Name: lipid bilayer experiments with contact bubble bilayers for patch-clampers
Uploaded: 2019-01-16T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers at JoVE.com

De auteurs bedank Mariko Yamatake en Masako Takashima voor technische bijstand. Dit werk werd gesteund gedeeltelijk door KAKENHI subsidie nummers 16H 00759 en 17 H 04017 (SO).

1. Prepareer liposomen
<ol><li>Dispergeren fosfolipiden (bijv, 10 mg in poedervorm) in chloroform op een gewenste concentratie (bijv, 10 mg/mL).</li>
	<li>Verdampen chloroform.<ol>
<li>Plaats de fosfolipide oplossing in een rondbodemkolf en reeks het op een rotatieverdamper (Zie Tabel van materialen) op een gasfles van N2 aangesloten . Draai de erlenmeyer onder N2 stroom bij kamertemperatuur totdat een dunne fosfolipide film (na ~ 30 min verschijnt).</li>
		<li>P...

De methode van het CBB van lipide dubbelgelaagde formatie is gebaseerd op het beginsel van een water-in-olie-droplet omzoomd door een enkelgelaagde20. Technisch, zijn de procedures voor de vorming van CBBs eenvoudig, vooral voor patch-clamp onderzoekers, die bedreven zijn in het manipuleren van glas micropipetten. Het elektrofysiologische setup voor de patch-clamp is gemakkelijk in het CBB gebruikt wanneer twee Pipetteer manipulators met microinjectors beschikbaar zijn. Aan de andere kant, omdat h...

Ionenkanalen is het celmembraan niet gewoon een ondersteunende materiaal maar een partner voor het genereren van de ion-flux. Functioneel, het membraan is een elektrische isolator welke ion kanalen zijn ingesloten, en alle celmembranen zijn bijgebracht met een rust membraanpotentiaal. Conventioneel, was een willekeurige membraanpotentiaal van een externe schakeling waarop elektrische stroom via de kanalen werd gemeten opgelegd. Deze kwantitatieve evaluatie van de ion-flux op verschillende membraan potentieel bleek de moleculaire eigenschappen van deze kanalen, zoals hun ion-selectieve permeatie en gating functies1,2. Het membraan platform voor functionele studies van ionenkanalen is de celmembraan of het membraan van de dubbelgelaagde lipide. Historisch, eenkanalig elektrische huidige opnames in première gingen lipide bilayers3,4, en de relevante technieken werden ontwikkeld voor celmembranen, zoals de methode van de patch-clamp (Figuur 1A )5,6. Sindsdien hebben deze twee technieken afzonderlijk ontwikkeld voor verschillende doeleinden (Figuur 1)7,8.
Membraan lipiden en dubbelgelaagde membranen zijn momenteel de focus van het onderzoek voor hun rol bij de ondersteuning van de structuur en functie van eiwitten van het kanaal. Daarom is de beschikbaarheid van methoden om te variëren van de samenstelling van lipide in bilayers in hoge vraag. Lipide dubbelgelaagde vorming methoden zoals de vlakke lipide dubbelgelaagde (PLB)8,9,10,11, water-in-olie druppel dubbelgelaagde12en druppel interface dubbelgelaagde (DIB)13, 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 technieken (Figuur 1) zijn gemeenschappelijke keuzen, bieden een gelegenheid voor de behandeling van de functie van de kanaal onder variërende lipide composities20. Hoewel de DIB technisch veel gemakkelijker is te produceren dan de conventionele PLB, de grote omvang van de DIB ontmoedigen patch-clampers toe te passen voor het bestuderen van één-kanaals huidige opnames met gebruikelijke middelgrote huidgeleiding heeft gemaakt (< 100 pS).
Om te omzeilen de achtergrondgeluiden, moet het dubbelgelaagde gebied worden geminimaliseerd. Deze kwestie roept de herhalingen van ervaring met het ontwikkelen van elektrofysiologische technieken voor lipide bilayers (Figuur 1). In de vroege dagen, werd een kleine dubbelgelaagde (1-30 µm in diameter) opgericht op het puntje van een pipet (tip-dip methode; Figuur 1 C) 21 , 22 , 23, in plaats van met behulp van een vrijstaande dubbelgelaagde (~ 100 µm in diameter) op een hydrofobe septum in een kamer (Figuur 1B). De tip-dip methode toegestaan voor elektrische metingen met veel lagere achtergrond lawaai24. Onze ervaringen met PLB25,26, tip-dip22,23,27, en patch-clamp28,29,30, 31 methoden leidde ons naar een nieuw idee van het vormen van lipide-bilayers met behulp van de beginselen van de water-in-olie dubbelgelaagde. Wij hebben dit als de contact zeepbel dubbelgelaagde (CBB) methode20,32genoemd. Bij deze methode in plaats van de waterdruppels opknoping in een olie-fase (Figuur 1D), een zeepbel van water is geblazen uit een glazen pipet (met tip diameter van ongeveer 30 µm) in de fase van de olie (Figuur 1E en 2), waar de Bubble wordt onderhouden door een constante druk uit te oefenen. Een enkelgelaagde vormen spontaan op het grensvlak water / olie op het oppervlak van de zeepbel. Vervolgens twee bubbels zijn gekoppeld door middel van de manipulatie van twee pipetten van glas en de dubbelgelaagde wordt gevormd als de twee monolayers aanpak elkaar, een evenwicht dubbelgelaagde gebied oplevert. De grootte van de bel wordt bepaald door de druk van de intra-bubble (holding druk), en eveneens de dubbelgelaagde grootte. Een gemiddelde diameter van 50 µm wordt vaak gebruikt. Hoewel het volume van de zeepbel klein is (< 100 pL), deze is aangesloten op het grotere volume van de pipet-oplossing die in het bereik van microliter, vormen de bulk elektrolyt fase.
Er zijn vele voordelen aan het gebruik van de methode CBB (tabel 1). Als een lipide dubbelgelaagde vorming techniek, membranen van verschillende lipide composities kunnen worden geproduceerd, en asymmetrische membranen zijn gemakkelijker gevormde32 dan die van de conventionele vouwen methode33. De dubbelgelaagde kan mechanisch worden gemanipuleerd, in tegenstelling tot de conventionele PLB die alleen kan worden gebogen met een hydrostatische druk verschil34,35. Door het veranderen van de druk van het bedrijf, de bubbels of vergroten of verkleinen, wat leidt tot verhoogde of verminderde membraan spanning32. De dubbelgelaagde is mechanisch afneembaar in monolayers, vergelijkbaar met de freeze-fractuur techniek36,37 van membranen in de morfologische studies, maar met de CBB, een manoeuvre maakt het mogelijk voor herhaalde loskoppelen en hechten cycli32 . De geringe omvang van de elektrolyt oplossing binnen de zeepbel staat efficiënte fusie van kanaal-gereconstitueerd liposomen in de dubbelgelaagde, en de kans op het krijgen van kanaal opnamen is veel hoger dan bij de conventionele PLB techniek. Het kleine Bel volume kunt snelle perfusie (binnen ~ 20 ms) ook eens een ander injectie Pipet is ingevoegd in een van de bubbels. In tegenstelling tot de methode van de patch-clamp, zodra gebroken, een membraan CBB opnieuw onmiddellijk en herhaaldelijk wordt gevormd en pipetten meerdere malen per dag kunnen worden gebruikt. Voordelen van de patch-clamp en PLB methoden te integreren, biedt de CBB een veelzijdig platform om te variëren van de fysisch-chemische voorwaarden van het membraan, waardoor voor ongekende studies van kanaal-membraan interacties.
Vóór de presentatie van een gedetailleerd protocol van het proces van de vorming van CBB, wordt de fysicochemische achtergrond van de vorming van dubbelgelaagde eerste, die nuttig zijn voor patch-clampers op te lossen van experimentele moeilijkheden met betrekking tot de vorming van het membraan gepresenteerd die worden aangetroffen.
CBB experimenten geven lessen voor Oppervlaktechemie wetenschap38. Het CBB is vergelijkbaar met een zeepbel geblazen uit een rietje in de lucht, waar ook een water-zeepbel is geblazen in een organisch oplosmiddel. Men zal merken dat een zeepbel water nauwelijks wordt opgeblazen wanneer membraan lipiden niet in de water-zeepbel of de organisch oplosmiddel opgenomen zijn. Bij gebrek aan amphipathic lipiden, de oppervlaktespanning bij een water-olie-interface is hoog, en de druk van de intra-bubble voor een zeepbel blazen hoog zal zijn. Dit is een realisatie van de Laplace-vergelijking (ΔP = 2 γ/R, waarbij ΔP de druk van de intra-bubble, γ is de oppervlaktespanning en R de straal van de zeepbel is). Wanneer de concentratie van lipiden in de organische fase of de elektrolyt oplossing hoog is, de dichtheid van lipiden in de enkelgelaagde toeneemt, zoals gedicteerd door de adsorptie-isotherm van Gibbs (-dγ = Γik dµik, waar Γik de oppervlakte overmaat is van samengestelde i en µik is de chemische potentiaal van component ik)39, wat leidt tot een lagere oppervlaktespanning en gebruiksgemak luchtbel vorming. In het CBB, de dubbelgelaagde kan worden waargenomen vanuit een tangentiële hoek (Figuur 2) en is de contacthoek tussen de enkelgelaagde en dubbelgelaagde meetbaar. Deze hoek vertegenwoordigt een evenwicht tussen de surface tensions van de enkelgelaagde en dubbelgelaagde (jonge vergelijking: γbi = γma cos(θ), waar γbi is de spanning dubbelgelaagde γma is de enkelgelaagde spanning en θ is de contacthoek). De veranderingen in de contacthoek geven wijzigingen in de dubbelgelaagde spanning, gezien het feit dat de enkelgelaagde spanning uit veranderingen in de contacthoek wordt geëvalueerd als een functie van de membraanpotentiaal (Young-Lippmann vergelijking: γmo = Cm V2 /4 (cos (θ0) - cos (θv)), waar Cm de capaciteit van de membraan is, V de membraanpotentiaal is en θ0 en θv de contacthoeken op 0 en V mV, respectievelijk zijn)40,41 ,42. Wanneer twee bubbels dicht genoeg zijn, benaderen ze elkaar spontaan. Dit is te wijten aan de van der Waals force, en wij kunnen dit dynamisch proces in CBB vorming visueel waarnemen.
Een CBB systeem bestaat uit verschillende fasen: namelijk een bulk olie fase, water van bubbels bekleed met een enkelgelaagde, en een contactmogelijkheden dubbelgelaagde (Figuur 3). Deze doen denken aan de meerdere fasen waargenomen in een PLB, zoals een oplosmiddel-houdende torus rond de dubbelgelaagde fase en een dunne organische fase ingeklemd door twee monolayers43,44. In het CBB, de enkelgelaagde fase is continu met de dubbelgelaagde bijsluiter en lipide moleculen diffuus gemakkelijk tussen de enkelgelaagde en de bijsluiter. De enkelgelaagde fase behandelt de meeste van het oppervlak van de zeepbel, vormen de belangrijke werkfase die als een lipide-reservoir fungeert. Omdat de hydrofobe staart van lipiden in de enkelgelaagde zich naar buiten tot de bulk olie fase uitstrekt, opent de dubbelgelaagde interieur of de hydrofobe kern voor de bulk olie fase. Een hydrofobe stof ingespoten in de olie-fase dichtbij de dubbelgelaagde is dus gemakkelijk toegang krijgen tot het dubbelgelaagde interieur. Dit is het membraan perfusie techniek dat we hadden ontwikkeld onlangs45, waarmee de samenstelling van lipide in de dubbelgelaagde snel (binnen een seconde) wordt gewijzigd tijdens één-kanaals huidige opnames. We vonden dat de cholesterol-gehalte in de dubbelgelaagde omkeerbaar kan worden gecontroleerd door het overschakelen van de cholesterol-perfusie, in- en uitschakelen45. In het geval dat de concentratie van de betrokken stof in de enkelgelaagde en dubbelgelaagde verschilt, wordt het verloop van de concentratie van de betrokken stof onmiddellijk ontbonden door diffusie, die bekend als de Marangoni effect46, staat 47. anderzijds, slippers over de monolayers zijn traag48,49,50.
Met behulp van de methode van het CBB, de dubbelgelaagde wordt gevormd onder veelzijdige fysisch-chemische omstandigheden, zoals een elektrolyt pH zo laag als 1 51, een concentratie zout (K+nb+, enz.) tot 3 M, een zo hoog als ±400 mV membraanpotentiaal en een systeem temperatuur tot 60 ° c.
Er zijn verschillende opties voor de vorming van het CBB en opneming van kanaal moleculen daarin. Voor de vorming van de enkelgelaagde op het grensvlak water / olie, zijn lipiden toegevoegd in een organisch oplosmiddel (lipide-out methode; Figuur 4 A, 4 C) of in een zeepbel als liposomen (lipide-in methode; Figuur 4 B, 4 D). Met name zorgt de lipide-in-methode voor de vorming van asymmetrische membranen15,32. Kanaal moleculen oplosbaar in waterige oplossing (bijvoorbeeld, kanaal-vormende peptiden) worden direct toegevoegd in de zeepbel (Figuur 4A, B)52,53, overwegende dat kanaal eiwitten zijn gereconstitueerd in liposomen, die vervolgens worden toegevoegd in de zeepbel (Figuur 4C, D). Hierin, de vorming van CBBs door de methode lipide-in voor ofwel een kanaal peptide (polytheonamide B (pTB); Figuur 4 A) of een eiwit (KcsA kalium kanaal, Figuur 4C) wordt weergegeven.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:607px;" width="605">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">Azolectin (L-&#945;-Phosphatidylcholine, Type IV-S)</td>
			<td style="width:85px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">P3644</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:219px;">A/D Converter</td>
			<td style="width:85px;">Molecular Divices</td>
			<td style="width:124px;">Digidata1550A</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">Ag/AgCl electrode</td>
			<td style="width:85px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:124px;">64-1317</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Bath Sonicator</td>
			<td style="width:85px;">Branson</td>
			<td style="width:124px;">M1800H-J</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">Camera</td>
			<td style="width:85px;">Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:124px;">C11440-10C</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:219px;">Glass Capillary</td>
			<td style="width:85px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:124px;">30-0062</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Hepes</td>
			<td style="width:85px;">Dojindo</td>
			<td style="width:124px;">342-01375</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:219px;">Hole Slideglass</td>
			<td style="width:85px;">Matsunami Glass</td>
			<td style="width:124px;">S339929</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Inverted Microscope</td>
			<td style="width:85px;">Olympus</td>
			<td style="width:124px;">IX73</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Isolation Table</td>
			<td style="width:85px;">Herz</td>
			<td style="width:124px;">TDI-86LA(Y)2</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Micro Injenctor</td>
			<td style="width:85px;">Narishige</td>
			<td style="width:124px;">IM-11-2</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Micro Manipulator</td>
			<td style="width:85px;">Narishige</td>
			<td style="width:124px;">EMM</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Microforge</td>
			<td style="width:85px;">Narishige</td>
			<td style="width:124px;">MF-830</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Micropipette holder</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">n-Hexadecane</td>
			<td style="width:85px;">Nacalai</td>
			<td style="width:124px;">07819-32</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Patch-Clamp Amplifier</td>
			<td style="width:85px;">HEKA</td>
			<td style="width:124px;">EPC800</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">Pipette Puller</td>
			<td style="width:85px;">Sutter Instrument Co.</td>
			<td style="width:124px;">P-87</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine)</td>
			<td style="width:85px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:124px;">850457</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:219px;">POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine 
			)</td>
			<td style="width:85px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:124px;">850757</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">POPG (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) )</td>
			<td style="width:85px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:124px;">840457</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:85px;">Nacalai</td>
			<td style="width:124px;">28514-75</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Rotary Evapolator</td>
			<td style="width:85px;">Iwaki</td>
			<td style="width:124px;">REN-1000</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Succinic Acid</td>
			<td style="width:85px;">Nacalai</td>
			<td style="width:124px;">32402-05</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Vacuum Pump</td>
			<td style="width:85px;">Buchi</td>
			<td style="width:124px;">V-100</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lipid bilayer experiments with contact bubble bilayers for patch-clampers

Lipide-bilayers bieden een unieke experimenteel platform voor functionele studies van ionenkanalen, waardoor het onderzoek van kanaal-membraan interacties onder verschillende membraan lipide composities. Onder hen, steeds de druppel interface dubbelgelaagde populairder; echter belemmert de grootte groot membraan de opname van lage elektrische achtergrondgeluiden. Wij hebben vastgesteld dat een contact zeepbel dubbelgelaagde (CBB) methode die de voordelen van de vlakke lipide dubbelgelaagde combineert en patch-clamp methoden, zoals de mogelijkheid om te variëren van de samenstelling van lipide en te manipuleren de dubbelgelaagde mechanica, respectievelijk. Het gebruik van de instelling voor conventionele patch-clamp experimenten, kunnen CBB gebaseerde experimenten gemakkelijk uitgevoerd worden. In het kort, een elektrolyt oplossing in een glazen pipet is geblazen in een organische oplosmiddelen fase (hexadecaan), en de druk van de pipet wordt gehandhaafd om het verkrijgen van een stabiele belgrootte. De zeepbel is spontaan bekleed met een enkelgelaagde voor lipide (lipiden zuivere of gemengde lipiden), die wordt geleverd door liposomen in de bubbels. Vervolgens zijn de twee enkelgelaagde omzoomde bubbels (~ 50 µm in diameter) op het puntje van het glas pipetten gedokt voor dubbelgelaagde vorming. Binnenbrengen van de zeepbel van kanaal-gereconstitueerd liposomen leidt tot de integratie van kanalen in de dubbelgelaagde, waardoor de huidige opname eenkanalig met een signaal-ruisverhouding vergelijkbaar met die van de patch-clamp opnames. CBBs met de samenstelling van een asymmetrische lipide worden gemakkelijk gevormd. Het CBB is herhaaldelijk vernieuwd door het uitblazen van de eerdere belletjes en de vorming van nieuwe. Verschillende chemische en fysische verstoringen (b.v., membraan perfusie en dubbelgelaagde spanning) kunnen worden opgelegd aan de Herein CBBs., presenteren we de basisprocedure voor het CBB vorming.

Een typische CBB had een diameter van 50 µm (Figuur 56) en de capaciteit van de specifieke membraan in hexadecaan was 0,65 µF/cm2. De belgrootte werd willekeurig gecontroleerd door de druk van de intra-bubble. Als kleine bellen nodig voor ruisarme opnamen zijn, moet de tip diameter dienovereenkomstig klein. Bijvoorbeeld, voor een belgrootte van 50 µm in diameter moet de tip diameter 30 µm.
<p class="jove_content" fo:keep-to...

Watch this Scientific Journal Video about Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers at JoVE.com

Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers

Hier presenteren we een protocol voor de vorming van lipide-bilayers met behulp van een contact zeepbel dubbelgelaagde methode. Een water-zeepbel is geblazen in een organisch oplosmiddel, waarbij een monolayer wordt gevormd op het grensvlak water / olie. Twee pipetten zijn gemanipuleerd om het dok van de belletjes vormen een dubbelgelaagde.

Lipide dubbelgelaagde experimenten met Contact Bubble Bilayers voor Patch-Clampers

Lipid bilayers provide a unique experimental platform for functional studies of ion channels, allowing the examination of channel-membrane interactions ...

De Contact Bubble Bilayer methode is een alternatieve techniek voor conventionele Lipid Bilayers. en deze methode maakt meer veelzijdige trillingen door het membraan mogelijk. De CBB methode integreert de voordelen van Planar Lipid Bilayer en patch clamp methode.Als lipidebilayertechniek kan een CBB met een willekeurige lipidesamenstelling worden gevormd. We hebben een CBB ontwikkeld voor single channel stroomopnames met een hoge signaal-ruisverhouding. Deze methode maakt variëteiten van membraan trillingen en biedt een enorm type platform aan de kanaalmembraan interface.Iedereen heeft ervaren blazen een zeepbel. De gelijkaardige manoeuvres worden genomen voor de vorming CBB door de toegepaste druk eerder dan het blazen door mond manueel te verfijnen. Oefen en geniet van de CBB.Om deze procedure verspreiden fosfolipiden in chloroform bij een gewenste concentratie in een ronde bodemkolf. Plaats de fosfolipidenoplossing op een roterende verdamper die is aangesloten op een stikstofgascilinder. Draai de kolf onder stikstofstroom bij kamertemperatuur tot er een dunne fosfolipidefilm verschijnt.Plaats vervolgens de open kolf in een desiccator die is aangesloten op een vacuümpomp. Met behulp van de vacuümpomp de binnenkant van de desiccator gedurende enkele uren aanzuigen om de chloroform grondig te verwijderen. Voeg vervolgens een passend volume elektrolytoplossing toe aan de kolf en hang de fosfolipiden op om een twee milligrma per milliliter fosfolipidensuspensie te verkrijgen.Sonciate de schorsing voor 20 tot 30 seconden met behulp van een bad sonicator om een meerlaagse vesicle schorsing te verkrijgen. Voor de bereiding van proteoliposomen die ionenkanaaleiwitten bevatten, voegt u een eiwitoplossing toe aan de meerlaagse vesicle suspensie. En sonicate voor enkele seconden met behulp van het bad sonicator.Om grote boring glazen pipetten voor te bereiden, plaatst u een glazen capillair in een pipettrekker en fabriceert u de micropipet met een fijne taps toelopende punt door middel van twee stappen trekken. Zet vervolgens de micropipet op een microsmederij en neem contact op met de punt van de micropipet op een platina filament op het taps toelopende gedeelte met een diameter van 30 tot 50 micrometer. Verwarm de gloeidraad kort en zet hem onmiddellijk uit.Met behulp van gedestilleerd water en ethanol schoon het oppervlak van het glas glijbaan met een ondiepe put. Breng vervolgens het siliconen reagens aan op de glasplaat en laat het reagens volledig in de lucht drogen. Plaats vervolgens de glazen schuif op het podium van een omgekeerde microscoop.Voeg 100 microliter hexadecane toe in de ondiepe put van de siliconen glazen schuif. Met behulp van een tuberculine spuit vul de elektrolyt oplossing tot de helft van de lengte van de micropipet. Zet vervolgens de micropipet met de drukpoort op de micropipethouder, waardoor de zilver/zilverchloridedraadelektrode in de pipetelelektrolytoplossing kan weken.Sluit een van de micropipette houders aan op het hoofdstadium van een patchklemversterker en de andere met de elektrische grond. Sluit vervolgens een microinjector aan op de drukpoort van de micropipethouder. Pas de micropipet aan op een geschikte positie boven het stadium van een omgekeerde microscoop met behulp van de micromanipulator.Om het elektrodeverschuivingspotentieel aan te passen, plaatst u een microliter van dezelfde elektrolytoplossing die wordt gebruikt om de micropipet op het vlakke oppervlak rond de ondiepe put van de glazen glijbaan te vullen om een elektrolytkoepel te creëren. Week de punt van beide micropipetten in de elektrolytkoepel. Pas daarna het elektrodeverschuivingspotentieel van de patchklemversterker aan.Om de liposoom oplossing van de tip te trekken, voeg een microliter liposoom oplossing op het vlakke oppervlak rond de ondiepe put van het diaglas. Plaats vervolgens het puntje van de micropipet in het liposoom met koepel. Aspirate de liposoom bevattende oplossing met behulp van de microinjector.Herhaal de procedure voor de andere mircopipette voor aspirating kanaal gereconstitueerde liposomen. Plaats nu de micropipet in de hexadecane in de ondiepe put. Blaas een waterbel langzaam door het verhogen van de druk tot de bel bereikt de gewenste grootte en behoud dezelfde druk daarna.Gooi de bel door het passeren van de tip door de olie-air interface als het moeilijk is om de grootte van de zeepbel stabiel te houden. Herhaal de procedures totdat twee stabiele bellen worden gevormd. Stel een contact tussen de twee bubbels.Stem de druk af om de belgrootte te behouden, omdat de grootte zelfs bij de constante intrabeldruk geleidelijk kan veranderen. Stel het membraanpotentieel in op de juiste waarde met behulp van de patchclaimversterker en wacht tot de kanaalstroom naar voren komt. Voor stabiele lipide bilayer vorming is het essentieel om de blotters schoon te maken.Glascapillaire of pipetpreparaat moet grondig worden gewassen en besmetting door de wasmiddelmoleculen voorkomen. Zodra de CBB had gevormd het kanaal moleculen, hetzij in waterige oplossing of in het liposoom werden spontaan ingevoegd in de bilayer binnen de spanwijdte van een paar tot tientallen minuten. Het inbrengen van de kanalen werd bevestigd door de stapsgewijze toename van de huidige amplitude onder het toegepaste membraanpotentieel.Een bilayer gevormd door de CBB-methode kan worden uiteengevallen in twee monolagen. De pTB-kanaalstroom kwam onmiddellijk na het bevestigen van de twee monolagen tevoorschijn. En de stroom werd groter als de zijn van contact verhoogd de amplitude van de stroom werd gesynchroniseerd met de detach hechten manipulatie van de CBB.Als het aantal blow outs van bellen verhoogt de lipide concentratie in de waterige oplossing afneemt en de monolaag niet wordt gevormd. Probeer dan om de druk op liposoom sectie te verlichten. Zodra de CBB formatie en kanaal reconstitutie zijn vastgesteld u proberen om samenstellingen van waterige oplossing en membraan variëren via profusie of het injecteren van een hydrofiele of hydrofobe stoffen.De CBB-methode heeft veelzijdige manieren geopend om kanaalmembraan samenspel te verkennen.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Neuroscience

Unit 1

Channels and the Electrical Properties of Membranes

SCIENTISTS IN ACTION

Functional Mapping with Simultaneous MEG and EEG

Functionele Mapping met gelijktijdige MEG en EEG

We use magnetoencephalography (MEG) and electroencephalography (EEG) to locate and determine the temporal evolution in brain areas involved in the ...

Combining Computer Game-Based Behavioural Experiments With High-Density EEG and Infrared Gaze Tracking

De combinatie van Computer Game-Based Behavioural experimenten met High-Density EEG en infrarood Gaze Tracking

Experimental paradigms are valuable insofar as the timing and other parameters of their stimuli are well specified and controlled, and insofar as they ...

Examining Local Network Processing using Multi-contact Laminar Electrode Recording

Het onderzoeken van Lokaal netwerk met behulp van Multi-Processing contact opnemen Laminar Electrode

Cortical layers are ubiquitous structures throughout neocortex1-4 that consist of highly recurrent local networks. In recent years, significant progress ...

Closed-loop Neuro-robotic Experiments to Test Computational Properties of Neuronal Networks

Closed-loop Neuro-robot Experimenten om Test computationele eigenschappen van neuronale netwerken

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation ...

SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy

SNARE-gemedieerde Fusie van Single proteoliposomen met Tethered Ondersteund dubbellagen in een microfluïdische Flow Cell gecontroleerd door gepolariseerde TIRF Microscopie

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. ...

Fabrication of High Contact-Density, Flat-Interface Nerve Electrodes for Recording and Stimulation Applications

Fabrication van High-Density Contact, Flatscreen-Interface Nerve Elektroden voor het opnemen en Stimulatie Applications

Many attempts have been made to manufacture multi-contact nerve cuff electrodes that are safe, robust and reliable for long term neuroprosthetic ...

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Voorbereiding verse retinale segmenten van volwassen Zebrafish voor Ex Vivo Imaging experimenten

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding ...

Conducting Hyperscanning Experiments with Functional Near-Infrared Spectroscopy

Hyperscanning experimenten met functionele nabij-infrarood spectroscopie

Concurrent brain recordings of two or more interacting persons, an approach termed hyperscanning, are gaining increasing importance for our understanding ...

Using Neuron Spiking Activity to Trigger Closed-Loop Stimuli in Neurophysiological Experiments

Met behulp van neuron spiking activiteit trigger gesloten-lus stimuli in neurofysiologische experimenten

Closed-loop neurophysiological systems use patterns of neuronal activity to trigger stimuli, which in turn affect brain activity. Such closed-loop systems ...

Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments

Generatie oligodendrocyten en oligodendrocyte-geconditioneerde medium voor co-cultuurexperimenten

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials ...