Name: lipid bilayer experiments with contact bubble bilayers for patch-clampers
Uploaded: 2019-01-16T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers at JoVE.com

المؤلف يود أن يشكر ياماتاكي ماريكو وتاكاشيما ماساكو للمساعدة التقنية. وأيد هذا العمل في جزء من كاكينهي أرقام المنح ح 16 00759 و 17 ح 04017 (هكذا).

1. إعداد الدهنية
<ol><li>تفريق فوسفوليبيدات (مثلاً، 10 ملغ مسحوق) في كلوروفورم بتركيز المطلوب (مثلاً، 10 ملغ/مل).</li>
	<li>تتبخر كلوروفورم.<ol>
<li>مكان الحل فسفوليبيد في قارورة مستديرة القاع ومجموعة فعلى مبخر دوراني (انظر الجدول للمواد) متصل باسطوانة غاز2 ن. قم بتدوير قارورة تح...

طريقة الدهن بلير تشكيل مصرف البحرين المركزي يستند على مبدأ معالجة المياه في النفط تجميعية مبطنة ب أحادي الطبقة20. من الناحية التقنية، إجراءات تشكيل كبس سهلة، خاصة بالنسبة للتصحيح-المشبك الباحثين، الذين يجيدون التلاعب ميكروبيبيتيس الزجاج. سهولة يستخدم الإعداد الكهربية المشب...

للقنوات الأيونية، غشاء الخلية ليست مجرد مادة داعمة بل شريكا لتوليد تدفق أيون. وظيفيا، الغشاء عازل كهربائي أيون التي يتضمنها القنوات، وجميع أغشية الخلايا المهلة مع غشاء يستريح محتملة. تقليديا، كان تفرض غشاء تعسفية محتملة من دائرة خارجية التي تم قياس التيار الكهربائي عن طريق القنوات. وكشف هذا التقييم الكمي للجريان أيون في إمكانات غشاء مختلف الخصائص الجزيئية لهذه القنوات، مثل ما تخلل الأيوني الانتقائي والنابضة وظائف1،2. هو منهاج الدراسات الفنية لقنوات أيون الغشاء غشاء الخلية أو الغشاء بلير الدهن. تاريخيا، التسجيلات الحالية الكهربائية قناة واحدة أجريت أولاً في دهن بليرس3،4، وقد وضعت التقنيات ذات الصلة لأغشية الخلية، مثل أسلوب التصحيح-المشبك (الشكل 1أ )5،6. ومنذ ذلك الحين، تطورت هذه التقنيات اثنين بشكل منفصل لأغراض مختلفة (الشكل 1)7،8.
غشاء الدهون والأغشية بلير حاليا تركيز البحوث لأدوارها في دعم هيكل ووظيفة البروتينات القناة. ولذلك، توفر أساليب تختلف تركيبة المادة الدهنية في بليرس في ارتفاع الطلب. دهن bilayer تشكيل أساليب مثل الدهن مستو bilayer (الإرشاد)8،9،،من1011وقطرات الماء في النفط bilayer12الحبرية واجهة بيلايير (DIB)13، 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , تقنيات 19 (الشكل 1) هي الخيارات الشائعة، مما أتاح فرصة لدراسة وظيفة القناة تحت متفاوتة الدهن التراكيب20. على الرغم من بنك دبي الإسلامي أسهل بكثير من الناحية الفنية لإنتاج من الإرشاد التقليدية، حجم كبير من DIB أوجد عاملاً مثبطا للتصحيح--كلامبيرس لتطبيقه لدراسة التسجيلات الحالية قناة واحدة مع الحجم المعتاد الموصلية (< ملاحظة: 100).
للالتفاف على ضجيج الخلفية، يجب التقليل من منطقة بلير. وتذكر هذه المسألة تكراراً للتاريخ في تطوير التقنيات الكهربية للدهن بليرس (الشكل 1). في الأيام الأولى، شكلت bilayer صغيرة الحجم (1-30 ميكرومتر في القطر) في تلميح ماصة (تلميح--تراجع الأسلوب؛ الشكل 1 ج) 21 , 22 , 23، بدلاً من استخدام بلير بذاتها (~ 100 ميكرومتر في القطر) على حاجز مسعور في دائرة (الشكل 1ب). تلميح--تراجع الأسلوب يسمح للقياسات الكهربائية مع الكثير من الضوضاء الخلفية أقل24. أن تجاربنا مع25،26حزب البوابة المفتوحة وتلميح--تراجع22،،من2327، والتصحيح-المشبك28،،من2930، أساليب 31 أدت بنا إلى فكرة جديدة لتشكيل بليرس الدهن باستخدام مبادئ بلير الماء في النفط. أننا أشرنا إلى ذلك كفقاعة الاتصال بلير (مصرف البحرين المركزي) الأسلوب20،32. في هذا الأسلوب، بدلاً من أن تتدلى قطرات الماء في مرحلة نفط (الشكل 1د)، فقاعة مياه هو في مهب من ماصة زجاجية (مع تلميح قطرها حوالي 30 ميكرومتر) إلى مرحلة النفط (الشكل 1ه و 2)، حيث يتم الحفاظ على فقاعة بتطبيق ضغط ثابت. أشكال أحادي الطبقة تلقائياً على الواجهة المائية للنفط على سطح الفقاعة. ثم، يتم إرساء فقاعتين من خلال التلاعب باثنين الزجاج الماصات، وبلير هو تشكيل نقترب من مونولاييرس اثنين بعضها البعض، مما أسفر عن منطقة بلير توازن. يتم التحكم في حجم الفقاعة بالضغط داخل فقاعة (عقد الضغط)، وكذلك حجم بلير. كثيرا ما يستخدم متوسط قطرها 50 ميكرومتر. على الرغم من أن حجم الفقاعة الصغيرة (< 100 رر)، أنه متصل بحجم أكبر من الحل الماصة موجودة في نطاق ميكروليتير، التي تشكل المرحلة اﻻلكتروﻻيت السائبة.
هناك العديد من الفوائد لاستخدام أسلوب مصرف البحرين المركزي (الجدول 1). كأسلوب تشكيل bilayer دهني، يمكن إنتاج الأغشية المختلفة الدهن المؤلفات، والأغشية غير المتناظر هي المشكلة أكثر سهولة32 من تلك ب طريقة قابلة للطي التقليدية33. يمكن ميكانيكيا التلاعب في بيلايير، بخلاف حزب البوابة المفتوحة التقليدية التي يمكن أن تكون عازمة فقط مع ضغط الهيدروستاتي فرق34،35. عن طريق تغيير الضغط القابضة، الفقاعات أما توسيع أو تقليص, مما أدى إلى توتر الغشاء زيادة أو نقصان32. بلير انفصال ميكانيكيا في مونولاييرس، مشابهة لتقنية التجميد--كسر36،37 من الأغشية في الدراسات المورفولوجية، ولكن مع مصرف البحرين المركزي، يسمح بمناورة لتكرار فصل وإرفاق دورات32 . صغر حجم الحل المنحل بالكهرباء داخل الفقاعة يسمح الانصهار الفعال لتشكيل القناة الدهنية إلى بيلايير، واحتمال الحصول على تسجيلات قناة أعلى بكثير من تقنية الإرشاد التقليدية. حجم الفقاعة الصغيرة كما يسمح نضح السريع (داخل ~ 20 مللي ثانية) الحقن مرة أخرى ماصة يتم إدراجها في أي من الفقاعات. خلافا لأسلوب التصحيح-المشبك، مرة واحدة مكسورة، إعادة تشكيل غشاء مصرف البحرين المركزي فورا ومرارا وتكرارا، ويمكن استخدام الماصات عدة مرات في يوم. بدمج فوائد التصحيح-المشبك وأساليب الإرشاد، مصرف البحرين المركزي منبرا تنوعاً تختلف الظروف الفيزيائية للغشاء، مما يسمح لدراسات لم يسبق لها مثيل من التفاعلات غشاء القناة.
