Name: lipid bilayer experiments with contact bubble bilayers for patch-clampers
Uploaded: 2019-01-16T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke Mariko Yamatake og Masako Takashima for teknisk bistand. Dette arbejde blev støttet i en del af KAKENHI grant numre 16H 00759 og 17 H 04017 (så).

1. Forbered Liposomer
<ol><li>Sprede fosfolipider (f.eks, 10 mg pulveriserede) i kloroform ved en ønskede koncentration (f.eks, 10 mg/mL).</li>
	<li>Fordampe chloroform.<ol>
<li>Sted phospholipid løsning i en runde-bunden kolbe og sæt den på en roterende fordamper (Se Tabel af materialer) tilsluttet en N2 gas cylinder. Rotere kolben under N2 flow ved stuetemperatur, indtil en tynd phospholipid film vises (efter ~ 30 min).</li>
		<li>Åben kolben i en ekssikka...

Metoden CBB af lipid tolagede dannelse er baseret på princippet om en vand-i-olie droplet foret af en éncellelag20. Teknisk, procedurer for at danne CBBs er let, især for patch-clamp forskere, der er dygtige i manipulere glas Mikropipetter. Den elektrofysiologiske setup nemlig den lappe klemme bruges let i CBB, når to pipette manipulatorer med microinjectors er tilgængelige. På den anden side fordi CBB er en efterfølger til den konventionelle PLB, for hvilke en stor mængde af fysisk-kemisk...

For Ionkanaler er cellemembranen ikke blot en understøttende materiale, men en partner til at generere ion flux. Funktionelt, membranen er en elektrisk isolator som ion kanaler er integreret, og alle cellemembraner er formidles med en hvilende membran potentiale. Konventionelt, blev en vilkårlig membran potentiale indført fra et eksternt kredsløb som elektrisk strøm gennem kanalerne blev målt. Denne kvantitative evaluering af ion flux på forskellige membran potentialer afslørede de molekylære egenskaber af disse kanaler, såsom deres ion-selektiv gennemtrængning og gating funktioner1,2. Membran-platform for funktionelle studier af Ionkanaler er enten cellemembranen eller lipid tolagede membran. Historisk, enkanalet elektriske aktuelle optagelser blev uropført i lipid dobbeltlag3,4, og de relevante teknikker blev udviklet for cellemembraner, som metoden patch-klemme (figur 1A )5,6. Siden da har disse to teknikker har udviklet sig separat til forskellige formål (figur 1)7,8.
Membran lipider og tolagede membraner er i øjeblikket genstand for forskning for deres roller i støtte struktur og funktion af proteiner, kanal. Derfor er klar tilgængeligheden af metoder til at variere lipid sammensætning i dobbeltlag i høj efterspørgsel. Lipid tolagede dannelse metoder såsom planar lipid tolagede (PLB)8,9,10,11, vand-i-olie droplet tolagede12og slipværktøj interface tolagede (DIB)13, 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 teknikker (figur 1) er fælles valg, give mulighed for at undersøge funktionen kanal under varierende lipid kompositioner20. Selv om DIB er teknisk meget lettere at producere end de konventionelle PLB, den store størrelse af DIB'EN har skabt en hæmsko for patch-clampers til at anvende det til at studere enkanalet aktuelle optagelser med sædvanlige mellemstore ledningsevne (< 100 pS).
For at omgå baggrundsstøjen, skal området tolagede minimeres. Denne sag minder om gentagelser af historie i udvikle elektrofysiologiske teknikker for lipid dobbeltlag (figur 1). I de tidlige dage, blev en små tolagede (1-30 µm i diameter) dannet på spidsen af en pipette (tip-dip metode; Figur 1 C) 21 , 22 , 23, fremfor at bruge et fritstående tolagede (~ 100 µm i diameter) på en hydrofobe septum i et kammer (figur 1B). Tip-dip metode tilladt for elektriske målinger med meget lavere baggrund støj24. Vores erfaringer med PLB-25,26, tip-dip22,23,27og patch-clamp28,29,30, 31 metoder førte os til en roman idé med at danne lipid dobbeltlag ved hjælp af principperne om vand i olie tolagede. Vi har nævnt dette som kontakt boble tolagede (CBB) metode20,32. I denne metode, i stedet for at hænge vanddråber i en olie fase (fig. 1D), en vand boble er sprunget fra et glas pipette (med tip diameter af ca. 30 µm) ind i olie fase (figur 1E og 2), hvor den boble bevares ved at anvende en konstant pres. En éncellelag former spontant på grænsefladen vand-olie på overfladen af boble. Derefter to bobler er forankret gennem manipulation af to glas pipetter, og tolagede er dannet da de to encellelag nærmer sig hinanden, giver en ligevægt tolagede område. Størrelsen af boblen er kontrolleret af de intra-boble pres (holding pres), og ligeledes tolagede størrelse. En gennemsnitlig diameter på 50 µm bruges ofte. Selv om mængden af boblen er lille (< 100 pL), den er forbundet til den større mængde af den pipette løsning, der er i området microliter, der udgør hovedparten elektrolyt fase.
Der er mange fordele ved at bruge metoden CBB (tabel 1). Som en lipid tolagede dannelse teknik, membraner i forskellige lipid kompositioner kan produceres og asymmetriske membraner er mere let dannede32 end er dem af de konventionelle folde metode33. Tolagede kan manipuleres mekanisk, i modsætning til de konventionelle PLB, der kun kan være bøjet med en hydrostatisk tryk forskel34,35. Ved at ændre bedrift pres, boblerne enten udvide eller formindske, fører til øget eller nedsat membran spænding32. Tolagede er mekanisk aftagelig i encellelag, svarende til fryse-fraktur teknik36,37 af membraner i morfologiske undersøgelser, men med CBB, en manøvre giver mulighed for gentagne løsrive og vedhæfte cyklusser32 . Den lille mængde af elektrolytten løsning inden boblen giver mulighed for effektiv fusion af kanal-rekonstitueres Liposomer til tolagede, og sandsynligheden for at få kanal optagelser er meget højere end med de konventionelle PLB teknik. Lille boble volumen tillader også hurtig perfusion (inden for ~ 20 ms) en gang en anden injektion pipette er indsat i enten af boblerne. I modsætning til metoden patch-klemme når brudt, en CBB membran er re-formes straks og gentagne gange og pipetter kan bruges flere gange om dagen. Ved at integrere fordelene patch-clamp og PLB metoder, giver CBB en alsidig platform for at variere de fysisk-kemiske betingelser af membran, giver mulighed for hidtil uset undersøgelser af kanal-membran interaktioner.
Forelægge en detaljeret protokol af CBB dannelsen processen, er fysisk-kemiske baggrunden af tolagede dannelsen præsenteret første, som vil være nyttige for patch-clampers at løse eksperimentelle problemer vedrørende membran dannelse der er stødt på.
CBB eksperimenter give lektioner af overfladekemi videnskab38. CBB ligner en sæbeboble, blæst fra en halm i luften, hvor ligeledes en vand boble er blæst ind i et organisk opløsningsmiddel. Man vil bemærke, at en vand boble næppe er oppustet når membran lipider ikke er inkluderet i vand boblen eller den organisk opløsningsmiddel. I mangel af amphipathic lipider, overfladespænding på en vand-olie interface er høj, og intra-boble presset til at blæse en boble vil være høj. Dette er en erkendelse af Laplace ligning (Δp = 2 γ/R, hvor Δp er intra-boble pres, γ er overfladespænding, og R er boble radius). Når koncentrationen af lipider i enten den organiske fase eller elektrolyt opløsning er høj, tætheden af lipider i éncellelag stiger, da dikteres af Gibbs adsorption isoterm (-dγ = Γjeg dµjeg, hvor Γ,jeg er den overflade overskydende af sammensatte jeg, og µ,jeg er den kemiske potentiale af komponent jeg)39, fører til en lavere overfladespænding og lethed af boble dannelse. I CBB, tolagede kan ses fra en tangential vinkel (figur 2), og kontakt vinklen mellem éncellelag og tolagede er målelige. Denne vinkel repræsenterer en ligevægt mellem surface tensions af éncellelag og tolagede (unge ligning: γbi = γmo cos(θ), hvor γbi er tolagede spændinger, γmo er éncellelag spænding og θ er den kontakte vinkel). Ændringer i den kontaktperson vinkel angiver ændringer i tolagede spænding, da der éncellelag spændinger er vurderes ud fra ændringer i den kontaktperson vinkel som en funktion af membran potentiale (Young-Lippmann ligning: γmo = Cm V2 /4 (cos (θ0) - cos (θv)), hvor Cm er membran kapacitans, V er membran potentiale, og θ0 og θv er de kontakt vinkler på 0 og V mV, henholdsvis)40,41 ,42. Når to bobler er tæt nok, nærmer de hinanden spontant. Dette er på grund af van der Waals kraft, og vi kan visuelt observere denne dynamiske proces i CBB dannelse.
