Name: lipid bilayer experiments with contact bubble bilayers for patch-clampers
Uploaded: 2019-01-16T13:45:00
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लेखक तकनीकी सहायता के लिए मारिको Yamatake और मासको Takashima का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । यह काम KAKENHI अनुदान संख्या 16H00759 और 17H04017 (सू) द्वारा भाग में समर्थित किया गया था ।

1. तैयार Liposomes
<ol><li>फॉस्फोलिपिड फैलाने (जैसे, पाउडर में 10 मिलीग्राम) एक वांछित एकाग्रता पर क्लोरोफॉर्म में (जैसे, 10 मिलीग्राम/एमएल) ।</li>
	<li>लुप्त क्लोरोफॉर्म.<ol>
<li>एक गोल-नीचे कुप्पी में फॉस्फोलिपिड समाधा...

लिपिड bilayer गठन के CBB विधि एक monolayer20द्वारा लाइन में खड़ा पानी में तेल की छोटी बूंद के सिद्धांत पर आधारित है । तकनीकी तौर पर, CBBs बनाने के लिए प्रक्रिया आसान कर रहे हैं, विशेष रूप से पैच के लिए, शोधकर्ताओं,...

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:607px;" width="605">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">Azolectin (L-&#945;-Phosphatidylcholine, Type IV-S)</td>
			<td style="width:85px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">P3644</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:219px;">A/D Converter</td>
			<td style="width:85px;">Molecular Divices</td>
			<td style="width:124px;">Digidata1550A</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">Ag/AgCl electrode</td>
			<td style="width:85px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:124px;">64-1317</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Bath Sonicator</td>
			<td style="width:85px;">Branson</td>
			<td style="width:124px;">M1800H-J</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">Camera</td>
			<td style="width:85px;">Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:124px;">C11440-10C</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:219px;">Glass Capillary</td>
			<td style="width:85px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:124px;">30-0062</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Hepes</td>
			<td style="width:85px;">Dojindo</td>
			<td style="width:124px;">342-01375</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:219px;">Hole Slideglass</td>
			<td style="width:85px;">Matsunami Glass</td>
			<td style="width:124px;">S339929</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Inverted Microscope</td>
			<td style="width:85px;">Olympus</td>
			<td style="width:124px;">IX73</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Isolation Table</td>
			<td style="width:85px;">Herz</td>
			<td style="width:124px;">TDI-86LA(Y)2</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Micro Injenctor</td>
			<td style="width:85px;">Narishige</td>
			<td style="width:124px;">IM-11-2</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Micro Manipulator</td>
			<td style="width:85px;">Narishige</td>
			<td style="width:124px;">EMM</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Microforge</td>
			<td style="width:85px;">Narishige</td>
			<td style="width:124px;">MF-830</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Micropipette holder</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">n-Hexadecane</td>
			<td style="width:85px;">Nacalai</td>
			<td style="width:124px;">07819-32</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Patch-Clamp Amplifier</td>
			<td style="width:85px;">HEKA</td>
			<td style="width:124px;">EPC800</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">Pipette Puller</td>
			<td style="width:85px;">Sutter Instrument Co.</td>
			<td style="width:124px;">P-87</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine)</td>
			<td style="width:85px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:124px;">850457</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:219px;">POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine 
			)</td>
			<td style="width:85px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:124px;">850757</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">POPG (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) )</td>
			<td style="width:85px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:124px;">840457</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:85px;">Nacalai</td>
			<td style="width:124px;">28514-75</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Rotary Evapolator</td>
			<td style="width:85px;">Iwaki</td>
			<td style="width:124px;">REN-1000</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Succinic Acid</td>
			<td style="width:85px;">Nacalai</td>
			<td style="width:124px;">32402-05</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Vacuum Pump</td>
			<td style="width:85px;">Buchi</td>
			<td style="width:124px;">V-100</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lipid bilayer experiments with contact bubble bilayers for patch-clampers

लिपिड bilayers आयन चैनलों के कार्यात्मक अध्ययन के लिए एक अनूठा प्रयोगात्मक मंच प्रदान करते हैं, विभिन्न झिल्ली लिपिड रचनाओं के तहत चैनल झिल्ली बातचीत की परीक्षा की अनुमति । उनमें से, छोटी बूंद इंटरफ़ेस bilayer लोकप्रियता प्राप्त की है; हालांकि, बड़ी झिल्ली आकार कम विद्युत पृष्ठभूमि शोर की रिकॉर्डिंग में बाधा । हम एक संपर्क बुलबुला bilayer (CBB) विधि है कि planar लिपिड bilayer और पैच के लाभों को जोड़ती है की स्थापना की है, जैसे लिपिड संरचना को अलग करने की क्षमता और bilayer यांत्रिकी में हेरफेर करने के लिए-क्लैंप तरीकों, क्रमशः । पारंपरिक पैच-दबाना प्रयोगों के लिए सेटअप का उपयोग करना, CBB-आधारित प्रयोगों आसानी से किया जा सकता है. संक्षेप में, एक गिलास पिपेट में एक इलेक्ट्रोलाइट समाधान एक कार्बनिक विलायक चरण (hexadecane) में उड़ा दिया है, और पिपेट दबाव एक स्थिर बुलबुला आकार प्राप्त करने के लिए बनाए रखा है । बुलबुला अनायास एक लिपिड monolayer (शुद्ध लिपिड या मिश्रित लिपिड) है, जो liposomes से बुलबुले में प्रदान की जाती है के साथ लाइन में खड़ा है । अगले, दो monolayer के बुलबुले (~ ५० व्यास में µm) ग्लास पिपेट की नोक पर bilayer गठन के लिए डॉक कर रहे हैं । चैनल का परिचय-liposomes बुलबुला में चैनल का गठन bilayer में चैनलों के शामिल करने की ओर जाता है, एकल के लिए अनुमति देता है-शोर अनुपात पैच-दबाना रिकॉर्डिंग के लिए तुलनीय के साथ एक चैनल वर्तमान रिकॉर्डिंग के लिए । एक असममित लिपिड संरचना के साथ CBBs आसानी से गठित कर रहे हैं. CBB बार बाहर पिछले बुलबुले उड़ाने और नए बनाने के द्वारा नवीनीकृत है । विभिन्न रासायनिक और शारीरिक perturbations (जैसे, झिल्ली छिड़काव और bilayer तनाव) CBBs पर लगाया जा सकता है । इस के साथ साथ, हम CBB गठन के लिए बुनियादी प्रक्रिया प्रस्तुत करते हैं ।

एक ठेठ CBB ५० µm (चित्रा 5, 6) और hexadecane में विशिष्ट झिल्ली समाई के एक व्यास था ०.६५ µF/ बुलबुला का आकार अंतर बुलबुला दबाव द्वारा मनमाने ढंग से नियंत्रित किया गया था । जब छोटे बुलबु...

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Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers

यहां, हम एक संपर्क बुलबुला bilayer विधि का उपयोग लिपिड bilayers के गठन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । एक पानी का बुलबुला एक कार्बनिक विलायक, जिससे एक monolayer पानी के तेल अंतरफलक पर गठन किया है में उड़ा दिया है । दो पिपेट बुलबुले गोदी करने के लिए एक bilayer फार्म में हेरफेर कर रहे हैं ।

लिपिड Bilayer प्रयोगों के साथ संपर्क बुलबुला Bilayers के लिए पैच-clampers

Lipid bilayers provide a unique experimental platform for functional studies of ion channels, allowing the examination of channel-membrane interactions ...

संपर्क बबल बिलेयर विधि पारंपरिक लिपिड बिलेयर के लिए एक वैकल्पिक तकनीक है। और यह विधि झिल्ली के माध्यम से अधिक बहुमुखी कंपन की अनुमति देती है। सीबीबी विधि प्लानर लिपिड बिलेयर और पैच क्लैंप विधि के लाभों को एकीकृत करती है।लिपिड बाइलेयर तकनीक के रूप में एक मनमाने ढंग से लिपिड संरचना के साथ सीबीबी का गठन किया जा सकता है। हमने शोर अनुपात के लिए उच्च संकेत के साथ एकल चैनल वर्तमान रिकॉर्डिंग के लिए एक सीबीबी विकसित किया है। यह विधि झिल्ली कंपन की किस्मों की अनुमति देती है और चैनल झिल्ली इंटरफेस के लिए एक विशाल प्रकार का मंच प्रदान करती है।हर कोई एक साबुन बुलबुला उड़ाने का अनुभव किया है । इसी तरह के युद्धाभ्यास को मुंह से उड़ाने के बजाय लागू दबाव को मैन्युअल रूप से ठीक-ट्यूनिंग करके सीबीबी गठन के लिए लिया जाता है। अभ्यास और सीबीबी का आनंद लें।इस प्रक्रिया को एक गोल नीचे फ्लास्क में वांछित एकाग्रता पर क्लोरोफॉर्म में फॉस्फोलिपिड्स को तितर-बितर करने के लिए। एक नाइट्रोजन गैस सिलेंडर से जुड़े रोटरी वाष्पीकरण पर फॉस्फोलिपिड समाधान रखें। एक पतली फॉस्फोलिपिड फिल्म दिखाई देता है जब तक कमरे के तापमान पर नाइट्रोजन प्रवाह के तहत फ्लास्क घुमाएं।इसके बाद खुले फ्लास्क को एक डेसीकेटर में रखें जो वैक्यूम पंप से जुड़ा हुआ है। वैक्यूम पंप का उपयोग करने से क्लोरोफॉर्म को अच्छी तरह से हटाने के लिए कई घंटों तक डेसिकेटर के अंदर की वृद्धि होती है। बाद में फ्लास्क में इलेक्ट्रोलाइट समाधान की उचित मात्रा जोड़ें और पिमिलिटर फॉस्फोलिपिड निलंबन के अनुसार दो मिलीग्रमास प्राप्त करने के लिए फॉस्फोलिपिड को निलंबित करें।बहुस्तरीय वेसिकल निलंबन प्राप्त करने के लिए बाथ सोनिकेटर का उपयोग करके 20 से 30 सेकंड के लिए निलंबन को सोनसिएट करें। आयन चैनल प्रोटीन वाले प्रोटियोलिपोसोम की तैयारी के लिए, बहुस्तरीय वेसिकल निलंबन में प्रोटीन समाधान जोड़ें। और स्नान सोनिकेटर का उपयोग करके कई सेकंड के लिए सोनिकेट करें।बड़े बोर ग्लास पिपेट तैयार करने के लिए, एक पिपेट पुलर में एक ग्लास केशिका रखें और दो स्टेप पुलिंग के माध्यम से एक ठीक पतला टिप के साथ माइक्रोपिपेट तैयार करें। फिर माइक्रोपिपेट को एक माइक्रो फोर्ज पर सेट करें और माइक्रोपिपेट की नोक को 30 से 50 माइक्रोमीटर के व्यास वाले पतला हिस्से पर प्लेटिनम फिलामेंट से संपर्क करें। फिलामेंट को संक्षेप में गर्म करें और तुरंत इसे बंद कर दें।आसुत पानी और इथेनॉल का उपयोग करके कांच की स्लाइड की सतह को उथले कुएं से साफ करें। इसके बाद ग्लास स्लाइड पर सिलिकॉनाइजिंग रिएजेंट लगाएं और रिएजेंट को पूरी तरह से हवा में सूखने दें। इसके बाद कांच की स्लाइड को उल्टे माइक्रोस्कोप के स्टेज पर रखें।सिलिकॉन ग्लास स्लाइड के उथले कुएं में हेक्साडेकेन के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। ट्यूबरक्यूलिन सिरिंज का उपयोग करके इलेक्ट्रोलाइट समाधान को माइक्रोपिपेट की आधी लंबाई तक भरें। इसके बाद माइक्रोपिपेट को प्रेशर पोर्ट के साथ माइक्रोपिपेट होल्डर पर सेट करें, जिससे सिल्वर/सिल्वर क्लोराइड वायर इलेक्ट्रोड को पिपेट इलेक्ट्रोलाइट सॉल्यूशन में भिगोने की इजाजत दी जा सके ।माइक्रोपिपेट धारकों में से एक को पैच क्लैम्प एम्पलीफायर के सिर चरण में और दूसरे को विद्युत भूमि से जोड़ें। बाद में माइक्रोपिपेट धारक के दबाव बंदरगाह के लिए एक माइक्रोइंजेक्टर कनेक्ट करें। माइक्रोमैनीपुलेटर का उपयोग करके एक उल्टे माइक्रोस्कोप के चरण के ऊपर एक उपयुक्त स्थिति में माइक्रोपिपेट को समायोजित करें।इलेक्ट्रोड ऑफसेट क्षमता को समायोजित करने के लिए, एक इलेक्ट्रोलाइट समाधान का एक माइक्रोलीटर रखें जो इलेक्ट्रोलाइट गुंबद बनाने के लिए ग्लास स्लाइड के उथले कुएं के चारों ओर सपाट सतह पर माइक्रोपिपेट को भरने के लिए उपयोग किया जाता है। इलेक्ट्रोलाइट गुंबद में दोनों माइक्रोपिपेट्स की नोक को सोख लें। इसके बाद पैच क्लैम्प एम्पलीफायर की इलेक्ट्रोड ऑफसेट क्षमता को समायोजित करें।टिप से लिपोसोम समाधान आकर्षित करने के लिए, स्लाइड ग्लास के उथले कुएं के चारों ओर सपाट सतह पर लिपोसोम समाधान का एक माइक्रोलीटर जोड़ें। इसके बाद माइक्रोपिपेट की नोक को गुंबद युक्त लिपोसोम में रखें। माइक्रोइंजेक्टर का उपयोग करके हल युक्त लिपोसोम को एस्पिरेट करें।एस्पिरेटिंग चैनल के लिए अन्य मिर्कोपिपेट के लिए प्रक्रिया दोहराएं। अब षट् तेदेकेन में माइक्रोपिपेट के छिछोरा कुआं में रखें। जब तक बुलबुला वांछित आकार तक नहीं पहुंचता है और उसके बाद एक ही दबाव बनाए रखने के लिए दबाव को बढ़ाकर धीरे-धीरे एक पानी के बुलबुले को उड़ा दें।यदि बुलबुले के आकार को स्थिर रखना कठिन है तो तेल-वायु इंटरफ़ेस के माध्यम से टिप को पारित करके बुलबुले को छोड़ दें। प्रक्रियाओं को तब तक दोहराएं जब तक कि दो स्थिर बुलबुले न बन जाएं। दो बुलबुले के बीच एक संपर्क स्थापित करें।बुलबुले के आकार को बनाए रखने के लिए दबाव को ठीक करें, क्योंकि आकार लगातार इंट्रा-बबल दबाव पर भी धीरे-धीरे बदल सकता है। पैच क्लेम एम्पलीफायर का उपयोग करके उचित मूल्य के लिए झिल्ली क्षमता निर्धारित करें और चैनल वर्तमान के उभरने की प्रतीक्षा करें। स्थिर लिपिड बाइलेयर गठन के लिए ब्लॉटर्स को साफ करना आवश्यक है।ग्लास केशिका या पिपेट तैयारी को अच्छी तरह से धोया जाना चाहिए और डिटर्जेंट अणुओं द्वारा प्रदूषण से बचना चाहिए। एक बार सीबीबी ने चैनल के अणुओं को या तो जलीय समाधान में या लिपोसोम में अनायास ही कुछ से दर्जनों मिनटों के अंतराल के भीतर बाइलेयर में डाला गया था । चैनलों के सम्मिलनों की पुष्टि लागू झिल्ली क्षमता के तहत वर्तमान आयाम की कदमवार वृद्धि से की गई थी।सीबीबी विधि द्वारा गठित एक बाइलेयर को दो मोनोलेयर में विघटित किया जा सकता है। दो मोनोलेयर्स को अटैच करने के तुरंत बाद पीटीबी चैनल का करंट उभरा । और वर्तमान बड़ा हो गया क्योंकि संपर्क के हैं, वर्तमान के आयाम को सीबीबी के अलग-अलग संलग्न हेरफेर के साथ सिंक्रोनाइज्ड किया गया था।यदि बुलबुले की संख्या उड़ाने के बाहर जलीय समाधान में लिपिड एकाग्रता बढ़ जाती है और मोनोलेयर का गठन नहीं होता है। इसके बाद लिपोसोम सेक्शन पर प्रेशर को दूर करने की कोशिश करें। एक बार सीबीबी गठन और चैनल पुनर्गठन की स्थापना कर रहे हैं, आप प्रचुरता के माध्यम से जलीय समाधान और झिल्ली की रचनाओं को अलग करने या हाइड्रोफिलिक या हाइड्रोफोबिक पदार्थों को इंजेक्शन देने की कोशिश कर सकते हैं।सीबीबी विधि ने चैनल-झिल्ली इंटरप्ले का पता लगाने के लिए बहुमुखी तरीके खोले हैं।

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In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. ...

Fabrication of High Contact-Density, Flat-Interface Nerve Electrodes for Recording and Stimulation Applications

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Many attempts have been made to manufacture multi-contact nerve cuff electrodes that are safe, robust and reliable for long term neuroprosthetic ...

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

पूर्व Vivo इमेजिंग प्रयोगों के लिए वयस्क Zebrafish से ताजा रेटिना स्लाइस की तैयारी

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding ...

Conducting Hyperscanning Experiments with Functional Near-Infrared Spectroscopy

कार्यात्मक निकट अवरक्त स्पेक्ट्रोस्कोपी के साथ Hyperscanning प्रयोगों का आयोजन

Concurrent brain recordings of two or more interacting persons, an approach termed hyperscanning, are gaining increasing importance for our understanding ...

Using Neuron Spiking Activity to Trigger Closed-Loop Stimuli in Neurophysiological Experiments

न्यूरोफिजियोलॉजिकल प्रयोगों में बंद लूप उत्तेजनाओं को ट्रिगर करने के लिए न्यूरॉन स्पाइकिंग गतिविधि का उपयोग करना

Closed-loop neurophysiological systems use patterns of neuronal activity to trigger stimuli, which in turn affect brain activity. Such closed-loop systems ...

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सह-संस्कृति प्रयोगों के लिए ओलिगोडेन्रोसाइट्स और ओलिगोडेन्ट्रोसाइट-वातानुकूलित माध्यम की पीढ़ी

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials ...