Name: lipid bilayer experiments with contact bubble bilayers for patch-clampers
Uploaded: 2019-01-16T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers at JoVE.com

המחברים רוצה להודות מריקו Yamatake, מסקו הטקשימה לקבלת סיוע טכני. עבודה זו נתמכת באופן חלקי על-ידי KAKENHI גרנט מספרים 16H 00759 ו-17 H 04017 (וכו).

1. מכינים ליפוזומים
<ol><li>לפזר פוספוליפידים (למשל, 10 מ ג אבקת) ב כלורופורם-ריכוז הרצוי (למשל, 10 מ"ג/מ"ל).</li>
	<li>להתנדף כלורופורם.<ol>
<li>המקום הפתרון פוספוליפיד הבקבוק העגול-התחתון, ערכת אותו על המאדה (ראה טבלה של חומרים) מחובר גליל גז2 N. סובב את הבקבוק תחת זרימה2 N בטמ?...

השיטה CBB של היווצרות ליפיד bilayer מבוסס על העיקרון של טיפונת מים בתוך שמן על ידי חד שכבתי20. טכנית, נהלי ויוצרים CBBs קלים, במיוחד עבור תיקון-קלאמפ חוקרים, שאינם בקיאים לתמרן את micropipettes זכוכית. הגדרת אלקטרופיזיולוגיות עבור המלחציים תיקון משמש ברצון CBB כאשר שני סימולטורי פיפטה עם microinj...

עבור יון ערוצי, קרום התא הוא לא פשוט חומר התומך אלא שותף ליצירת יון שטף. מבחינה תפקודית, הקרום מבודד חשמלי ביון אשר מוטבעים ערוצים, כל קרום התא מוקנות עם קרום מנוחתו פוטנציאליים. כמקובל, ממברנה שרירותי פוטנציאל שהוטל מ מעגל חיצוני שבו נמדדה זרם חשמלי דרך הערוצים. זו הערכה כמותית של שטף יון-פוטנציאל ממברנה שונים חשף המאפיינים המולקולריים של ערוצי אלה, כגון יון סלקטיבי הסתננות שלהם פונקציות חסימה1,2. פלטפורמת ממברנה ללימודי פונקציונלי של תעלות יונים היא קרום התא או קרום bilayer השומנים. מבחינה היסטורית, הקלטות הנוכחי חשמל ערוץ אחד בוצעו לראשונה השומנים bilayers3,4, טכניקות הרלוונטיים פותחו עבור קרום התא, כגון שיטת תיקון-קלאמפ (איור 1א' )5,6. מאז, אלה שתי טכניקות התפתחו בנפרד עבור מטרות שונות (איור 1)7,8.
ממברנה ליפידים וממברנות bilayer נכון להיום המוקד של מחקר על השתתפותם ב התומך את המבנה והתפקוד של ערוץ חלבונים. לכן, הזמינות מוכן של שיטות כדי להשתנות הרכב השומנים ב bilayers הוא ביקוש גבוה. השומנים bilayer היווצרות שיטות כגון השומנים מישורי bilayer (PLB)8,9,10,11, מים בתוך שמן droplet bilayer12וכן droplet ממשק bilayer (דיב)13, 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , טכניקות 19 (איור 1) הן אפשרויות נפוצות, מתן הזדמנות לבחינת הפונקציה הערוץ תחת משתנה השומנים יצירות20. אני אמנם טכנית הרבה יותר קל לייצר יותר PLB קונבנציונאלי, גודלו של המילה יצרה תמריץ שלילי עבור תיקון-clampers ליישם אותו ללמוד הקלטות הנוכחי ערוץ אחד עם מוליכות בגודל הרגיל (< 100 pS).
כדי לעקוף את רעשי הרקע, יש למזער את האזור bilayer. בעיה זו מזכיר את מספר החזרות של ההיסטוריה בפיתוח שיטות אלקטרופיזיולוגיות עבור השומנים bilayers (איור 1). בימים הראשונים, הוקמה bilayer בגודל קטן (1-30 מיקרומטר בקוטר), בקצה פיפטה (טיפ-מח ש שיטת; איור 1 C) 21 , 22 , 23, במקום שימוש bilayer שעמד חופשי (~ 100 מיקרומטר בקוטר) מחצה הידרופובי בתוך תא (איור 1B). שיטת טיפ-מח ש המותר עבור מדידות חשמל עם הרבה רעש נמוכה יותר רקע24. החוויות שלנו עם PLB25,26, עצה-מח ש22,23,27, תיקון-קלאמפ28,29,30, שיטות 31 הובילה אותנו רעיון חדש של יצירת bilayers השומנים על ידי שימוש בעקרונות bilayer המים בתוך שמן. לנו יש מכונה זה הבועה קשר bilayer (CBB) שיטת20,32. בשיטה זו, ולא מחזיק טיפות מים שלב שמן (איור 1D), בועת מים הוא מפוצץ מ פיפטה מזכוכית (עם עצה בקוטר של 30 מיקרומטר) לשלב שמן (איור 1E ו- 2), איפה בועה נשמר על-ידי החלת בלחץ קבוע. צורות טפט באופן ספונטני על הממשק מים-שמן על פני השטח של הבועה. לאחר מכן, שתי בועות מעוגנות באמצעות המניפולציה של שני פיפטות זכוכית, bilayer נוצרת גם monolayers שני מתקרבים אחד לשני, מניב שטח bilayer שיווי משקל. גודל הבועה נשלטת על ידי הלחץ אינטרה-הבועה (להחזיק לחץ), ואת גם גודל bilayer. קוטר ממוצע של 50 מיקרומטר משמש לעתים קרובות. למרות הנפח של הבועה הקטן (< 100 pL), זה קשור נפח גדול של הפתרון פיפטה זה בטווח microliter, המהוות שלב אלקטרוליט בצובר.
ישנם יתרונות רבים כדי להשתמש בשיטת CBB (טבלה 1). כמו טכניקה היווצרות ליפיד bilayer, ממברנות של קומפוזיציות שונות שומנים בדם יכול להיות מיוצר, ממברנות אסימטרי בקלות רבה יותר בנוי32 מאשר אלו על ידי שיטת מתקפלים33קונבנציונלי. Bilayer יכול להיות מכנית מניפולציות, בניגוד PLB קונבנציונלי יכול להיות כפוף רק עם34,הפרש הלחץ ההידרוסטטי35. על-ידי שינוי הלחץ החזקה, הבועות או להרחיב או לכווץ, שמוביל מתח הממברנה עלייה או ירידה32. Bilayer מכנית להסרה לתוך monolayers, הדומה ההקפאה-שבר טכניקה36,37 של ממברנות במחקרים מורפולוגי, אבל עם CBB, תרגיל המאפשר חזר על ניתוק וצירוף מחזורים32 . נפח קטן של הפתרון אלקטרוליט בתוך הבועה מאפשר מיזוג יעיל של ליפוזומים מחדש ערוץ לתוך bilayer, ההסתברות להשיג הקלטות הערוץ היא גבוהה הרבה יותר עם טכניקה PLB קונבנציונלי. אמצעי האחסון בועה קטנה גם מאפשר זלוף מהירה (בתוך ~ 20 ms) עוד פעם הזרקה פיפטה הוכנס גם הבועות. שלא כמו שיטת תיקון-קלאמפ, ברגע שבור, קרום CBB נוצר מחדש באופן מיידי, שוב ושוב, מדי סוכר יכול לשמש מספר פעמים ביום. על-ידי שילוב היתרונות של תיקון-קלאמפ והשיטות PLB, CBB מספק פלטפורמה תכליתי לגוון את התנאים physicochemical של הקרום, ומאפשר ללימודי חסרת תקדים של הערוץ-הממברנה אינטראקציות.
לפני הצגת פרוטוקול מפורט של תהליך היווצרות CBB, רקע physicochemical של היווצרות bilayer מוצג הראשון, אשר יהיה שימושי עבור תיקון-clampers לפתור קשיים ניסיוני הנוגע היווצרות קרום כי אתה נתקל.
ניסויים CBB להקנות את לקחי מדע הכימיה משטח38. CBB דומה בועת סבון התפוצץ מקשית לתוך האוויר, איפה באופן דומה, בועת מים הוא התפוצץ לתוך הממס האורגני. אחד לא ישים לב כי בועת מים בקושי מנופח ממברנה שומנים לא נכללת גם את בועת מים או הממס האורגני בהיעדרו של amphipathic שומנים, המתח-ממשק מים-שמן גבוה, הלחץ אינטרה-בועת עבור פיצוץ בועה יהיה גבוה. זהו מימוש משוואת לפלס (ΔP = 2 וγ/R, כאשר ΔP הוא הלחץ אינטרה-הבועה, γ הוא מתח הפנים ו- R הוא רדיוס בועה). כאשר ריכוז ליפידים השלב אורגני או הפתרון אלקטרוליט הוא גבוה, הצפיפות של ליפידים ב טפט עולה, כפי שמכתיבה את איזותרמה ספיחה גיבס (-dγ = Γאני dµאני, איפה Γאני עודף משטח של המתחם, ממוצעאני הוא הפוטנציאל הכימי של רכיב אני)39, המוביל מתח נמוך והקלות של היווצרות בועה. ב CBB, יכול להיות שנצפו על bilayer מזווית וצורניים (איור 2), זווית מגע בין חד שכבתי bilayer הוא מדיד. זווית זו מייצגת איזון בין את surface tensions של טפט bilayer (משוואת צעירים: γbi = γמו cos(θ), איפה γbi הוא המתח bilayer, γמו הוא המתח טפט ו θ באמצעות הוא הזווית קשר). שינויי הזווית קשר מצביעים על שינויים במתח bilayer, בהתחשב בכך המתח טפט יוערך משינויים ב זווית הקשר כפונקציה של קרום פוטנציאליים (משוואת יאנג-ליפמן: γמו = Cm V2 /4 (cos (θ באמצעות0) - cos (θ באמצעותv)), כאשר Cm הוא קיבול הממברנה, V הוא קרום פוטנציאליים ו θ באמצעות0 וθ באמצעותv הן הזוויות-0 ו- V mV, בהתאמה)40,41 ,42. כאשר שתי בועות קרוב מספיק, הם מתקרבים אחד לשני באופן ספונטני. זאת בשל הכוח Waals ואן דר, ניתן להבחין ויזואלית תהליך דינמי זה במבנה CBB.
מערכת CBB מורכב שלבים ברורים: כלומר, שלב שמן בתפזורת, מים בועות מצופה טפט ולאחר bilayer קשר איתם (איור 3). אלה מזכירים שלבי מרובים שנצפתה PLB, כמו הטורוס המכילות הממס מסביב השלב bilayer וגם שלב אורגניים דקים דחוקה על ידי שני monolayers43,44. ב CBB, לשלב טפט היא רציפה עם העלעל bilayer, מולקולות ליפיד בקלות לפזר בין את טפט העלעל. שלב חד שכבתי מכסה את רוב פני השטח בועה, המהוות את שלב עיקרי זה משמש מאגר השומנים. כי הזנב הידרופוביות של ליפידים של טפט מרחיב כלפי חוץ כדי לשלב שמן בתפזורת, הפנים bilayer או הליבה הידרופובי פותח לשלב שמן בכמות גדולה. לפיכך, חומר הידרופובי מוזרק לשלב שמן קרוב bilayer הוא מסוגל לגשת בקלות הפנים bilayer. זוהי הטכניקה זלוף ממברנה שפיתחנו לאחרונה45, לפיו הרכב השומנים ב- bilayer משתנה במהירות (תוך שנייה) במהלך הקלטות הנוכחי ערוץ אחד. מצאנו כי תכולת כולסטרול bilayer יכול להיות הפיכה נשלט על ידי מיתוג את זלוף כולסטרול45לסירוגין. בכל מקרה שבו הריכוז של החומר הרלוונטי טפט, bilayer שונה, מעבר הצבע ריכוז של חומר רלוונטי מפורקת באופן מיידי באמצעות דיפוזיה, הידוע בשם אפקט ס שלושה קמפוסים:46, 47. מצד שני, כפכפים מעבר monolayers הן איטיות48,49,50.
שימוש בשיטת CBB, bilayer נוצר בתנאים physicochemical מגוונים, כגון pH אלקטרוליט המתחילים 1 51, ריכוז מלח (K+, Na+, וכו '.) עד 3 מ', פוטנציאל הממברנה גבוהה כמו ±400 mV, ומערכת טמפרטורה של עד 60 מעלות צלזיוס.
ישנן מספר אפשרויות עבור היווצרות CBB ההתאגדות של מולקולות ערוץ בו. על היווצרות טפט על הממשק מים-שמן, שומנים מתווספות או הממס האורגני (שיטת השומנים-out; איור 4 א, ג 4) או בתוך בועה כמו ליפוזומים (שומנים בדם-אין שיטה; איור 4 B, 4 D). ראוי לציין, השיטה השומנים-in מאפשר היווצרות של ממברנות אסימטרי15,32. ערוץ מולקולות מסיסים בתמיסה המימית (למשל, פפטידים להיוות ערוץ) מתווספים ישירות לתוך52,בועה (איור 4A, B)53, ואילו ערוץ חלבונים הם מחדש לתוך ליפוזומים, אשר יתווספו לאחר מכן לתוך הבועה (איור 4C, D). במסמך זה, היווצרות של CBBs על ידי שיטת השומנים-in עבור גם ערוץ פפטיד (polytheonamide B (pTB); איור 4 A) או חלבון (ערוץ אשלגן KcsA, איור 4C) מוצג.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:607px;" width="605">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">Azolectin (L-&#945;-Phosphatidylcholine, Type IV-S)</td>
			<td style="width:85px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">P3644</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:219px;">A/D Converter</td>
			<td style="width:85px;">Molecular Divices</td>
			<td style="width:124px;">Digidata1550A</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">Ag/AgCl electrode</td>
			<td style="width:85px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:124px;">64-1317</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Bath Sonicator</td>
			<td style="width:85px;">Branson</td>
			<td style="width:124px;">M1800H-J</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">Camera</td>
			<td style="width:85px;">Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:124px;">C11440-10C</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:219px;">Glass Capillary</td>
			<td style="width:85px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:124px;">30-0062</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Hepes</td>
			<td style="width:85px;">Dojindo</td>
			<td style="width:124px;">342-01375</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:219px;">Hole Slideglass</td>
			<td style="width:85px;">Matsunami Glass</td>
			<td style="width:124px;">S339929</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Inverted Microscope</td>
			<td style="width:85px;">Olympus</td>
			<td style="width:124px;">IX73</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Isolation Table</td>
			<td style="width:85px;">Herz</td>
			<td style="width:124px;">TDI-86LA(Y)2</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Micro Injenctor</td>
			<td style="width:85px;">Narishige</td>
			<td style="width:124px;">IM-11-2</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Micro Manipulator</td>
			<td style="width:85px;">Narishige</td>
			<td style="width:124px;">EMM</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Microforge</td>
			<td style="width:85px;">Narishige</td>
			<td style="width:124px;">MF-830</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Micropipette holder</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">n-Hexadecane</td>
			<td style="width:85px;">Nacalai</td>
			<td style="width:124px;">07819-32</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Patch-Clamp Amplifier</td>
			<td style="width:85px;">HEKA</td>
			<td style="width:124px;">EPC800</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">Pipette Puller</td>
			<td style="width:85px;">Sutter Instrument Co.</td>
			<td style="width:124px;">P-87</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine)</td>
			<td style="width:85px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:124px;">850457</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:219px;">POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine 
			)</td>
			<td style="width:85px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:124px;">850757</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">POPG (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) )</td>
			<td style="width:85px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:124px;">840457</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:85px;">Nacalai</td>
			<td style="width:124px;">28514-75</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Rotary Evapolator</td>
			<td style="width:85px;">Iwaki</td>
			<td style="width:124px;">REN-1000</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Succinic Acid</td>
			<td style="width:85px;">Nacalai</td>
			<td style="width:124px;">32402-05</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Vacuum Pump</td>
			<td style="width:85px;">Buchi</td>
			<td style="width:124px;">V-100</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lipid bilayer experiments with contact bubble bilayers for patch-clampers

השומנים bilayers מספקים פלטפורמה ניסיוני ייחודי ללימודי פונקציונלי של תעלות יונים, המאפשר הבחינה של הערוץ-הממברנה אינטראקציות תחת קרום שונים יצירות השומנים. ביניהם, bilayer ממשק ' droplet ' צברה פופולריות; עם זאת, גודל ממברנה גדולות מעכבת את ההקלטה של רעש רקע חשמל נמוכה. הקמנו בועה קשר bilayer (CBB) בשיטה המשלבת את היתרונות של מישורי ליפידית ושיטות תיקון-קלאמפ, כגון היכולת להשתנות הרכב השומנים, לתמרן את המכניקה bilayer, בהתאמה. באמצעות הגדרת לניסויים תיקון קונבנציונלי-קלאמפ, מבוסס CBB ניסויים ניתן בקלות לבצע. בקצרה, פתרון אלקטרוליט ב פיפטה מזכוכית הוא התפוצץ לתוך שלב בממיסים אורגניים (hexadecane), הלחץ פיפטה נשמר להשיג מידה קצף יציב. הבועה רצוף באופן ספונטני שומנים חד שכבתי (ליפידים טהור או שומנים מעורבים), אשר מסופק מן ליפוזומים הבועות. בשלב הבא, שני מצופה טפט בועות (~ 50 מיקרומטר בקוטר), בקצה פיפטות זכוכית מעוגנות bilayer בשורה. הקדמה של ליפוזומים מחדש ערוץ לתוך הבועה מוביל שילוב של ערוצים bilayer, המאפשר הקלטה הנוכחי ערוץ אחד עם יחס אות לרעש לזו של תיקון-קלאמפ הקלטות. CBBs להרכב השומנים אסימטרי נוצרות בקלות. CBB מתחדש שוב ושוב על ידי לפוצץ את הבועות הקודם ויוצרים חדשים. לפליטת כימיים שונים (למשל, ממברנה זלוף, bilayer המתח) ניתן לגזור על CBBs. שעל זה, אנו מציגים את ההליך הבסיסי לשימוש CBB היווצרות.

CBB טיפוסי היה בקוטר של 50 מיקרומטר (איור 56) והיה קיבול הממברנה ספציפי ב hexadecane µF 0.65/cm2. גודל הבועה נשלטה באופן שרירותי על ידי לחץ אינטרה-הבועה. כאשר בועות קטנות נחוצים להקלטות רעש נמוכה, הקוטר טיפ צריך להיות correspondingly קטן. לדוגמה, עבור גודל בועה ש?...

Watch this Scientific Journal Video about Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers at JoVE.com

Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers

כאן, אנו מציגים עבור היווצרות ליפיד bilayers באמצעות שיטת bilayer בועה קשר פרוטוקול. בועת מים הוא התפוצץ לתוך הממס האורגני, לפיה טפט נוצר ב הממשק מים-שמן. פיפטות שני יפגעו כדי לעגן את הבועות כדי ליצור bilayer.

השומנים Bilayer ניסויים עם בועה קשר Bilayers עבור תיקון-Clampers

Lipid bilayers provide a unique experimental platform for functional studies of ion channels, allowing the examination of channel-membrane interactions ...

שיטת בוליאר בועת מגע היא טכניקה חלופית עבור Bilayers השומנים קונבנציונאלי. ושיטה זו מאפשרת רטט רב-תכליתי יותר דרך הממברנה. שיטת CBB משלבת את היתרונות של Bilayer ליפיד פלנאר שיטת מלחציים תיקון.כמו טכניקה bilayer השומנים CBB עם הרכב שומנים שרירותי יכול להיווצר. פיתחנו CBB להקלטות זרם ערוץ יחיד עם יחס אות גבוה לרעש. שיטה זו מאפשרת זנים של תנודות קרום ומציעה פלטפורמה מסוג עצום לממשק קרום הערוץ.כולם חוו פיצוץ בועת סבון. תמרונים דומים נלקחים להיווצרות CBB על ידי כוונון ידני עדין של הלחץ המוחל במקום לנשוף בפה. להתאמן וליהנות CBB.כדי להיות הליך זה לפזר פוספוליפידים בכלורופורם בריכוז הרצוי בבקבוקון תחתון עגול. מניחים את הפתרון פוספוליפיד על אידוי סיבובי מחובר צילינדר גז חנקן. סובב את הבקבוק תחת זרימת חנקן בטמפרטורת החדר עד שיופיע סרט פוספוליפיד דק.לאחר מכן מניחים את הבקבוק הפתוח לתוך י desiccator המחובר למשאבת ואקום. באמצעות משאבת ואקום שאפו את החלק הפנימי של היודש במשך כמה שעות כדי להסיר את הכלורופורם ביסודיות. לאחר מכן להוסיף נפח מתאים של פתרון אלקטרוליטים לבקבוק ולהשעות את פוספוליפיד כדי לקבל שתי מיליגרמות לכל השעיה פוספוליפיד מיליליטר.Sonciate ההשעיה במשך 20 עד 30 שניות באמצעות sonicator אמבטיה כדי לקבל השעיה קשה רב שכבתית. להכנת פרוטאוליפוזמים המכילים חלבונים ערוץ יון, מוסיפים פתרון חלבון המתלה קשה רב שכבתי. ו sonicate במשך כמה שניות באמצעות sonicator האמבטיה.כדי להכין פיפטים זכוכית גדולים נשא, מניחים נימי זכוכית במשוך פיפטה ולהמציא את micropipette עם קצה מחודד עדין דרך שני צעדים מושך. לאחר מכן להגדיר את micropipette על מיקרו לזייף ו ליצור קשר עם קצה micropipette כדי חוט פלטינה בחלק מחודד בקוטר של 30 עד 50 מיקרומטר. מחממים את הכלים לזמן קצר ומיד מכבים אותו.באמצעות מים מזוקקים ואתנול לנקות את פני השטח של מגלשת הזכוכית עם באר רדודה. לאחר מכן להחיל את reagent סיליקון על מגלשת הזכוכית ולתת את reagent להתייבש לחלוטין באוויר. לאחר מכן מניחים את מגלשת הזכוכית על הבמה של מיקרוסקופ הפוך.הוסף 100 מיקרוליטרים של הקסדקני לתוך הקן הרדוד של מגלשת הזכוכית הסיליקון. באמצעות מזרק שחפת למלא את פתרון האלקטרוליטים עד מחצית האורך של micropipette. לאחר מכן להגדיר את micropipette על מחזיק micropipette עם יציאת הלחץ, המאפשר אלקטרודה חוט כלוריד כסף / כסף כדי להשרות את פתרון אלקטרוליט פיפטה.חבר את אחד המחזיקים micropipette לשלב הראש של מגבר מהדק תיקון והשני לקרקע החשמלית. לאחר מכן לחבר microinjector ליציאת הלחץ של מחזיק micropipette. התאימו את המיקרופיגט למיקום מתאים מעל השלב של מיקרוסקופ הפוך באמצעות המיקרומניפולטור.כדי להתאים את פוטנציאל היסט האלקטרודה, מקם מיקרוליטר אחד של אותו פתרון אלקטרוליטים המשמש למילוי המיקרופיט על פני השטח השטוחים סביב באר רדודה של מגלשת הזכוכית כדי ליצור כיפת אלקטרוליטים. משרים את קצה שני המיקרופיטים בכיפת האלקטרוליטים. לאחר מכן להתאים את פוטנציאל היסט האלקטרודה של מגבר מהדק התיקון.כדי לצייר את פתרון ליפוזום מהטיפ, להוסיף מיקרוליטר אחד של פתרון ליפוזום על פני השטח השטוחים סביב באר רדודה של זכוכית השקופית. במקום הבא קצה המיקרופיפט בליפוזום המכיל כיפה. שאפו את פתרון ליפוזום המכיל באמצעות microinjector.חזור על ההליך עבור mircopipette האחר עבור שאפתן ערוץ מחדש ליפוזומים. עכשיו למקם את micropipette בהקסאדקנה באר רדודה. לפוצץ בועת מים לאט על ידי הגדלת הלחץ עד הבועה מגיעה לגודל הרצוי ולשמור על אותו לחץ לאחר מכן.השלך את הבועה על ידי העברת הקצה דרך ממשק שמן האוויר אם קשה לשמור על גודל הבועה יציב. חזור על ההליכים עד שתי בועות יציבות נוצרות. צור קשר בין שתי הבועות.כוונן את הלחץ כדי לשמור על גודל הבועה, כי הגודל עשוי להשתנות בהדרגה אפילו בלחץ הבועה האינטר-בועה הקבוע. הגדר את פוטנציאל הממברנה לערך המתאים באמצעות מגבר טענת התיקון והמתן עד שזרם הערוץ יתגלה. עבור היווצרות bilayer השומנים יציב זה חיוני כדי לנקות את blotters.הכנת נימי זכוכית או פיפטה יש לשטוף ביסודיות ולהימנע זיהום על ידי מולקולות דטרגנט. לאחר CBB יצרו את מולקולות התעלה או בתסיפה מיקווית או בליפוזום הוכנסו באופן ספונטני לתוך bilayer בטווח של כמה עד עשרות דקות. הכנסת הערוצים אושרה על ידי עלייה צעד חכם של משרעת הנוכחית תחת פוטנציאל הממברנה להחיל.Bilayer שנוצר על ידי שיטת CBB ניתן לפורר לשני monolayers. זרם ערוץ pTB הופיע מיד לאחר חיבור שני monolayers. והזרם גדל ככל שמגע הגדיל את משרעת הזרם סונכרן עם המניפולציה של ה-CBB.אם מספר blow outs של בועות מגביר את ריכוז השומנים בתספור הממיקי פוחתת ואת monolayer לא נוצר. ואז לנסות להקל על הלחץ על סעיף ליפוזום. לאחר היווצרות CBB ו reconstitution ערוץ הוקמו אתה יכול לנסות לשנות קומפוזיציות של פתרון מים קרום באמצעות שפע או הזרקת חומרים הידרופיליים או הידרופוביים.שיטת CBB פתחה דרכים רב-תכליתיות לחקור את יחסי הגומלין בין הממברנות בערוץ.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Neuroscience

Unit 1

Channels and the Electrical Properties of Membranes

SCIENTISTS IN ACTION

Functional Mapping with Simultaneous MEG and EEG

מיפוי פונקציונלית עם מג סימולטני EEG

We use magnetoencephalography (MEG) and electroencephalography (EEG) to locate and determine the temporal evolution in brain areas involved in the ...

Combining Computer Game-Based Behavioural Experiments With High-Density EEG and Infrared Gaze Tracking

משחק מחשב המבוסס על שילוב של ניסויים ההתנהגות עם מעקב צפיפות גבוהה מבט EEG ו אינפרא אדום

Experimental paradigms are valuable insofar as the timing and other parameters of their stimuli are well specified and controlled, and insofar as they ...

Examining Local Network Processing using Multi-contact Laminar Electrode Recording

בחינת עיבוד הרשת המקומית באמצעות מגע Multi-אלקטרודה למינרית הקלטה

Cortical layers are ubiquitous structures throughout neocortex1-4 that consist of highly recurrent local networks. In recent years, significant progress ...

Closed-loop Neuro-robotic Experiments to Test Computational Properties of Neuronal Networks

ניסויי נוירו-רובוטית לולאה סגורה כדי לבדוק את מאפיינים חישובית של רשתות עצבי

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation ...

SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy

מלכודת בתיווך Fusion של יחיד Proteoliposomes עם Bilayers Tethered הנתמך בתוך תא זרימת Microfluidic מנוטר על ידי Polarized TIRF מיקרוסקופי

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. ...

Fabrication of High Contact-Density, Flat-Interface Nerve Electrodes for Recording and Stimulation Applications

המצאה של צפיפות לתקשר גבוהה, אלקטרודות עצב שטוח ממשק עבור יישומי הקלטת הגירוי

Many attempts have been made to manufacture multi-contact nerve cuff electrodes that are safe, robust and reliable for long term neuroprosthetic ...

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

הכנת פרוסות דג זברה למבוגרים עבור לשעבר Vivo הדמיה ניסויים ברשתית טריים

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding ...

Conducting Hyperscanning Experiments with Functional Near-Infrared Spectroscopy

ניסויים Hyperscanning עם ספקטרוסקופיית אינפרא אדום הפונקציונליים

Concurrent brain recordings of two or more interacting persons, an approach termed hyperscanning, are gaining increasing importance for our understanding ...

Using Neuron Spiking Activity to Trigger Closed-Loop Stimuli in Neurophysiological Experiments

שימוש בניותא פעילות העולה להדק לולאה סגורה גירויים בניסויים נוירולוגיים

Closed-loop neurophysiological systems use patterns of neuronal activity to trigger stimuli, which in turn affect brain activity. Such closed-loop systems ...

Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments

דור מoligodendrocytes הפוך ומדיום ממוזג לניסויים בשיתוף תרבות-שיתוף

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials ...