец, содержащий трипановый синий раствор.Пипетту аккуратно смешать содержимое и передать 10 микролитров смеси между крышкой скольжения и счетной камеры на гемоцитометре. Подсчитайте только ячейки в центре и четыре угловых квадрата, отдельно подсчитывая как общее количество ячеек, так и нежизнеспособность ячейки для пяти идентифицированных квадратов. После расчета жизнеспособного подсчета ячеев, отметь горизонтальную линию в нижней части пластины из 12 скважин, чтобы служить эталонным знаком во время визуализации.Разбавить клеточный запас средствами массовой информации до плотности 19 000 клеток на миллилитр. Затем семя каждого колодца из 12-хорошо пластины с одним миллилитр разбавленного запасов клеток, смешивая запас клеток периодически, чтобы обеспечить даже посев клеток во всех 12 скважин. Наклеить этикетку каждой пластины с информацией, показанной здесь.И поместите его в инкубатор при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислом газе, пока клетки не вырастут до 100% слияния. Извлеки 12-хорошую пластину с клетками из инкубатора. Используя микроскоп с 10x целью, наблюдать клетки и определить слияние в каждой хорошо.Далее, аспирировать и распоряжаться роста средств массовой информации из каждой хорошо. Соберите P200 pipetter с 1-200 микролитров стерильным наконечником. В каждой хорошо, скользить пипетки отзыв по поверхности клетки от 12:00 месте 6:00 месте производить царапины макет раны.Промыть каждый колодец с одним миллилитров сбалансированного раствора соли, чтобы очистить избыток мусора и клеток сгустки. Рок пластины из стороны в сторону, чтобы облегчить стирку. Затем удалите и утилизировать сбалансированный раствор соли из каждой хорошо.Используя P1000 pipetter с наконечником 1000 микролитров, добавьте 1000 микролитров из подготовленных запасов мышьяка в скважины, которые были случайным образом назначены с группой обработки. Используйте новый наконечник пипетки для каждого хорошо, и записывать время, когда лечение добавляются. Инкубировать пластины при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом.Чтобы изображение пластин, захватить изображения каждого хорошо в 10 раз объективное увеличение каждые четыре часа в течение 24-часового периода. Ссылка на линию, ранее нарисованную на нижней части пластины, чтобы изображение одного и того же местоположения вдоль нуля в каждой хорошо в каждой точке времени. В этом исследовании для наблюдения за воздействием мышьяка на миграцию клеток используется анализ теста in vivo.Однородные царапины наблюдаются во всех группах лечения, со средним шириной царапины около 0,8 миллиметра. Контрольные клетки показывают полностью исцелил нуля после 20 часов. Две группы мышьяка не показывают такого уровня исцеления.При 10-микромолярном лечении ингибирование замыкания вообще в течение 24 часов. Эти результаты показывают, что наличие мышьяка замедляет миграцию клеток. Необработанные изображения, сделанные во время анализа, анализируются с помощью автоматизированного программного обеспечения для измерения ширины раны, затем вычисляют процентное замыкание и, наконец, вычисляют область под кривой.10-микромоляная группа лечения показывает статистически замедленную клеточную миграцию неонатальных фибробластов человека по сравнению со всеми другими группами лечения. Важно тщательно практиковать этот метод, чтобы увеличить последовательность при царапинах клеток. Непреднамеренная изменчивость между анализами потенциально может исказить данные и изменить выводы.Дальнейшие молекулярные методы, такие как количественная полимераза цепная реакция и фермент связанных иммуносорбентов анализы могут быть использованы после царапины анализ для выявления посыльных сигналов и белков, которые могут быть мишенью для изменений в миграции клеток наблюдается в анализе. Этот анализ способствовал пониманию исследователями метастазов рака, новых новых методов лечения рака, стволовых клеток и регенеративной медицины, и многих других научных вех.

Research

JoVE Journal

Environment

In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration

Exploring the Effects of Atmospheric Forcings on Evaporation: Experimental Integration of the Atmospheric Boundary Layer and Shallow Subsurface

Исследуя влияние атмосферных воздействий на испарение: Экспериментальная интеграция пограничного слоя атмосферы и приповерхностном слое грунта

Evaporation is directly influenced by the interactions between the atmosphere, land surface and soil subsurface. This work aims to experimentally study ...

A CO2 Concentration Gradient Facility for Testing CO2 Enrichment and Soil Effects on Grassland Ecosystem Function

A CO2 Concentration Gradient Facility for Testing CO2 Enrichment and Soil Effects on Grassland Ecosystem Function

СО<sub&gt; 2</sub&gt; Градиент концентрации средства для проверки СО<sub&gt; 2</sub&gt; Эффекты обогащения и почвы наложенным Пастбища экосистем

Continuing increases in atmospheric carbon dioxide concentrations (CA) mandate techniques for examining impacts on terrestrial ecosystems. Most ...

A Flow-through Exposure System for Evaluating Suspended Sediments Effects on Aquatic Life

Проточного Система экспозиции для оценки взвешенных наносов Воздействие на водной флоры и фауны

This paper describes the Fish Larvae and Egg Exposure System (FLEES). The flow-through exposure system is used to investigate the effects of suspended ...

Determination of Inorganic Arsenic in a Wide Range of Food Matrices using Hydride Generation - Atomic Absorption Spectrometry.

Определение неорганическим мышьяком в широкий диапазон из пищи матрицы с помощью гидрида поколения - атомной абсорбционной спектрометрии.

The European Food Safety Authority (EFSA) underlined in its Scientific Opinion on Arsenic in Food that in order to support a sound exposure assessment to ...

Protocol for Assessing the Relative Effects of Environment and Genetics on Antler and Body Growth for a Long-lived Cervid

Протокол для оценки относительного воздействия окружающей среды и генетики на рога и рост тела для долгоживущих Cervid

Cervid phenotype can be placed into one of two categories: efficiency, which promotes survival over extravagant morphometric growth, and luxury, which ...

Preparation of DMMTAV and DMDTAV Using DMAV for Environmental Applications: Synthesis, Purification, and Confirmation

Preparation of DMMTAV and DMDTAV Using DMAV for Environmental Applications: Synthesis, Purification, and Confirmation

Подготовка DMMTAV и DMDTAV с использованием DMAV для окружающей среды приложений: синтеза, очистки и подтверждение

Dimethylated thioarsenicals such as dimethylmonothioarsinic acid (DMMTAV) and dimethyldithioarsinic acid (DMDTAV), which are produced by the metabolic ...

Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA

Сбор и извлечения образцов профессиональных воздуха для анализа ДНК, грибковых

Traditional methods of identifying fungal exposures in occupational environments, such as culture and microscopy-based approaches, have several ...

An Experimental Protocol for Studying Mineral Effects on Organic Hydrothermal Transformations

Экспериментальный протокол для изучения минеральных влияния на органических гидротермальных преобразования

Organic-mineral interactions are widely occurring in hydrothermal environments, such as hot springs, geysers on land, and the hydrothermal vents in the ...

Composition and Distribution Analysis of Bioaerosols Under Different Environmental Conditions

Состав и распределение анализ биоаэрозоли в различных экологических условиях

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, ...

Removal of Arsenic Using a Cationic Polymer Gel Impregnated with Iron Hydroxide

Удаление мышьяка с помощью киационного полимерного геля, пропитанного гидроксидом железа

In this work, we prepared an adsorbent composed of a cationic polymer gel containing iron hydroxide in its structure designed to adsorb arsenic from ...