قبل عرض بروتوكول مفصل لعملية تشكيل مصرف البحرين المركزي، يقدم الخلفية الفيزيائية لتشكيل بلير الأولى والتي سوف تكون مفيدة للتصحيح--كلامبيرس لحل الصعوبات التجريبية المتصلة بتكوين غشاء التي تصادف.
مصرف البحرين المركزي تجارب نقل الدروس المستفادة من علوم الكيمياء السطحية38. مصرف البحرين المركزي يشبه فقاعة صابون مهب من القش في الهواء، حيث المثل، فجرت فقاعة الماء في مذيب عضوي. واحد ستلاحظ أن فقاعة الماء يكاد مبالغا فيها عندما الدهون غشاء غير مضمنة في فقاعة الماء أو المذيبات العضوية. نظراً لغياب الدهون أمفيباثيك، التوتر السطحي في واجهة مياه-نفط عالية، وسوف يكون الضغط داخل فقاعة تهب فقاعة عالية. هذا تحقيق معادلة لابلاس (ΔP = 2 γ/R، ΔP هو الضغط داخل الفقاعة، γ هو التوتر السطحي، حيث R هو نصف قطر الفقاعة). عندما يكون تركيز الدهون في مرحلة العضوية أو الحل اﻻلكتروﻻيت عالية، كثافة الدهون في أحادي الطبقة يزيد، وفق ما تمليه الايسوثرم الامتزاز جيبس (-dγ = Γوأنا dµأنا، حيث Γأنا هو الفائض في السطح للمجمع، و μأنا هو الكيميائية المحتملة للمكون أنا)39، مما أدى إلى انخفاض التوتر السطحي وسهولة تشكيل فقاعة. في مصرف البحرين المركزي، يمكن ملاحظة بلير من زاوية عرضية (الشكل 2)، ومن زاوية الاتصال بين بلير وأحادي الطبقة قابلة للقياس. هذه الزاوية يمثل توازناً بين surface tensions من أحادي الطبقة وبيلايير (معادلة الشباب: γbi = γمو cos(θ)، γثنائية هو التوتر بيلايير، γمو هو التوتر أحادي الطبقة، حيث θ هي الزاوية الاتصال). التغيرات في زاوية الاتصال تشير إلى تغييرات في التوتر بيلايير، نظراً لأن التوتر أحادي الطبقة يتم تقييم التغيرات في زاوية الاتصال كوظيفة من وظائف الغشاء المحتملة (معادلة يونغ-ليبمان: γمو = جم الخامس2 /4 (cos (θ0)-cos (θالخامس))، جم هو السعة غشاء، الخامس هو الغشاء المحتملة، حيث θ0 و θالخامس هي زوايا الاتصال 0 وأم الخامس، على التوالي)40،41 ،42. عند إغلاق كافية فقاعتين، أنها نهج بعضها البعض تلقائياً. وهذا سبب قوة فإن دير فالس، ويمكن أن نلاحظ بصريا هذه العملية الحيوية في تشكيل مصرف البحرين المركزي.
نظام مصرف البحرين المركزي يتكون من مراحل متميزة: إلا وهي مرحلة نفط السائبة، الماء فقاعات مغطاة بطبقة من أحادي الطبقة، وبلير اتصال (الشكل 3). وهذه تذكرنا بمراحل متعددة في حزب البوابة المفتوحة، مثل الحيد المحتوية على المذيب حولها في مرحلة بلير ومرحلة عضوية رقيقة تقع باثنين مونولاييرس43،44. في مصرف البحرين المركزي، المستمر مع النشرة بلير المرحلة أحادي الطبقة، وجزيئات الدهن سهولة منتشر بين أحادي الطبقة والنشرة. المرحلة أحادي الطبقة يغطي معظم سطح الفقاعة، التي تشكل المرحلة الرئيسية التي تعمل كمستودع للدهون. لأن ذيل مسعور الدهون في أحادي الطبقة يمتد إلى الخارج إلى مرحلة النفط السائبة، يفتح الداخلية بيلايير أو لب مسعور إلى مرحلة النفط الجزء الأكبر. وهكذا، مادة مسعور حقنه في مرحلة النفط القريبة من بيلايير غير قادرة على سهولة الوصول إلى المناطق الداخلية بيلايير. هذا هو أسلوب نضح غشاء أننا قد وضعت مؤخرا45، الذي يتم تغيير تكوين الدهن في بيلايير سرعة (في غضون ثانية) أثناء التسجيلات الحالية قناة واحدة. ووجدنا أن محتوى الكولسترول في بيلايير يمكن التحكم في شكل قابل للعكس بتبديل نضح الكولسترول وإيقاف45. في حالة ما إذا يختلف تركيز المواد ذات الصلة في أحادي الطبقة، وبلير، الانحدار تركيز المواد ذات الصلة فورا حل من خلال نشرها، الذي يعرف باسم تأثير Marangoni46، 47-من ناحية أخرى، هي المتأرجح عبر مونولاييرس بطء48،،من4950.
استخدام الأسلوب مصرف البحرين المركزي، يتشكل في بيلايير تحت الظروف الفيزيائية تنوعاً، مثل درجة حموضة اﻻلكتروﻻيت منخفضة تصل إلى 1 51وتركيز ملح (ك+، نا+، إلخ.) ما يصل إلى 3 متر وإمكانات غشاء مرتفعا كما ±400 mV ونظام درجة حرارة تصل إلى 60 درجة مئوية.
هناك عدة خيارات لتشكيل مصرف البحرين المركزي والتأسيس لجزيئات قناة فيه. لتشكيل المونولاير على الواجهة المائية للنفط، تضاف الدهون أما في مذيب عضوي (الأسلوب من الدهن؛ الشكل 4 أ، ج 4) أو في فقاعة الدهنية (الدهون في الأسلوب؛ الشكل 4 و ب، 4 د). جدير بالذكر أن المادة الدهنية في الأسلوب يسمح لتشكيل الأغشية غير المتناظر15،32. قناة جزيئات قابلة للذوبان في المحلول (مثلاً، تشكل قناة الببتيدات) مباشرة تضاف إلى52،فقاعة (الشكل 4أ، ب)53، بينما البروتينات قناة يتم تشكيلها في الدهنية، ثم تضاف إلى الفقاعة (الشكل 4ج، د). وهنا، تشكيل كبس بطريقة الدهن في أما ببتيد قناة (بوليثيوناميدي ب (pTB)؛ الشكل 4 A) أو يظهر بروتين (ككسا البوتاسيوم القناة، الشكل 4ج).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:607px;" width="605">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">Azolectin (L-&#945;-Phosphatidylcholine, Type IV-S)</td>
			<td style="width:85px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">P3644</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:219px;">A/D Converter</td>
			<td style="width:85px;">Molecular Divices</td>
			<td style="width:124px;">Digidata1550A</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">Ag/AgCl electrode</td>
			<td style="width:85px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:124px;">64-1317</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Bath Sonicator</td>
			<td style="width:85px;">Branson</td>
			<td style="width:124px;">M1800H-J</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">Camera</td>
			<td style="width:85px;">Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:124px;">C11440-10C</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:219px;">Glass Capillary</td>
			<td style="width:85px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:124px;">30-0062</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Hepes</td>
			<td style="width:85px;">Dojindo</td>
			<td style="width:124px;">342-01375</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:219px;">Hole Slideglass</td>
			<td style="width:85px;">Matsunami Glass</td>
			<td style="width:124px;">S339929</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Inverted Microscope</td>
			<td style="width:85px;">Olympus</td>
			<td style="width:124px;">IX73</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Isolation Table</td>
			<td style="width:85px;">Herz</td>
			<td style="width:124px;">TDI-86LA(Y)2</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Micro Injenctor</td>
			<td style="width:85px;">Narishige</td>
			<td style="width:124px;">IM-11-2</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Micro Manipulator</td>
			<td style="width:85px;">Narishige</td>
			<td style="width:124px;">EMM</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Microforge</td>
			<td style="width:85px;">Narishige</td>
			<td style="width:124px;">MF-830</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Micropipette holder</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">n-Hexadecane</td>
			<td style="width:85px;">Nacalai</td>
			<td style="width:124px;">07819-32</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Patch-Clamp Amplifier</td>
			<td style="width:85px;">HEKA</td>
			<td style="width:124px;">EPC800</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">Pipette Puller</td>
			<td style="width:85px;">Sutter Instrument Co.</td>
			<td style="width:124px;">P-87</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine)</td>
			<td style="width:85px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:124px;">850457</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:219px;">POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine 
			)</td>
			<td style="width:85px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:124px;">850757</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">POPG (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) )</td>
			<td style="width:85px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:124px;">840457</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:85px;">Nacalai</td>
			<td style="width:124px;">28514-75</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Rotary Evapolator</td>
			<td style="width:85px;">Iwaki</td>
			<td style="width:124px;">REN-1000</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Succinic Acid</td>
			<td style="width:85px;">Nacalai</td>
			<td style="width:124px;">32402-05</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Vacuum Pump</td>
			<td style="width:85px;">Buchi</td>
			<td style="width:124px;">V-100</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lipid bilayer experiments with contact bubble bilayers for patch-clampers

دهن بليرس توفير منصة تجريبية فريدة من نوعها للدراسات الفنية من قنوات أيون، مما يتيح دراسة التفاعلات غشاء القناة تحت غشاء مختلف التراكيب الدهن. فيما بينها، وقد اكتسب bilayer واجهة الحبرية شعبية؛ ومع ذلك، حجم كبير الغشاء يعوق تسجيل منخفضة الضوضاء الكهربائية. وقد أنشأنا أسلوب بلير (مصرف البحرين المركزي) فقاعة اتصال الذي يجمع بين فوائد الدهن مستو بلير وأساليب التصحيح-المشبك، مثل القدرة على تكوين الدهن وتختلف والتلاعب الميكانيكا بلير، على التوالي. استخدام برنامج الإعداد لتجارب المشبك التصحيح التقليدية، التجارب المستندة إلى مصرف البحرين المركزي يمكن سهولة إجراء. باختصار، هو حلاً المنحل بالكهرباء في ماصة زجاجية في مهب إلى مرحلة المذيبات عضوية (هيكساديكان)، وهو الإبقاء على الضغط ماصة للحصول على حجم فقاعة مستقرة. الفقاعة عفويا تصطف دهن أحادي الطبقة (الدهون نقية أو الدهون المختلطة)، التي يتم توفيرها من الدهنية في الفقاعات. بعد ذلك، يتم إرساء (~ 50 ميكرومتر في القطر) مبطنة أحادي الطبقة فقاعتين في غيض الماصات الزجاجية لتشكيل بيلايير. إدخال تشكيل القناة الدهنية في الفقاعة يؤدي إلى دمج القنوات في بيلايير، مما يسمح لتسجيل قناة واحدة الحالية مع نسبة الإشارة إلى الضوضاء يمكن مقارنته بتسجيلات المشبك التصحيح. يتم تشكيل كبس مع تكوين دهن غير متماثل سهولة. مصرف البحرين المركزي يتجدد مرارا وتكرارا بتطاير الفقاعات السابقة وتشكيل شراكات جديدة. اضطرابات كيميائية وفيزيائية مختلفة (مثلوغشاء نضح والتوتر bilayer) يمكن أن تفرض على كبس. هيرين، نقدم الإجراء الأساسي لإنشاء مصرف البحرين المركزي.

نموذجي مصرف البحرين المركزي قد يبلغ قطرها 50 ميكرومتر (الشكل 5، 6) والسعة الغشاء محددة في هيكساديكان 0.65 µF/سم2. ويسيطر حجم الفقاعة تعسفاً من الضغط داخل فقاعة. عندما فقاعات صغيرة ضرورية لتسجيلات منخفضة الضوضاء، ينبغي أن تكون قطر تلميح صغيرة في ?...

Watch this Scientific Journal Video about Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers at JoVE.com

Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers

نقدم هنا، بروتوكولا لتشكيل بليرس الدهن باستخدام أسلوب بلير اتصال فقاعي. هو مهب فقاعة مياه في المذيبات عضوية، حيث تتشكل من أحادي الطبقة على الواجهة المائية للنفط. يتم التلاعب بها الماصات اثنين لإرساء فقاعات لتشكيل من بلير.

دهن بلير التجارب مع بليرس فقاعة الاتصال للتصحيح--كلامبيرس

Lipid bilayers provide a unique experimental platform for functional studies of ion channels, allowing the examination of channel-membrane interactions ...

طريقة الاتصال فقاعة Bilayer هو أسلوب بديل لBilayers الدهون التقليدية. وهذه الطريقة تسمح الاهتزاز أكثر تنوعا من خلال الغشاء. تدمج طريقة مصرف البحرين المركزي فوائد Planar Lipid Bilayer وطريقة المشبك التصحيح.كما تقنية ثنائي الطبقات الدهون يمكن تشكيل مصرف البحرين المركزي مع تكوين الدهون التعسفي. لقد قمنا بتطوير مصرف البحرين المركزي لتسجيلات قناة واحدة الحالية مع إشارة عالية إلى نسبة الضوضاء. هذه الطريقة تسمح أصناف من الاهتزازات الأغشية ويوفر منصة نوع واسعة لواجهة غشاء القناة.وقد شهدت الجميع تهب فقاعة الصابون. يتم اتخاذ مناورات مماثلة لتشكيل مصرف البحرين المركزي عن طريق ضبط يدويا الضغط المطبق بدلا من تهب عن طريق الفم. ممارسة والتمتع مصرف البحرين المركزي.إلى أن يكون هذا الإجراء تفريق فوسفوليبيدات في الكلوروفورم في التركيز المطلوب في قارورة قاع مستديرة. ضع محلول فوسفوليبيد على مبخّر دوار متصل باسطوانة غاز النيتروجين. قم بتدوير القارورة تحت تدفق النيتروجين في درجة حرارة الغرفة حتى يظهر فيلم فوسفوليبيد رفيع.في المكان التالي قارورة مفتوحة في مجففات متصلة بمضخة فراغ. باستخدام مضخة فراغ التعرق داخل جهاز الزهية لعدة ساعات لإزالة الكلوروفورم تماما. في وقت لاحق إضافة حجم مناسب من محلول المنحل بالكهرباء إلى القارورة وتعليق فوسفوليبيد للحصول على اثنين ملليغرامة في المليلتر تعليق فوسفوليبيد.Sonciate تعليق لمدة 20 إلى 30 ثانية باستخدام sonicator حمام للحصول على تعليق حايصلة متعددة الطبقات. لإعداد البروتينات التي تحتوي على بروتينات قناة أيون، إضافة محلول البروتين إلى تعليق vesicle متعدد الطبقات. و sonicate لعدة ثوان باستخدام صوتناتور الحمام.لإعداد ماصات زجاجية كبيرة تتحمل، وضع الشعيرية الزجاجية في سحب ماصة وتلفيق micropipette مع طرف مدبب غرامة من خلال سحب خطوتين. ثم تعيين micropipette على اقامة صغيرة والاتصال غيض من micropipette إلى خيوط البلاتين في جزء مدبب مع قطر من 30 إلى 50 ميكرومتر. تسخين خيوط لفترة وجيزة وعلى الفور إيقاف تشغيله.استخدام الماء المقطر والإيثانول تنظيف سطح الشريحة الزجاجية مع بئر ضحلة. تطبيق المقبل كاشف السيليكون على الشريحة الزجاجية والسماح للمكشف الجافة تماما في الهواء. ثم ضع الشريحة الزجاجية على خشبة المجهر المقلوب.إضافة 100 ميكرولترات من الهكاديكا في البئر الضحلة من الشريحة الزجاجية سيليكونيد. باستخدام حقنة الدرملولين ملء محلول المنحل بالكهرباء تصل إلى نصف طول micropipette. المقبل تعيين micropipette على حامل micropipette مع ميناء الضغط، مما يسمح للفضة / كلوريد الفضة الأسلاك القطب لنقع في محلول إلتروليت ماص.ربط واحدة من أصحاب micropipette إلى المرحلة الرأسية من مضخم المشبك التصحيح والآخر إلى الأرض الكهربائية. في وقت لاحق ربط ناخن صغير إلى ميناء الضغط من حامل micropipette. ضبط micropipette إلى موقف مناسب فوق مرحلة المجهر المقلوب باستخدام ميكرو مانايبولاتور.لضبط إمكانات إزاحة القطب الكهربائي، ضع ميكرولتر واحد من نفس الحل المنحل بالكهرباء المستخدم لملء ميكروسيبيت على السطح المسطح حول البئر الضحلة للشريحة الزجاجية لإنشاء قبة المنحل بالكهرباء. نقع غيض من كل micropipettes في قبة المنحل بالكهرباء. بعد ذلك ضبط القطب إزاحة المحتملة من مضخم المشبك التصحيح.لرسم حل liposome من طرف، إضافة ميكرولتر واحد من محلول liposome على سطح مستو حول البئر الضحلة من الزجاج الشريحة. التالي في مكان غيض من micropipette في ليبوسومات تحتوي على قبة. التعرق liposome التي تحتوي على حل باستخدام ناخن microinctor.كرر الإجراء لميركوبيت الأخرى لالتعرق قناة ليبوسومات إعادة تشكيلها. الآن ضع من micropipette في hexadecane في البئر الضحلة. ضربة فقاعة المياه ببطء عن طريق زيادة الضغط حتى تصل الفقاعة إلى الحجم المطلوب والحفاظ على نفس الضغط بعد ذلك.تجاهل الفقاعة بتمرير الطرف عبر واجهة الزيت والهواء إذا كان من الصعب الحفاظ على حجم الفقاعة مستقرًا. كرر الإجراءات حتى يتم تشكيل اثنين من فقاعات مستقرة. إقامة اتصال بين الفقاعتين.صقل الضغط للحفاظ على حجم الفقاعة، لأن الحجم قد يتغير تدريجيا حتى في الضغط المستمر داخل فقاعة. تعيين الغشاء المحتملة إلى القيمة المناسبة باستخدام مضخم المطالبة التصحيح وانتظر القناة الحالية لتظهر. للحصول على تكوين ثنائي الطبقات الدهون مستقرة من الضروري لتنظيف النقع.يجب غسل الشعيرات الدموية أو الماصات الزجاجية بشكل دقيق وتجنب التلوث بجزيئات المنظفات. مرة واحدة قد شكلت مصرف البحرين المركزي جزيئات القناة إما في محلول مائي أو في liposome تم إدراجها تلقائيا في bilayer في غضون بضع إلى عشرات الدقائق. تم تأكيد عمليات إدخال القنوات من خلال الزيادة الحكيمة في السعة الحالية في ظل إمكانية الغشاء التطبيقي.يمكن أن تتفكك طبقة ثنائية شكلتها طريقة مصرف البحرين المركزي إلى اثنين monolayers. ظهرت قناة pTB الحالية مباشرة بعد إرفاق اثنين monolayers. وأصبح التيار أكبر كما هي من الاتصال زيادة السعة من التيار تزامنت مع معالجة إرفاق فصل من مصرف البحرين المركزي.إذا كان عدد ضربات الفقاعات يزيد من تركيز الدهون في محلول مائي يقلل ولم يتم تشكيل monolayer. ثم حاول تخفيف الضغط على قسم الدهون. مرة واحدة يتم تأسيس تشكيل مصرف البحرين المركزي وإعادة تشكيل قناة يمكنك محاولة لتغيير تكوينات من محلول مائي والغشاء عن طريق الإسراف أو حقن مواد محمّة أو محمّة.وقد فتحت طريقة مصرف البحرين المركزي طرقاً متعددة لاستكشاف التفاعلات بين غشاء القناة.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Neuroscience

Unit 1

Channels and the Electrical Properties of Membranes

SCIENTISTS IN ACTION

Functional Mapping with Simultaneous MEG and EEG

تعيين وظيفي مع MEG الفورية وEEG

We use magnetoencephalography (MEG) and electroencephalography (EEG) to locate and determine the temporal evolution in brain areas involved in the ...

Combining Computer Game-Based Behavioural Experiments With High-Density EEG and Infrared Gaze Tracking

الجمع بين لعبة الكمبيوتر المستندة إلى تجارب السلوكي مع ارتفاع الكثافة تتبع النظرة EEG والأشعة تحت الحمراء

Experimental paradigms are valuable insofar as the timing and other parameters of their stimuli are well specified and controlled, and insofar as they ...

Examining Local Network Processing using Multi-contact Laminar Electrode Recording

دراسة تصنيع المحلي باستخدام شبكة الاتصال متعدد القطب تسجيل رقائقي

Cortical layers are ubiquitous structures throughout neocortex1-4 that consist of highly recurrent local networks. In recent years, significant progress ...

Closed-loop Neuro-robotic Experiments to Test Computational Properties of Neuronal Networks

حلقة مغلقة العصبية الروبوتية تجارب لاختبار خصائص الحاسوبية من الشبكات العصبية

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation ...

SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy

فيوجن بوساطة كمين لواحدة Proteoliposomes مع طبقات ثنائية المدعومة المربوطة في خلية ميكروفلويديك تدفق رصدت من قبل المستقطبة TIRF المجهري

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. ...

Fabrication of High Contact-Density, Flat-Interface Nerve Electrodes for Recording and Stimulation Applications

تصنيع عالية الاتصال الكثافة، مسطحة واجهة أقطاب العصب للتسجيل وتحفيز تطبيقات

Many attempts have been made to manufacture multi-contact nerve cuff electrodes that are safe, robust and reliable for long term neuroprosthetic ...

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

إعداد شرائح الشبكية الطازجة من الزرد الكبار السابقين فيفو التصوير تجارب

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding ...

Conducting Hyperscanning Experiments with Functional Near-Infrared Spectroscopy

إجراء تجارب هايبرسكانينج مع الفنية القريبة من الأشعة تحت الحمراء الطيفي

Concurrent brain recordings of two or more interacting persons, an approach termed hyperscanning, are gaining increasing importance for our understanding ...

Using Neuron Spiking Activity to Trigger Closed-Loop Stimuli in Neurophysiological Experiments

استخدام العصبية النشاط Spiking لتحريك المحفزات حلقه مغلقه في التجارب الفسيولوجية العصبية

Closed-loop neurophysiological systems use patterns of neuronal activity to trigger stimuli, which in turn affect brain activity. Such closed-loop systems ...

Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments

جيل من Oligodendrocytes وOligodendrocyte- متوسطة مكيفة للتجارب الثقافة المشتركة

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials ...