Name: in vitro scratch assay to demonstrate effects of arsenic on skin cell migration
Uploaded: 2019-02-23T13:00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration at JoVE.com

Forskning som redovisas i denna publikation stöddes av National Institute on minoritet hälsa och hälsa skillnader av det nationella Institutes of Health under Award nummer U54MD012388. Innehållet ansvarar enbart för författarna och representerar inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter av National Institutes of Health.

<ol>
	<li>Diegelmann, R., Evans, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing:+an+overview+of+acute,+fibrotic+and+delayed+healing.">Wound healing: an overview of acute, fibrotic and delayed healing.</a> Frontiers in BioScience. 9, 283-289 (2004).</li><li>Braiman-Wiksman, L., Solomonik, I., Spira, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+into+wound+healing+sequence+of+events.">Novel insights into wound healing sequence of events.</a> Toxicologic Pathology. 35, 767-779 (2007).</li><li>Michelson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Platelets. , (2013).</li><li>Aikawa, M., Schoenbechler, M. J., Barbaro, J. F., Sadun, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+rabbit+platelets+and+leukocytes+in+the+release+of+histamine.+Electron+microscopic+observations.">Interaction of rabbit platelets and leukocytes in the release of histamine. Electron microscopic observations.</a> American Journal of Pathology. 63 (1), 85-98 (1971).</li><li>Liang, C., Park, A., Guan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+scratch+assay:+A+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro.">In vitro scratch assay: A convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nature Protocols. , 329-333 (2007).</li><li>Pinto, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bench-top+in+vitro+wound+assay+to+evaluate+wound+closure.+Applied.">A bench-top in vitro wound assay to evaluate wound closure. Applied.</a> In Vitro Toxicology. 2 (3), 151-156 (2016).</li><li>Pinto, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+mitigates+the+negative+effects+of+arsenic+contamination+in+an+in+vitro+wound+model.">Estrogen mitigates the negative effects of arsenic contamination in an in vitro wound model.</a> Applied In Vitro Toxicology. 4 (1), 24-29 (2018).</li><li>Roubelakis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-rich+plasma+(PRP)+promotes+fetal+mesenchymal+stem/stromal+cell+migration+and+wound+healing+process.">Platelet-rich plasma (PRP) promotes fetal mesenchymal stem/stromal cell migration and wound healing process.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 417-428 (2014).</li><li>Shibata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adiponectin+regulates+cutaneous+wound+healing+by+promoting+keratinocyte+proliferation+and+migration+via+the+ERK+signaling+pathway.">Adiponectin regulates cutaneous wound healing by promoting keratinocyte proliferation and migration via the ERK signaling pathway.</a> Journal of Immunology. 189 (6), 3231-3241 (2012).</li><li>Mendonca, R. J., Coutinho-Netto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+aspects+of+wound+healing.">Cellular aspects of wound healing.</a> Anais Brasileiros de Dermatologia. 84 (3), 257-262 (2009).</li><li>Beem, E., Segal, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+stability+and+sensitivity+of+cell+fluorescent+labels+when+used+for+cell+migration.">Evaluation of stability and sensitivity of cell fluorescent labels when used for cell migration.</a> Journal of Fluorescence. 23 (5), 975-987 (2013).</li><li>Gentry, P. R., Clewell, H. J., Greene, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+recent+advances+in+research+on+arsenic+cancer+risk+assessment.">The impact of recent advances in research on arsenic cancer risk assessment.</a> Regulatory Toxicology and Pharmacology. 69, 91-104 (2014).</li><li>Beamer, P. I., Klimecki, W. T., Loh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+children's+urinary+CC16+levels+with+arsenic+concentrations+in+multiple+environmental+media.">Association of children's urinary CC16 levels with arsenic concentrations in multiple environmental media.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health.pii: E521.2016:13. , (2016).</li><li>Robertson, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arsenic+in+ground-water+under+oxidizing+conditions,+southwest+United+States.">Arsenic in ground-water under oxidizing conditions, southwest United States.</a> Environmental Geochemistry and Health. 11, 3-4 (1989).</li><li>Foust, R. D., Mohapatra, P., Compton-O'Brian, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Groundwater+arsenic+in+the+Verde+Valley+in+central+Arizona,+USA.">Groundwater arsenic in the Verde Valley in central Arizona, USA.</a> Applied Geochemistry. 19, 251-255 (2004).</li><li>Uhlman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Arsenic in Arizona Ground Water: Source and Transport Characteristics. , (2008).</li><li>Agusa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+exposure+to+arsenic+from+drinking+water+in+Vietnam.">Human exposure to arsenic from drinking water in Vietnam.</a> Science of the Total Environment. , (2014).</li><li>Ayotte, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+temporal+variability+of+arsenic+in+groundwater+used+for+drinking+water+supply+in+the+United+States.">Factors affecting temporal variability of arsenic in groundwater used for drinking water supply in the United States.</a> Science of the Total Environment. , (2014).</li><li>Dummer, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geostatistical+modeling+of+arsenic+in+drinking+water+wells+and+related+toenail+arsenic+concentrations+across+Nova+Scotia,+Canada.">Geostatistical modeling of arsenic in drinking water wells and related toenail arsenic concentrations across Nova Scotia, Canada.</a> Science of the Total Environment. , (2014).</li><li>Sorg, T. J., Chen, A. S., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arsenic+species+in+drinking+water+wells+in+the+USA+with+high+arsenic+concentrations.">Arsenic species in drinking water wells in the USA with high arsenic concentrations.</a> Water Research. 48, 156-169 (2014).</li><li>Beamer, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+Children's+Urinary+CC16+Levels+with+Arsenic+Concentrations+in+Multiple+Environmental+Media.">Association of Children's Urinary CC16 Levels with Arsenic Concentrations in Multiple Environmental Media.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health. 13, (2016).</li><li>Pomari, E., Dalla Valle, L., Pertile, P., Colombo, L., Thornton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracrine+sex+steroid+synthesis+and+signaling+in+human+epidermal+keratinocytes+and+dermal+fibroblasts.">Intracrine sex steroid synthesis and signaling in human epidermal keratinocytes and dermal fibroblasts.</a> The FASEB Journal. 29 (2), 508-524 (2015).</li><li>Gotsulyak, Y., Kosach, R., Cherednyk, V., Tykhonkova, O., Khoruzhenka, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+cell+motility+evaluation+in+scratch+assay.">Optimization of cell motility evaluation in scratch assay.</a> Biopolymers and Cell. 30, 223-228 (2014).</li><li>Goetsch, K. P., Niesler, C. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+scratch+assay+for+in+vitro+skeletal+muscle+wound+healing+analysis.">Optimization of the scratch assay for in vitro skeletal muscle wound healing analysis.</a> Analytical Biochemistry. 411, 158-160 (2011).</li><li>Harishkumar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+the+mechanism+of+in+vitro+wound+healing+properties+of+citrus+tamurana+extract.">Revealing the mechanism of in vitro wound healing properties of citrus tamurana extract.</a> BioMed Research International. 13, (2013).</li><li>Johnston, S. T., Simpson, M. J., McElwain, D. L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+much+information+can+be+obtained+from+tracking+the+position+of+the+leading+edge+in+a+scratch+assay?.">How much information can be obtained from tracking the position of the leading edge in a scratch assay?.</a> Journal of the Royal Society Interface. 11, 1-9 (2014).</li></ol>

Författarna har något att avslöja.

Tillämpningen av denna analys ger en hög genomströmning och snabb utvärdering av cellulära migration och direkt kan översätta till komplexa fysiologiska system5,6,7. Av denna anledning har den föreslagna bänk modellen trimmad och övade för att utvärdera effekterna av olika terapeutiska medel och miljögifter på sårläkning6. Koncentrationerna av arsenik som används i den aktuella studien ansågs miljörelevanta genom omfattande litteratursökning kända exponeringsnivåer och från retrospektiv genomgång av olika data baser14,15, 16,17,18,19,20,21. Användningen av denna i vitro scratch analys visat att exponering för en arsenik koncentrationen inom höga, men miljömässigt relevanta utbud, försenad sårslutning (cellular migration).
Denna bänk topp modell var också anställd att isolera och studera en enskild cell linje (fibroblast) för att ytterligare förstå hur fibroblast migration bidrar till att såret helande utfall. Dessutom är det svårt att studera funktionerna i en enskild cell linje i komplexa i vivo system med många andra celler och vävnader närvarande som kan störa analysen. Dessutom ger analysen ett medel att uppnå semikvantitativt procent såret stängning data som kan användas för att rikta specifika cellulära mekanismer genom vilka föreningar kan påverka sårläkningen. Till exempel celler används i scratch analysen kan samlas och lagras i en önskad reagens och används i genuttryck (signal mRNA) eller proteinuttryck analyser22. Denna information kan vara användbar till utredaren om de försöker förstå vad signaler eller proteiner kan i hög grad bidra till förändringar i cellulära migration i närvaro av varierande behandlingar (dvs, arsenik)22.
Mänskliga neonatal dermal fibroblaster valdes för detta arbete utifrån deras framträdande roll i sårläkning. Dock detta scratch test protokoll har genomförts med hjälp av olika celltyper och för en rad forskningsändamål. Till exempel har scratch analysen antagits inom området onkologi för att studera migration hämning av kemoterapi droger23; för skelettmuskulaturen cellmigration, proliferation och diffusion24; att studera effekten av växtextrakt på cellulära migration25; och för att förstå hur keratinocyter migration och spridning bidra till såret helande9. Dessutom utvärderat en tidigare papper av Pinto o.a. effekterna av uran (U) och trombocyter-rich plasma (PRP) på hDFn migrering med scratch test6. Syftet med detta arbete var att förstå den utsträckning som denna analys kunde testa effekten av en agent som trodde att sakta cellulära migration (U), liksom en agent som tros påskynda cellulära migration (PRP). Som kan ses i ovannämnda arbete och forskning av andra utredare, tillämpningen av scratch analysen har hög potential för användning i olika experimentella modeller26. Trots den detalj som tillhandahålls inom metoderna, bör det förväntas variansen mellan utredare och experiment. Till exempel varierar cellulära migration priser sannolikt baserat på raden cell används, förutom de nödvändiga mikronäringsämnen behövs för unika celltyper. Många av de viktiga yttranden till stöd i cell avkastning och lönsamhet är listade som anteckningar i hela detta protokoll. Det rekommenderas dock starkt att utredarna följer tillverkarens rekommendationer för optimal tillväxt villkorar, och att använda denna metod som kompletterande anvisning för allmänna cell kulturarbete.
Även om scratch analysen är extremt mångsidig för studie av cellulär aktivitet; oförutsedda fel kan uppstå i mätteknik. Till exempel när du använder ImageJ att manuellt spåra cell migration fronter, kan variation finnas bland användare, vilket kan begränsa noggrannhet och representativa datainsamling. Det bör också noteras att migration fronter ska läsas dubbelblind behandling att minimera användaren bias. Dessutom kan manuellt identifiera migration fronter resultera i felberäkning av genomsnittliga körsträcka på grund av pseudopod bildandet av celler och deras förmåga att nå ut till formuläret fokal sammanväxningar, som kan vara visuellt vilseledande. På samma sätt, användning av fluorescerande ”cell tracker” färgämnen på cellens yta eller nukleära proteiner att upptäcka migration kan oavsiktligt fixa celler vilket leder till felaktigheter vid mätning av cellulära migration över tid. Det rekommenderas att lämpliga positiva och negativa kontroller vara inskrivna inom experimentet att helt bedöma effekten av behandling på cell linjer. Bruket av denna analys måste slutföras som ett erkännande av dess begränsningar. Denna analys garanterar inte att cellulära migration resultat från in vitro experiment kommer att direkt översätta till i vivo resultat. Såret helande och cellulära migration i ett komplex levande system innebär en mängd celltyper och molekylära signaler. som alla har potential att påverka helande svar.
Sammanfattningsvis, har scratch analysen visat sig ge hög genomströmning screening av cellulära migration som svar på förändrade miljöer6,25. Vi utnyttjade specifikt detta protokoll för att identifiera förändringar i cellulära migration till följd av arsenikexponering vid olika miljömässigt relevanta doser. Dessa data har motiverat att använda scratch analysen vidare studium och utvärdera de mekanistiska vägarna i cellulära migration i denna analys och hur dessa vägar ändras med arsenikexponering.

Sårläkning består av en komplex serie överlappande steg som involverar olika celltyper, signalmolekyler och extracellulär matrix komponenter1. Tillsammans arbetar dessa komponenter i samförstånd för att uppnå såret upplösning eller reparation, som i slutändan leder till bildandet av ett skyddande fibrotisk ärr beroende på graden av trauma1. För att fånga de enskilda processer och funktioner för såret är läka i ett experiment svårt; enskilda steg inom sårläkningsprocessen behöver identifieras och testas separat. Bland de många stegen av sårläkning, har processen för cellulära migration ansetts vara kritisk när du utvärderar helande priser2. Cellulära migration kan observeras i alla faser av sårläkning, och således kräver ytterligare förståelse för hur förändringar av cellmigration kan påverka sårslutning. Cellulära migration ses exempelvis i både tidiga och sena fas inflammation, med blod koagulation och trombocyter aggregering på såret plats3. Dessa händelser förhindra kraftig blodförlust genom att bilda en tillfällig blockering för att fylla sårade områden saknar vävnad3. Trombocyter i omlopp kommer att syntetisera och utsöndrar vasoaktiv medlare tillsammans med kemotaktiska faktorer, vilka tillsammans signal för inflammatoriska leukocytmigration (vita blodkroppar) på den skadade vävnaden för reparera4. Återepitelisation uppstår inom timmar efter vävnadsskada och innebär som täcker såret webbplatsen genom aktivitet och migrering av epitelial keratinocyter att förhindra ytterligare förorening eller invasion av främmande partiklar i såret plats2. Dessa exempel fånga bara några av de många cellmigration funktioner är associerad med sårläkning.
Scratch analysen har beskrivits och används för att bättre förstå cellmigration och dess många roller i sårläkning5,6. Denna analys anses förenklade, ger hög genomströmning och gör det möjligt för utredaren att samla in representativa cell migration uppgifter. Migration-analyser har framgångsrikt visat att vissa föreningar kan accelerera eller bromsa av cellulära migration6. Dessutom ger dessa analysens resultat translationell fysiologisk information som kan användas för att formulera mål behandlingar, dosering koncentrationer och gener av intresse före in-vivo -experiment. Analysen kräver grundläggande cell kultur tekniker och leveranser, en cell fodrar av val, och bildteknik för att fånga rörelse över tid eller rörelse som svar på behandlingar.
Analysen kan lätt manipuleras eller skräddarsydda för att passa behoven hos utredaren. Men finns det fyra grundläggande frågor att överväga innan experiment. Vilka allmänna eller specifika fråga är den försöksledarna som samtliga försöker besvara? Detta gäller för de flesta hypoteser driven forskning; Det är dock kritisk till denna analys eftersom det kommer avgöra många av parametrarna som behövs för att korrekt och fullständigt besvara frågan/frågorna. Vad cellinje eller cellinjer (om flera) ska användas att representera den fysiologiska system studeras? Till exempel i en kutan sår helande studie, en dermal fibroblast5,6,7, stem cell8eller epidermala keratinocyter9 kan anses representera cellpopulationer som normalt finns i överflöd på huden vävnad10. Alternativt, neutrofiler, makrofager eller andra inflammatoriska celler kunde utvärderas i detta system att representera cellmigration av andra beståndsdelar i sårläkning inom hud vävnad10. Dessutom hjälper identifierar den specifika cellen fodrar utvärderas till att identifiera vilka reagenser är optimala att använda att främja cellernas metaboliska aktivitet. Hur blir cellmigration spåras/avbildas? Det finns ett antal tekniker som används för att observera cellmigration inom en tallrik eller kolv. Till exempel ger färgning eller fluorescently taggning celler och använder fluorescens eller confocal imaging för att spåra celler en stark kontrast, vilket gör att utredaren att tydligt definiera cellulära vs. icke-cellulär platser och cellulära rörelse11 . En annan vanlig teknik, beskrivs i denna studie är att utnyttja inverterat ljusmikroskop med fas kontrast6,7. Detta alternativ till cell färgämnen och fluorescens tillåter användaren att live spår celler utan fixar obotligt celler före imaging och möjliggör också att fånga bilder av samma enskilda brunnar innehållande sårade enskiktslager av celler över tidpunkter. Vad resultatet åtgärder kommer att användas för analys? Med hjälp av bilderna samlades under hela studien, data kan skapas där förändringar i cellulära migration priser kan förstås. I vårt labb mikroskopiska bilder som tagits på den inverterat ljusmikroskop överförs till bild analys programvara och beräknas den procentuella sårslutning och summerade arean under kurvan (AUC).
Vi kommer att belysa den specifika användningen av denna analys att belysa förändringar av dermal fibroblast migration i närvaro av en känd miljö förorening, arsenik. Arsenik är en naturligt förekommande metalloid finns inom jordskorpan. Olika platser har hittats med förhöjda halter av arsenik, som utgör en risk för personer som bor nära dessa platser. Som ett resultat, har mat och vatten källor visat sig ha förhöjda halter av arsenik föroreningar, vilket ökar risken för individer att bli exponerad för arsenik. Miljömässiga arsenikexponering har visat sig ha långsiktiga hälsokonsekvenser i mänskliga populationer över eller ens nedanför nuvarande USA Environmental Protection Agency (USEPA) Max föroreningars nivå (MCL) 10 ppb (10 µg/L)12, 13. även om den amerikanska MILJÖVÅRDSMYNDIGHETEN har satt denna MCL och anses det säkert att dricka gränser, arsenik koncentrationer som överskrider denna gräns är inte ovanliga i vattenkällor över hela världen. I sydvästra USA, har många grundvatten, brunnsvatten och fjädrar dokumenterats för att innehålla när det gäller halter av arsenik14. Till exempel i Verde Valley, AZ innehåller Montezuma väl 210 µg/L arsenik15. Grundvattnet runt floden Verde, AZ innehåller 16 µg/L arsenik i genomsnitt med toppvärden når 1,3 mg/L15,16. Noterbart överstiger i många brunnar i Verde River vatten Boden koncentrationerna av arsenik 50 µg/L15,16. Med denna kunskap, miljömässigt relevanta arsenik koncentrationer var markerat intervallet underifrån MCL på 0,1 µM (7,5 ppb), ovanför MCL på 10 µM (750 ppb) i aktuellt studera14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 .
Den information som samlats in från dessa experiment kommer att användas som en tidig indikator på potentiella ändringar av cellulära migration priser i en in-vivo sår förorenad med arsenik. Efteråt, signaling molekyler kan väljas baserat på deras roll för att underlätta sårläkning och cellulära migration och framtida kvantitativa polymerasen kedjar reaktion (qPCR) baserat gen uttryck experiment kan inrättas vid slutförandet av nuvarande studier. Om migration priser i denna analys ändrar i närvaro av arsenik, specifik gen mål inblandning i cellulära migration kan vara målet för skadliga effekterna av arsenik, och kan således vara mekanismen av störningar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Class II A/B3 Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td>15201-816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile Gloves</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>55082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Precision</td>
			<td>Model 182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Q080318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPR Centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>349702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Scale</td>
			<td>Ohaus</td>
			<td>I093 1125062111P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighting paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>H351125781212A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biohazard bags</td>
			<td>Fisherbran</td>
			<td>01-830A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Jacketed CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>309739-31053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10566-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Pipettor</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>140685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p200 Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p20 Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denominator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D59707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 tissue flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430725U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tube</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-539-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Marker</td>
			<td>Securline</td>
			<td>92167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wipes</td>
			<td>Kintech</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>63-67-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Filter Pipet Tips</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>16160210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Great Value</td>
			<td>220-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovial Rack</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>5030-0505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Gizmo Supply</td>
			<td>B00SCOGY56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube Rack</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waste Beaker</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Edge Ruler</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human neonatal dermal fibroblasts (hDFn)</td>
			<td>lot: 1734, 2902</td>
			<td>106-05n</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rstudio Statistical Software</td>
			<td></td>
			<td>ver: 3.5.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>NIH</td>
			<td>ver: 1.8.0_112</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro scratch assay to demonstrate effects of arsenic on skin cell migration

Förstå de fysiologiska mekanismerna bakom sårläkning har varit i fokus för pågående forskning i många år. Denna forskning översätter direkt till förändringar i kliniska standarder som används för att behandla sår och minska sjuklighet och dödlighet för patienter. Sårläkning är en komplex process som kräver strategiska cell och vävnad interaktion och funktion. En av de många kritiskt viktiga funktionerna i sårläkning är individuella och kollektiva cellulära migration. Vid skada migrera olika celler från blodet, omgivande bindväv och epitelial vävnader snabbt till sårområdet genom kemiska eller fysiska stimuli. Denna migration svar kan till stor del diktera resultaten och framgång av ett läkande sår. Förstå detta särskilda cellulär funktion är viktigt för translationell medicin som kan leda till förbättrad sårläkning utfall. Här beskriver vi ett protokoll som används för att bättre förstå cellulära migration den avser sårläkning och hur förändringar till den cellulära miljön kan markant ändra denna process. I detta exempel studie odlades dermal fibroblaster i media kompletteras med fetalt bovint serum (FBS) som enskiktslager kulturer i vävnadsodling kolvar. Cellerna var aseptiskt överförs i vävnadsodling behandlas 12-bra plattor och vuxit till 100% sammanflödet. När du når sammanflödet, var cellerna i enskiktslager vertikalt kliade användande en p200 Pipettera spets. Arsenik som utspädd i kultur media kompletteras med FBS lades till enskilda brunnar på miljömässigt relevanta doser 0,1-10 M. bilder fångades var 4 timmar (h) under en 24 h period med ett inverterat ljusmikroskop att iaktta cellulära migration (sår stängning). Bilder individuellt analyserade med bild analys programvara, och procent såret stängning beräknades. Resultaten visar att arsenik långsammare sårläkning. Denna teknik ger en snabb och billig första skärm för utvärdering av effekterna av föroreningar på sårläkning.

Urvalsstorleken (n) för alla behandlingsgrupper var n = 28. Cellerna var framgångsrikt odlade följande aseptiska tekniker och lab protokoll (figur 1). Enhetlig repor observerades över alla behandlingsgrupper med genomsnittlig scratch bredden mäter 0.8 mm 0,4 mm (figur 2). Kontrollgruppen hade en genomsnittlig summerade arean under kurvan värdet av 1,355.83; 0,01 µM som behandlingsgrupperna hade i genomsnitt summerade arean under kurvan värdet av 1,366.21; 0.1 µM som behandlingsgrupperna 1,0 µM som behandlingsgrupp hade en genomsnittlig summerade arean under kurvan värdet av 1,326.24, och hade en genomsnittlig summerade arean under kurvan värdet av 1,295.10; och slutligen den 10 µM som behandlingsgrupp hade en genomsnittlig summerade arean under kurvan värdet av 535.12, som var statistiskt lägre jämfört med alla andra grupper (p < 0,05) (figur 3). R-program för statistisk analys användes för att köra en envägs ANOVA med en Tukey post hoc justering att fastställa statistiska skillnader mellan behandlingsgrupperna (p < 0,05).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58838/58838fig2.jpg"> Figur 2: representativa scratch test bilder under 20 h. Bilder A-D representerar cellulära migration control Cells; bilder E-H representerar cellulära migration av celler som smittats med 1,0 µM som; bilder jag-L representerar cellulära migration av celler som smittats med 10 µM som. Från dessa bilder är det klart att cellulära migration är långsammare i närvaro av arsenik. Kontroll bilderna visar en helt ”botad” repa efter 20 h, medan de andra två som-behandlingsgrupperna inte var ”läkt”. De 10 µM som behandling hämmas totalstopp alldeles efter 24 h. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58838/58838fig2large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58838/58838fig3.jpg"> Figur 3: arsenik saktar cellulära migration i scratch analysens. Bilder fångades under 24 h att iaktta förändringar till cellulära migration priser i närvaro av varierande koncentrationer av arsenik. RAW-bilder analyserades med hjälp av en automatiserad programvara (t.ex., i MATLAB), som ursprungligen uppmätta såret bredd, därefter beräknas procent stängning och slutligen area under kurvan (AUC). Felstaplar representera standardavvikelsen för medelvärdet. Den 10 µM som behandlingsgrupperna statistiskt saktade cellulära migration av mänskliga dermal fibroblaster neonatal (hDFn), visar en statistiskt lägre AUC-värdet, jämfört med alla andra behandlingsgrupperna med en envägs ANOVA med en Tukey post hoc justering (p) < 0,05). Statistiska skillnader representeras av bokstäverna ”A” och ”B”, som erhölls genom att använda kompakta brev visningsmetoden tillgänglig i R-program. Behandlingar som inte delar ett gemensamt brev är statistiskt signifikant från varandra (p < 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58838/58838fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration at JoVE.com

In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration

In Vitro Scratch test för att påvisa effekterna av arsenik på huden cellmigration

Denna studie fokuserar på en in vitro- modell av såret helande (scratch assay) som en mekanism för att fastställa hur miljögifter såsom arsenik inflytande cellulära migration. Resultaten visar att denna in vitro -analys ger snabba och tidiga indikationer på förändringar i cellulära migration före in-vivo -experiment.

Understanding the physiologic mechanisms of wound healing has been the focus of ongoing research for many years. This research directly translates into ...

Cellulär migration är en kritisk sårläkningsprocess som drastiskt kan förändra resultatet av ett läkande sår. Detta protokoll gör det möjligt för forskare att bättre förstå effekten av olika föreningar på cellulär migration under sårläkning. Vilket ofta kan leda till riktade behandlingsstrategier för klinisk medicin.Den scratch analysen är en kostnadseffektiv och hög genomströmning strategi för att generera meningsfulla sårläkning data före kostsamma och tidsintensiva in vivo testning. Den repa analysen som en metod är särskilt relevant i sårläkning applikationer. Mest specifikt, huden.Emellertid, analysen är verkligen en migration assay, och skulle kunna tillämpas på alla celltyp där migration av celler är av intresse att mäta eller att fånga. Liknar klassiska cell-och vävnadskultur, standard operativa förfaranden, utbildning, teknik, och praxis, praxis, praxis. Dessa är nyckeln till framgång med scratch analys.Visar förfarandet kommer att Nathan Cruz, en magisterstudent, och Oscar Lujan, en grundutbildning forskare. För att påbörja denna procedur, förbereda biosäkerhet II skåpet med hjälp av en 70%isopropyl vattenlösning för att utföra en sanitet torka, med början på baksidan och sidoväggar, och arbetar ner till basplattan. Också torka av alla material som kommer att användas i analysen innan du placerar dem i skåpet.Därefter erhålla injektionsflaska som innehåller den önskade cryopreserved cellinjen, och placera en i en centimeter-djupt vattenbad på 37 grader Celsius för att tina. Tillsätt 10 milliliter medium kompletterat med 10%FBS i en T75-odlingskolv för vävnad. Öppna injektionsflaskan som innehåller cellstocken, och aspirera lösningen försiktigt.Överför sedan cellerna till T75-kolven. Ta bort en milliliter media från kolven och överför den tillbaka till flaskan och överför den sedan tillbaka till kolven för att maximera cellutbytet från injektionsflaskan. Dra åt kolvens lock och försiktigt gunga den för att jämnt skingra cellerna i suspension över hela ytan.Efter detta, märka kolven med den information som visas här, och placera den i en fuktad inkubator på 37 grader Celsius och 5%koldioxid i 72 timmar. Hämta först vävnadskulturkolven från inkubatorn och observera de följna cellerna enligt textprotokollet. Aspirera hela medievolymen från kolven och överför den till en avfallsbehållare.Tillsätt fem milliliter balanserad saltlösning till kolven och gunga den försiktigt för att skölja ut överflödigt media, döda celler eller avfallsprodukt. Ta sedan bort hela volymen saltlösning från kolven och kasta den i en avfallsbehållare. Tillsätt sedan två milliliter trypsin till kolven, och försiktigt klippa den för att sprida enzymet över de vidhäftade cellerna.Se till att den vidhäftande ytan är helt mättad, och placera vävnadskolven i inkubatorn i två till tre minuter. Efter detta, knacka försiktigt på sidan av kolven tre till fem gånger för att underlätta cellavlossning. Torka av kolven med 70%-alkohol, och placera den i biosäkerhetsskåpet.Tillsätt fem milliliter lagermedier till vävnadskolven för att stoppa enzymsubstratreaktionen. Aspirera hela volymen av vätska från kolven, och överför den till en steril 15-milliliter koniska röret. Centrifugera vid 200 gånger g och vid 25 grader Celsius i fem minuter.Använd sedan 70%-alkohol för att torka av röret som innehåller de pelleterade cellerna, och placera det inuti biosäkerhetsskåpet. Pipettera av media och lämnar efter sig cirka 250 mikroliter vätska med cellpelletsen. Kör botten av det koniska röret över injektionsflaskans slitsar av ett mikrocentrifugrör rack för att skapa en snabb vibration och störa och återanvända cellpelletsen.När den är klar korrekt, kommer den nya celllösningen visas som en grumlig blandning utan återstående pellet. Tillsätt två milliliter media till cellens återfpension. Pipettera cellerna försiktigt upp och ner på sidan av röret 20 gånger för att bryta upp eventuella klumpar.Och registrera den totala cellens upphängningsvolym. Därefter använder en steril pipett för att lägga till 20 mikroliter trypan blå bulna till en tom brunn av en 96-brunnsplatta. Med hjälp av en steril pipettspets överför du 20 mikroliter celllager från 15-milliliterröret till brunnen som innehåller trypanblålösningen.Pipett försiktigt för att blanda innehållet och överföra 10 mikroliter av blandningen mellan täckslitten och räknekammaren på en hemocytometer. Räkna endast cellerna i mitten och fyra hörnrutor, separat tallying både den totala cellen antal och icke-livskraftiga cellantal för de fem identifierade rutor. Efter beräkning av livskraftiga celltal, markera en horisontell linje över botten av en 12-brunnsplatta för att fungera som ett referensmärke under bildbehandling.Späd cellen lager med media till en densitet av 19, 000 celler per milliliter. Sedan utsäde varje brunn av 12-brunnsplattan med en milliliter av den utspädda cellen lager, blanda cellen lager regelbundet för att säkerställa även cell sådd över alla 12 brunnar. Märk varje platta med den information som visas här.Och placera den i en inkubator på 37 grader Celsius och 5% koldioxid tills cellerna växer till 100% sammanflödet. Hämta en 12-brunnsplatta med celler från inkubatorn. Med hjälp av ett mikroskop med en 10x objektiv, observera cellerna och bestämma sammanflödet inom varje brunn.Därefter aspirera och avyttra tillväxt media från varje brunn. Montera en P200 pipetter med en 1-200 microliter steril spets. I varje brunn, glida pipettspetsen över cellytan från 12:00 plats till 6:00 plats för att producera en repa mock sår.Skölj varje brunn med en milliliter balanserad saltlösning för att rensa bort överflödigt skräp och cellklump. Gunga plattan från sida till sida för att underlätta tvätt. Ta sedan bort och kassera den balanserade saltlösningen från varje brunn.Med hjälp av en P1000 pipetter med en 1, 000-microliter spets, tillsätt 1, 000 mikroliter från de beredda arsenik lager i brunnar som slumpmässigt har tilldelats med en behandlingsgrupp. Använd en ny pipettspets för varje brunn, och registrera tiden då behandlingarna läggs till. Inkubera plattorna i 37 grader Celsius med 5%koldioxid.För att avbilda plattorna, ta bilder av varje brunn vid 10x objektiv förstoring var fjärde timme under en 24-timmarsperiod. Referera till den linje som tidigare ritats på plattans undersida för att avbilda samma plats längs repa inom varje brunn vid varje tidspunkt. I denna studie, en in vivo scratch test assay används för att observera effekterna av arsenik på cell migration.Enhetliga repor observeras över alla behandlingsgrupper, med en medelskrapans bredd på cirka 0,8 millimeter. Kontrollcellerna visar en helt läkt repa efter 20 timmar. De två arsenikgrupperna visar inte denna nivå av läkning.Med 10-mikromolar behandling hämmar stängningen helt och hållet i 24 timmar. Dessa resultat visar att förekomsten av arsenik saktar cellulära migration. De råa bilder som tas under analysen analyseras med hjälp av automatiserad programvara för att mäta sårbredden, beräkna sedan procentstängningen och beräkna slutligen området under kurvan.Gruppen med 10 mikromolarbehandling visar statistiskt långsammare cellulär migration av humanatal dermal fibroblaster jämfört med alla andra behandlingsgrupper. Det är viktigt att grundligt öva denna teknik för att öka konsekvensen när du skrapar cellerna. Oavsiktlig variabilitet mellan analyser kan potentiellt skeva data och ändra slutsatser.Ytterligare molekylära tekniker såsom kvantitativ polymeras kedjereaktion och enzym-linked immunosorbent analyser kan användas post-scratch analys för att identifiera messenger signaler och proteiner som kan vara målet för förändringar i cell migration observeras i analysen. Denna analys har bidragit till forskarnas förståelse av cancer metastasering, nya framväxande cancerterapier, stamceller och regenerativ medicin, och många andra vetenskapliga milstolpar.

Research

JoVE Journal

Environment

In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration

Exploring the Effects of Atmospheric Forcings on Evaporation: Experimental Integration of the Atmospheric Boundary Layer and Shallow Subsurface

Utforska effekterna av luft Forcings på avdunstning: Experimentell Integrering av atmosfäriska gränsskiktet och Grunt Subsurface

Evaporation is directly influenced by the interactions between the atmosphere, land surface and soil subsurface. This work aims to experimentally study ...

A CO2 Concentration Gradient Facility for Testing CO2 Enrichment and Soil Effects on Grassland Ecosystem Function

A CO2 Concentration Gradient Facility for Testing CO2 Enrichment and Soil Effects on Grassland Ecosystem Function

En CO<sub&gt; 2</sub&gt; Koncentrationsgradient Facility for Testing CO<sub&gt; 2</sub&gt; Anrikning och Jord Effekter på Grass Ecosystem Funktion

Continuing increases in atmospheric carbon dioxide concentrations (CA) mandate techniques for examining impacts on terrestrial ecosystems. Most ...

A Flow-through Exposure System for Evaluating Suspended Sediments Effects on Aquatic Life

En genomströmningsExponerings system för att utvärdera suspenderat sediment Effekter på Vatten- liv

This paper describes the Fish Larvae and Egg Exposure System (FLEES). The flow-through exposure system is used to investigate the effects of suspended ...

Determination of Inorganic Arsenic in a Wide Range of Food Matrices using Hydride Generation - Atomic Absorption Spectrometry.

Bestämning av oorganisk arsenik i ett brett utbud av livsmedel matriser, vilken använder hydrid Generation - atomabsorptionsspektrometri.

The European Food Safety Authority (EFSA) underlined in its Scientific Opinion on Arsenic in Food that in order to support a sound exposure assessment to ...

Protocol for Assessing the Relative Effects of Environment and Genetics on Antler and Body Growth for a Long-lived Cervid

Protokoll för att bedöma relativa effekterna av miljö och genetik på hjorthorn och kroppens tillväxt för en långlivad hjortdjur

Cervid phenotype can be placed into one of two categories: efficiency, which promotes survival over extravagant morphometric growth, and luxury, which ...

Preparation of DMMTAV and DMDTAV Using DMAV for Environmental Applications: Synthesis, Purification, and Confirmation

Preparation of DMMTAV and DMDTAV Using DMAV for Environmental Applications: Synthesis, Purification, and Confirmation

Beredning av DMMTAV och DMDTAV med DMAV för miljötillämpningar: syntes, rening och bekräftelse

Dimethylated thioarsenicals such as dimethylmonothioarsinic acid (DMMTAV) and dimethyldithioarsinic acid (DMDTAV), which are produced by the metabolic ...

Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA

Samling och utvinning av yrkesmässig luftprover för analys av svamp DNA

Traditional methods of identifying fungal exposures in occupational environments, such as culture and microscopy-based approaches, have several ...

An Experimental Protocol for Studying Mineral Effects on Organic Hydrothermal Transformations

Ett experimentellt protokoll för att studera Mineral effekter på organiska hydrotermiska transformationer

Organic-mineral interactions are widely occurring in hydrothermal environments, such as hot springs, geysers on land, and the hydrothermal vents in the ...

Composition and Distribution Analysis of Bioaerosols Under Different Environmental Conditions

Sammansättning och Distribution analys av bioaerosoler Under olika miljöförhållanden

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, ...

Removal of Arsenic Using a Cationic Polymer Gel Impregnated with Iron Hydroxide

Avlägsnande av arsenik med hjälp av en Katjonpolymergel impregnerad med Järnhydroxid

In this work, we prepared an adsorbent composed of a cationic polymer gel containing iron hydroxide in its structure designed to adsorb arsenic from ...