Et CBB system består af særskilte faser: nemlig en bulk olie fase, vand bobler belagt med en éncellelag og en kontakte tolagede (figur 3). Disse er minder om flere faser observeret i en PLB, såsom en opløsningsmiddel-holdige torus omkring den tolagede og en tynd organiske fase klemt af to encellelag43,44. I CBB, éncellelag fasen er løbende med tolagede folder og lipid molekyler diffuse let mellem éncellelag og indlægssedlen. Éncellelag fasen dækker det meste af den boble overflade, der udgør den store fase, der fungerer som et lipid reservoir. Fordi den hydrofobe hale af lipider i éncellelag udvider udad til bulk olie fase, åbner kraterets tolagede eller den hydrofobe core til bulk olie fase. En hydrofobe stof sprøjtes ind i olie fase tæt på tolagede er således let adgang kraterets tolagede. Dette er den membran perfusion teknik vi havde udviklet for nylig45, hvorved lipid sammensætning i tolagede ændres hurtigt (inden for et sekund) under single-channel nuværende optagelser. Vi fandt, at kolesterol indhold i tolagede reversibelt kunne kontrolleres ved at skifte kolesterol perfusion og slukker45. I tilfælde af, at koncentrationen af det pågældende stof i éncellelag og tolagede adskiller sig, opløses koncentration graduering af det relevante stof straks gennem diffusion, der er kendt som Marangoni effekt46, 47. på den anden side flip-flops på tværs af encellelag er langsom48,49,50.
Ved hjælp af metoden CBB, tolagede dannes under alsidig fysisk-kemiske forhold, såsom en elektrolyt pH så lavt som 1 51, salt (K+, Na+, osv.) koncentration op til 3 M, en membran potentiale så højt som ±400 mV og et system temperatur på op til 60 ° C.
Der er flere muligheder for dannelsen af CBB og indarbejdelse af kanal molekyler deri. For dannelsen af éncellelag på grænsefladen vand-olie, er lipider tilføjet enten i et organisk opløsningsmiddel (lipid-out metode; Figur 4 A, 4 C) eller i en boble som Liposomer (lipid-i metode; Figur 4 B, 4 D). Navnlig, lipid-i metode giver mulighed for dannelse af asymmetriske membraner15,32. Kanal molekyler opløseligt i vandig opløsning (fx, kanal-dannende peptider) tilføjes direkte ind i den boble (figur 4A, B)52,53, hvorimod kanal proteiner er fremstillet i Liposomer, der tilføjes derefter ind i boblen (figur 4C, D). Heri, dannelsen af CBBs af lipid-i-metoden til enten en kanal peptid (polytheonamide B (pTB); Figur 4 A) eller et protein (KcsA kalium kanal, figur 4C) er vist.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:607px;" width="605">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">Azolectin (L-&#945;-Phosphatidylcholine, Type IV-S)</td>
			<td style="width:85px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">P3644</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:219px;">A/D Converter</td>
			<td style="width:85px;">Molecular Divices</td>
			<td style="width:124px;">Digidata1550A</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">Ag/AgCl electrode</td>
			<td style="width:85px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:124px;">64-1317</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Bath Sonicator</td>
			<td style="width:85px;">Branson</td>
			<td style="width:124px;">M1800H-J</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">Camera</td>
			<td style="width:85px;">Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:124px;">C11440-10C</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:219px;">Glass Capillary</td>
			<td style="width:85px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:124px;">30-0062</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Hepes</td>
			<td style="width:85px;">Dojindo</td>
			<td style="width:124px;">342-01375</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:219px;">Hole Slideglass</td>
			<td style="width:85px;">Matsunami Glass</td>
			<td style="width:124px;">S339929</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Inverted Microscope</td>
			<td style="width:85px;">Olympus</td>
			<td style="width:124px;">IX73</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Isolation Table</td>
			<td style="width:85px;">Herz</td>
			<td style="width:124px;">TDI-86LA(Y)2</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Micro Injenctor</td>
			<td style="width:85px;">Narishige</td>
			<td style="width:124px;">IM-11-2</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Micro Manipulator</td>
			<td style="width:85px;">Narishige</td>
			<td style="width:124px;">EMM</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Microforge</td>
			<td style="width:85px;">Narishige</td>
			<td style="width:124px;">MF-830</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Micropipette holder</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">n-Hexadecane</td>
			<td style="width:85px;">Nacalai</td>
			<td style="width:124px;">07819-32</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Patch-Clamp Amplifier</td>
			<td style="width:85px;">HEKA</td>
			<td style="width:124px;">EPC800</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">Pipette Puller</td>
			<td style="width:85px;">Sutter Instrument Co.</td>
			<td style="width:124px;">P-87</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine)</td>
			<td style="width:85px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:124px;">850457</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:219px;">POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine 
			)</td>
			<td style="width:85px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:124px;">850757</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">POPG (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) )</td>
			<td style="width:85px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:124px;">840457</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:85px;">Nacalai</td>
			<td style="width:124px;">28514-75</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Rotary Evapolator</td>
			<td style="width:85px;">Iwaki</td>
			<td style="width:124px;">REN-1000</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Succinic Acid</td>
			<td style="width:85px;">Nacalai</td>
			<td style="width:124px;">32402-05</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Vacuum Pump</td>
			<td style="width:85px;">Buchi</td>
			<td style="width:124px;">V-100</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lipid bilayer experiments with contact bubble bilayers for patch-clampers

Lipid dobbeltlag giver en unik eksperimentelle platform for funktionelle studier af Ionkanaler, giver undersøgelsen af kanal-membran interaktioner under forskellige membran lipid kompositioner. Blandt dem, har droplet interface tolagede vundet popularitet; dog hindrer den store membran størrelse optagelsen af lav elektriske baggrundsstøj. Vi har etableret en kontakt boble tolagede (CBB) metode, der kombinerer fordelene ved planar lipid tolagede og patch-clamp metoder, såsom evnen til at variere lipid sammensætning og manipulere tolagede mekanik, henholdsvis. Ved hjælp af setup for konventionelle patch-clamp eksperimenter, kan CBB-baserede eksperimenter let udføres. Kort sagt, en elektrolyt opløsning i et glas pipette er blæst ind i et organisk opløsningsmiddel fase (hexadecane), og pipette trykket opretholdes til at opnå en stabil boblestørrelse. Boblen er spontant foret med et lipid éncellelag (ren lipider eller blandet lipider), som er leveret fra Liposomer i boblerne. Næste, de to éncellelag-foret bobler (~ 50 µm i diameter) på spidsen af glas pipetter er forankret til tolagede dannelse. Indførelsen af kanal-rekonstitueres Liposomer i boblen fører til inddragelsen af kanaler i tolagede, giver mulighed for single-channel nuværende optagelse med et signal / støj-forhold sammenlignes med patch-clamp optagelser. CBBs med en asymmetrisk lipid sammensætning der let dannes. CBB er fornyet gentagne gange af blæser ud de foregående bobler og danner nye. Forskellige kemiske og fysiske forstyrrelser (fx, membran perfusion og tolagede spænding) kan pålægges CBBs. Herein, præsenterer vi den grundlæggende procedure for CBB dannelse.

En typisk CBB havde en diameter på 50 µm (figur 56) og den specifikke membran kapacitans i hexadecane var 0,65 µF/cm2. Boble størrelsen var vilkårligt kontrolleret af intra-boble pres. Når små bobler er nødvendige for støjsvage optagelser, skal tip diameter være tilsvarende mindre. For eksempel, for en boble størrelsen af 50 µm i diameter, skal tip diameter være 30 µm.
<p class="jove_content" fo:keep-together.with...

Watch this Scientific Journal Video about Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers at JoVE.com

Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers

Vi præsenterer her, en protokol for dannelsen af lipid dobbeltlag ved hjælp af en kontakt boble tolagede metode. En vand boble er blæst ind i et organisk opløsningsmiddel, hvorved en éncellelag dannes på grænsefladen vand-olie. To pipetter er manipuleret til at forankre boblerne til at danne en tolagede.

Lipid tolagede eksperimenter med kontakt boble dobbeltlag for Patch-Clampers

Lipid bilayers provide a unique experimental platform for functional studies of ion channels, allowing the examination of channel-membrane interactions ...

Kontakt Bubble Bilayer-metoden er en alternativ teknik til konventionelle Lipid Bilayers. og denne metode giver mulighed for mere alsidige vibrationer gennem membranen. CBB-metoden integrerer fordelene ved Planar Lipid Bilayer og patch clamp-metoden.Som en lipid tolags teknik en CBB med en vilkårlig lipid sammensætning kan dannes. Vi har udviklet en CBB til enkeltkanalstrømsoptagelser med højt signal-støjforhold. Denne metode giver mulighed for sorter af membran vibrationer og tilbyder en stor type platform til kanalen membran interface.Alle har oplevet at sprænge en sæbeboble. Lignende manøvrer er taget for CBB dannelse ved manuelt finjustering af det anvendte tryk i stedet for at blæse gennem munden. Praksis og nyde CBB.Til dette er denne procedure sprede fosfolipider i chloroform i en ønsket koncentration i en rund bundkolbe. Fosfolipidopløsningen påsaneres på en roterende fordamper, der er tilsluttet en nitrogengasflaske. Kolben roteres under kvælstofstrømmen ved stuetemperatur, indtil der vises en tynd fosfolipidfilm.Næste sted den åbne kolbe i en eksikator, der er forbundet til en vakuumpumpe. Brug af vakuumpumpen aspirere indersiden af eksiccatoren i flere timer for at fjerne kloroformen grundigt. Der tilsættes derefter en passende mængde elektrolytopløsning til kolben, og fosfolipidet suspenderes for at opnå en suspension af to milligrmaer pr. milliliterphospholipidaffjedring.Suspensionen skal sonciteres i 20 til 30 sekunder ved hjælp af en badsonicator for at opnå en flerlaget vesicleaffjedring. Til fremstilling af proteoliposomer, der indeholder ionkanalproteiner, tilsættes en proteinopløsning til den flerlagede vesicleaffus suspension. Og sonikere i flere sekunder ved hjælp af bad sonicator.For at forberede store boring glas pipetter, placere et glas kapillær i en pipette puller og fremstille mikropipette med en fin tilspidset spids gennem to trin trække. Sæt derefter mikropipetten på en mikrosg smede og kontakt spidsen af mikropipetten til en platingløde i den koniske del med en diameter på 30 til 50 mikrometer. Varm glødetråden kortvarigt og sluk straks for den.Brug destilleret vand og ethanol rense overfladen af glas dias med en lavvandet brønd. Derefter påføres silikonerende reagens på glasrutsjebanen, og reagenset tørres helt i luften. Placer derefter glasrutsjebanen på scenen af et omvendt mikroskop.Tilføj 100 mikroliter hexadecane i den lavvandede brønd af silikoneglassliden. Ved hjælp af en tuberkulinsprøjte fylde elektrolytopløsningen op til halvdelen af længden af mikropipetten. Derefter sættes mikropipetten på mikropipetteholderen med trykporten, så sølv/sølvchloridtrådelektroden kan suge i pipettens elektrolytopløsning.Tilslut en af mikropipetteholderne til hovedstadiet i en patch klemmeforstærker og den anden til den elektriske jord. Tilslut derefter en mikroinjektor til mikropipetteholderens trykport. Juster mikropipetten til en passende position over scenen af et omvendt mikroskop ved hjælp af mikromanipulatoren.For at justere elektrodeforskydningspotentialet skal du placere en mikroliter af den samme elektrolytopløsning, der bruges til at fylde mikropipetten på den flade overflade omkring glasrutsjebanens lavvandede brønd for at skabe en elektrolytkuppel. Læg spidsen af begge mikropipetter i blød i elektrolytkuplen. Juster derefter elektrodeforskydningspotentialet for plastlemkleforstærkeren.For at trække liposom opløsningen fra spidsen, tilsæt en mikroliter liposom opløsning på den flade overflade omkring lavvandede godt af diasglasset. Næste sted spidsen af mikropipette i liposom indeholder kuppel. Aspirer liposomet indeholdende opløsning ved hjælp af mikroinjektoren.Gentag proceduren for den anden mircopipette for aspirerende kanal rekonstitueret liposomer. Nu placere mikropipette i hexadecane i lavvandet godt. Blæs langsomt en vandboble ved at øge trykket, indtil boblen når den ønskede størrelse, og hold det samme tryk derefter.Kassér boblen ved at føre spidsen gennem olie-luft-grænsefladen, hvis det er svært at holde boblens størrelse stabil. Gentag procedurerne, indtil der dannes to stabile bobler. Opret en kontakt mellem de to bobler.Finjuster trykket for at opretholde boblestørrelsen, fordi størrelsen gradvist kan ændre sig selv ved det konstante intrabobletryk. Indstil membranpotentialet til den relevante værdi ved hjælp af plasterforstærkeren, og vent på, at kanalstrømen opstår. For stabil lipid tolags dannelse er det vigtigt at rengøre blotters.Glas kapillær eller pipette forberedelse bør vaskes grundigt og undgå forurening af vaskemiddel molekyler. Når CBB havde dannet kanalen molekyler enten i vandig opløsning eller i liposomet blev spontant indsat i tolags inden for span af et par til snesevis af minutter. Indsætninger af kanalerne blev bekræftet af den trinvise stigning i den nuværende amplitude under det anvendte membranpotentiale.En tolagsdannet af CBB-metoden kan opløses i to monolage. PTB-kanalstrømen opstod umiddelbart efter fastgørelse af de to monolag. Og den nuværende blev større som er af kontakt øget amplitude af den nuværende blev synkroniseret med løsrive manipulation af CBB.Hvis antallet blæser ud af bobler øger lipidkoncentrationen i den vandige opløsning falder og monolaget ikke dannes. Så prøv at lette presset på liposom sektion. Når CBB formation og kanal rekonstitution er etableret, kan du forsøge at variere sammensætninger af vandig opløsning og membran via overflod eller indsprøjtning af hydrofile eller hydrofobe stoffer.CBB-metoden har åbnet alsidige måder at udforske kanalmembranens samspil på.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Neuroscience

Unit 1

Channels and the Electrical Properties of Membranes

SCIENTISTS IN ACTION

Functional Mapping with Simultaneous MEG and EEG

We use magnetoencephalography (MEG) and electroencephalography (EEG) to locate and determine the temporal evolution in brain areas involved in the ...

Combining Computer Game-Based Behavioural Experiments With High-Density EEG and Infrared Gaze Tracking

Experimental paradigms are valuable insofar as the timing and other parameters of their stimuli are well specified and controlled, and insofar as they ...

Examining Local Network Processing using Multi-contact Laminar Electrode Recording

Cortical layers are ubiquitous structures throughout neocortex1-4 that consist of highly recurrent local networks. In recent years, significant progress ...

Closed-loop Neuro-robotic Experiments to Test Computational Properties of Neuronal Networks

Lukket kredsløb Neuro-robot Eksperimenter til Test Computational egenskaber neuronale netværk

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation ...

SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy

SNARE-medieret Fusion af Single proteoliposomer med bundet understøttede dobbeltlag i en Mikrofluid Flow Cell Overvåget af Polariseret TIRF Microscopy

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. ...

Fabrication of High Contact-Density, Flat-Interface Nerve Electrodes for Recording and Stimulation Applications

Fabrikation af High Kontakt-Density, Fladskærms-interface Nerve Elektroder til Optagelse og Stimulation Applications

Many attempts have been made to manufacture multi-contact nerve cuff electrodes that are safe, robust and reliable for long term neuroprosthetic ...

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Forbereder frisk Retinal skiver fra voksen zebrafisk for Ex Vivo billeddannelse eksperimenter

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding ...

Conducting Hyperscanning Experiments with Functional Near-Infrared Spectroscopy

Gennemføre Hyperscanning eksperimenter med funktionelle nær-infrarød spektroskopi

Concurrent brain recordings of two or more interacting persons, an approach termed hyperscanning, are gaining increasing importance for our understanding ...

Using Neuron Spiking Activity to Trigger Closed-Loop Stimuli in Neurophysiological Experiments

Brug neuron spiking aktivitet til at udløse lukkede loop stimuli i neurofysiologiske eksperimenter

Closed-loop neurophysiological systems use patterns of neuronal activity to trigger stimuli, which in turn affect brain activity. Such closed-loop systems ...

Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments

Generation af Oligodendrocytes og Oligodendrocyte-Conditioned Medium for co-kultur eksperimenter

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials ...