Name: lipid bilayer experiments with contact bubble bilayers for patch-clampers
Uploaded: 2019-01-16T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers at JoVE.com

Gli autori vorrei ringraziare Mariko Yamatake e Masako Takashima per assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da KAKENHI grant numeri 16H 00759 e 17 H 04017 (SO).

1. preparare liposomi
<ol><li>Disperdere i fosfolipidi (ad esempio, 10 mg in polvere) in cloroformio a una concentrazione desiderata (ad esempio, 10 mg/mL).</li>
	<li>Evaporare il cloroformio.<ol>
<li>Posto la soluzione del fosfolipide in un pallone e impostare su un evaporatore rotante (Vedi Tabella materiali) collegato a una bombola del gas2 N. Ruotare il pallone sotto flusso di2 N a temperatura ambiente fino a quando appare una pellicola sottile del fosfolipid...

Il metodo CBB di formazione bilayer del lipido è basato sul principio di una gocciolina di acqua in olio allineata da un monostrato20. Tecnicamente, le procedure per la formazione di CBB sono facili, soprattutto per i ricercatori di patch-clamp, che sono esperti nella manipolazione delle micropipette di vetro. L'installazione elettrofisiologica per il morsetto di toppa prontamente viene utilizzato il gancio di traino quando due manipolatori di pipetta con microinjectors sono disponibili. D'altra ...

Per i canali ionici, la membrana cellulare non è semplicemente un materiale di supporto, ma un partner per generare il flusso di ioni. Funzionalmente, la membrana è un isolante elettrico in cui ioni canali vengono incorporati, e tutte le membrane cellulari sono impartite con un potenziale di membrana di riposo. Convenzionalmente, un potenziale di membrana arbitrario è stato imposto da un circuito esterno mediante il quale è stata misurata la corrente elettrica attraverso i canali. Questa valutazione quantitativa del flusso ionico a potenziali di membrana differenti hanno rivelato le proprietà molecolari di questi canali, come loro permeazione iono-selettivi e gating funzioni1,2. La piattaforma di membrana per studi funzionali dei canali ionici è la membrana delle cellule o la membrana lipidica a doppio strato. Storicamente, monocanale elettriche corrente registrazioni vennero eseguiti per la prima volta nel bilayer del lipido3,4, e le relative tecniche sono state sviluppate per le membrane cellulari, ad esempio il metodo di patch-clamp (Figura 1A )5,6. Da allora, queste due tecniche si sono evolute separatamente per scopi diversi (Figura 1)7,8.
I lipidi della membrana e membrane doppio strato sono attualmente al centro di ricerca per il loro ruolo nel sostenere la struttura e la funzione delle proteine canale. Pertanto, la disponibilità di metodi per variare la composizione lipidica in strati lipidici è in forte domanda. Metodi di formazione bilayer del lipido come il planare del lipido doppio strato (PLB)8,9,10,11, gocciolina di acqua in olio doppio strato12e gocciolina interfaccia doppio strato (DIB)13, 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 tecniche (Figura 1) sono scelte comuni, fornendo un'opportunità per esaminare la funzione di canale in variabili del lipido composizioni20. Anche se il DIB è tecnicamente molto più facile da produrre rispetto il PLB convenzionale, le grandi dimensioni della DIB ha creato un disincentivo per patch-affrancate per applicarlo per studiare monocanale registrazioni corrente con usuali dimensioni conduttanza (< 100 pS).
Per aggirare il rumore di fondo, la zona di doppio strato deve essere minimizzata. Questo problema ricorda le ripetizioni di storia nello sviluppo di tecniche elettrofisiologiche per lipidici (Figura 1). Nei primi giorni, un doppio strato di piccole dimensioni (1-30 µm di diametro) è stato formato sulla punta di una pipetta (metodo punta-dip; Figura 1 C) 21 , 22 , 23, anziché utilizzare un bilayer autoportante (~ 100 µm di diametro) su un setto idrofobo in una camera (Figura 1B). Il metodo di punta-dip ammessi per misure elettriche con molto più basso di rumore di sfondo24. Le nostre esperienze con il PLB25,26, punta-tuffo22,23,27e patch-clamp28,29,30, 31 metodi ci ha portato a una nuova idea di formare lipidici utilizzando i principi del bilayer acqua in olio. Noi abbiamo fatto riferimento a questo come il contatto bolla doppio strato (CBB) metodo20,32. In questo metodo, piuttosto che appendere le goccioline d'acqua in una fase di olio (Figura 1D), una bolla di acqua è saltata da una pipetta di vetro (con diametro di punta di circa 30 µm) nella fase oleosa (Figura 1E e 2), dove il bolla è mantenuta applicando una pressione costante. Forma un monostrato spontaneamente all'interfaccia acqua-olio sulla superficie della bolla. Quindi, due bolle sono ancorate attraverso la manipolazione di due pipette in vetro e il bilayer è formato come i due strati monomolecolari si avvicinano, producendo un'area di doppio strato di equilibrio. La dimensione della bolla è controllata la pressione intra-bolla (tenendo la pressione), e allo stesso modo la dimensione di doppio strato. Diametro medio di 50 µm è usato frequentemente. Anche se il volume della bolla è piccolo (< 100 pL), è collegato al più grande volume della soluzione pipetta che è nella gamma microlitro, che costituisce la fase di massa dell'elettrolito.
Ci sono molti vantaggi di utilizzare il metodo CBB (tabella 1). Come una tecnica di formazione del doppio strato lipidico, membrane di varie composizioni lipidiche possono essere prodotte e membrane asimmetriche sono più facilmente formato32 rispetto sono quelli tramite il metodo pieghevole convenzionale33. Il doppio strato possa essere manipolato meccanicamente, a differenza del PLB convenzionale che può solo essere piegato con una differenza di pressione idrostatica34,35. Modificando la pressione della holding, le bolle o espandere o ridurre, che conduce a membrana aumentata o diminuita tensione32. Il doppio strato è meccanicamente staccabile in strati monomolecolari, simili a di36,di tecnica37 freeze-frattura delle membrane in studi morfologici, ma con il gancio di traino, una manovra permette per ripetuti cicli32 di collegamento e scollegamento . Il piccolo volume della soluzione dell'elettrolito all'interno della bolla permette efficiente fusione dei liposomi ricostituiti canale in doppio strato, e la probabilità di ottenere registrazioni di canale è molto superiore con la tecnica convenzionale di PLB. Il volume di piccola bolla consente inoltre rapido aspersione (all'interno di ~ 20 ms) una volta un'altra iniezione pipetta viene inserito in una delle bolle. A differenza del metodo di patch-clamp, una volta rotto, una membrana CBB è ri-formata immediatamente e ripetutamente e pipette possono essere utilizzati più volte al giorno. Integrando i benefici del patch-clamp e metodi PLB, il gancio di traino fornisce una piattaforma versatile per variare le condizioni fisico-chimiche della membrana, permettendo senza precedenti studi di interazioni canale-membrana.
Prima di presentare un protocollo dettagliato del processo di formazione di CBB, background fisico-chimiche della formazione del doppio strato viene presentato il primo, che sarà utile per patch-affrancate risolvere difficoltà sperimentali relativi alla formazione della membrana che vengono rilevati.
Esperimenti CBB impartire lezioni di chimica di superficie scienza38. Il gancio di traino è simile a una bolla di sapone soffiata da una cannuccia in aria, dove allo stesso modo, una bolla di acqua è soffiata in un solvente organico. Si noterà che una bolla d'acqua difficilmente viene gonfiata quando i lipidi della membrana non sono incluse nella bolla d'acqua o il solvente organico. In assenza di amphipathic lipidi, la tensione superficiale a un'interfaccia acqua-olio è elevata e la pressione intra-bolla per soffiare una bolla sarà alta. Si tratta di una realizzazione dell'equazione di Laplace (ΔP = 2 γ/R, dove ΔP è la pressione intra-bolla, γ è la tensione superficiale e R è il raggio della bolla). Quando la concentrazione dei lipidi in fase organica o la soluzione elettrolitica è elevata, aumenta la densità dei lipidi nello strato monomolecolare del, come dettato dalla isoterma di adsorbimento di Gibbs (-dγ = Γho dµio, dove Γ è l'eccesso di superficie del composto i e µio è il potenziale chimico del componente i)39, che conduce ad una bassa tensione superficiale e la facilità di formazione di bolle. Il gancio di traino, il doppio strato può essere osservato da un angolo tangenziale (Figura 2), nell'angolo di contatto tra il monostrato e doppio strato è misurabile. Questo angolo rappresenta un equilibrio tra il surface tensions del monostrato e doppio strato (equazione giovane: γbi = γmo cos(θ), dove γbi è il tensionamento di doppio strato, γmo è la tensione dello strato monomolecolare e θ è l'angolo di contatto). Le modifiche nell'angolo di contatto indicano cambiamenti nella tensione doppio strato, dato che la tensione di monostrato è valutata dalla variazione dell'angolo di contatto in funzione del potenziale di membrana (equazione di Young-Lippmann: γmo = Cm V2 /4 (cos (θ0) - cos (θv)), dove Cm è la capacità di membrana, V è il potenziale di membrana, e θ0 e θv sono gli angoli di contatto a 0 e mV V, rispettivamente)40,41 ,42. Quando due bolle sono abbastanza vicini, si avvicinano spontaneamente. Ciò è dovuto la forza di van der Waals, e possiamo osservare visivamente questo processo dinamico nella formazione di CBB.
Un sistema CBB è composto da fasi distinte: vale a dire, una fase di olio sfuso, acqua bolle rivestite con uno strato monomolecolare e un doppio strato di contatto (Figura 3). Queste sono le ricorda le fasi più osservate in un PLB, come un toro contenenti solventi intorno il doppio strato e una fase organica sottile intramezzato da due strati monomolecolari43,44. Il gancio di traino, la fase di monostrato è in continuità con l'opuscolo di doppio strato, in molecole lipidiche prontamente diffondono tra il monostrato e il foglio illustrativo. La fase dello strato monomolecolare copre la maggior parte della superficie della bolla, che costituiscono la fase principale che funge da serbatoio del lipido. Perché la coda idrofobica dei lipidi nello strato monomolecolare del si estende verso l'esterno per la fase di olio sfuso, all'interno del doppio strato o il nucleo idrofobo viene aperta la fase di olio sfuso. Così, una sostanza idrofoba iniettata nella fase oleosa vicino a doppio strato è in grado di accedere facilmente all'interno del doppio strato. Questa è la tecnica di aspersione di membrana che avevamo sviluppato recentemente45, di cui la composizione lipidica a doppio strato è cambiata rapidamente (entro un secondo) durante le registrazioni di corrente di singolo canale. Abbiamo trovato che il contenuto di colesterolo in doppio strato potrebbe essere controllato reversibilmente di accensione/spegnimento45la perfusione di colesterolo. Nel caso in cui la concentrazione della sostanza in monostrato e doppio strato è diverso, il gradiente di concentrazione della sostanza in questione è dissolto immediatamente attraverso la diffusione, che è noto come l' effetto Marangoni46, 47. d'altra parte, infradito attraverso gli strati monomolecolari sono lento48,49,50.
Utilizzando il metodo CBB, il doppio strato è formato in versatile condizioni fisico-chimiche, ad esempio un pH di elettrolito basso quanto 1 51, una concentrazione di sale (K+, Na+, ecc.) fino a 3 M, un potenziale di membrana alto come mV ± 400 e un sistema temperatura fino a 60 ° c.
Ci sono diverse opzioni per la formazione del gancio di traino e l'incorporazione di molecole di canale in esso. Per la formazione di strato monomolecolare all'interfaccia acqua-olio, lipidi vengono aggiunti in un solvente organico (metodo del lipido-out; Figura 4 A, 4 C) o in una bolla come liposomi (metodo del lipido-in; Figura 4 B, 4D). In particolare, il metodo del lipido-in permette la formazione di membrane asimmetriche15,32. Molecole di canale solubile in soluzione acquosa (ad es., formare canali peptidi) vengono aggiunti direttamente nella bolla (Figura 4A, B)52,53, considerando che le proteine canale sono ricostituiti nell' liposomi, che vengono quindi aggiunti nella bolla (Figura 4C, D). Nel presente documento, la formazione di CBB dal metodo del lipido-in per un peptide di canale (polytheonamide B (pTB); Figura 4 A) o una proteina (KcsA canale del potassio, Figura 4C) è indicata.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:607px;" width="605">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">Azolectin (L-&#945;-Phosphatidylcholine, Type IV-S)</td>
			<td style="width:85px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">P3644</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:219px;">A/D Converter</td>
			<td style="width:85px;">Molecular Divices</td>
			<td style="width:124px;">Digidata1550A</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">Ag/AgCl electrode</td>
			<td style="width:85px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:124px;">64-1317</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Bath Sonicator</td>
			<td style="width:85px;">Branson</td>
			<td style="width:124px;">M1800H-J</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">Camera</td>
			<td style="width:85px;">Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:124px;">C11440-10C</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:219px;">Glass Capillary</td>
			<td style="width:85px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:124px;">30-0062</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Hepes</td>
			<td style="width:85px;">Dojindo</td>
			<td style="width:124px;">342-01375</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:219px;">Hole Slideglass</td>
			<td style="width:85px;">Matsunami Glass</td>
			<td style="width:124px;">S339929</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Inverted Microscope</td>
			<td style="width:85px;">Olympus</td>
			<td style="width:124px;">IX73</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Isolation Table</td>
			<td style="width:85px;">Herz</td>
			<td style="width:124px;">TDI-86LA(Y)2</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Micro Injenctor</td>
			<td style="width:85px;">Narishige</td>
			<td style="width:124px;">IM-11-2</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Micro Manipulator</td>
			<td style="width:85px;">Narishige</td>
			<td style="width:124px;">EMM</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Microforge</td>
			<td style="width:85px;">Narishige</td>
			<td style="width:124px;">MF-830</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Micropipette holder</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">n-Hexadecane</td>
			<td style="width:85px;">Nacalai</td>
			<td style="width:124px;">07819-32</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Patch-Clamp Amplifier</td>
			<td style="width:85px;">HEKA</td>
			<td style="width:124px;">EPC800</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">Pipette Puller</td>
			<td style="width:85px;">Sutter Instrument Co.</td>
			<td style="width:124px;">P-87</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine)</td>
			<td style="width:85px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:124px;">850457</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:219px;">POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine 
			)</td>
			<td style="width:85px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:124px;">850757</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">POPG (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) )</td>
			<td style="width:85px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:124px;">840457</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:85px;">Nacalai</td>
			<td style="width:124px;">28514-75</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Rotary Evapolator</td>
			<td style="width:85px;">Iwaki</td>
			<td style="width:124px;">REN-1000</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Succinic Acid</td>
			<td style="width:85px;">Nacalai</td>
			<td style="width:124px;">32402-05</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Vacuum Pump</td>
			<td style="width:85px;">Buchi</td>
			<td style="width:124px;">V-100</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lipid bilayer experiments with contact bubble bilayers for patch-clampers

Lipidici forniscono un'unica piattaforma sperimentale per studi funzionali dei canali ionici, che consente l'esame delle interazioni di canale-membrana sotto membrana varie composizioni lipidiche. Tra loro, il bilayer interfaccia gocciolina ha guadagnato popolarità; Tuttavia, la dimensione grande membrana ostacola la registrazione del rumore di fondo elettrico basso. Abbiamo stabilito un metodo di contatto bolla doppio strato (CBB) che combina i vantaggi del doppio strato lipidico planare e metodi di patch-clamp, ad esempio la possibilità di variare la composizione lipidica e di manipolare la meccanica a doppio strato, rispettivamente. Utilizzando il programma di installazione per esperimenti di patch-clamp convenzionali, esperimenti basati su gancio di traino possono essere eseguiti facilmente. In breve, una soluzione elettrolitica in una pipetta di vetro è soffiata in una fase di solvente organica (esadecano), e la pressione di pipetta viene mantenuta per ottenere una dimensione di bolla stabile. La bolla spontaneamente è fiancheggiata da un monostrato lipidico (lipidi puri o misto di lipidi), che è fornito da liposomi nelle bolle. Successivamente, le due monostrato-foderato bolle (~ 50 µm di diametro) sulla punta delle pipette di vetro vengono ancorate per formazione di doppio strato. Introduzione di liposomi ricostituiti canale nella bolla conduce all'incorporazione di canali in doppio strato, consentendo per la registrazione corrente di singolo canale con un rapporto segnale-rumore paragonabile a quella delle registrazioni di patch-clamp. CBB con una composizione asimmetrica del lipido sono prontamente formate. Il gancio di traino è rinnovato ripetutamente che soffia le bolle precedenti e formando nuovi. Varie perturbazioni fisiche e chimiche (ad es., aspersione di membrana e doppio strato tensione) possono essere imposto il CBB. qui, vi presentiamo la procedura di base per la formazione di CBB.

Un tipico CBB aveva un diametro di 50 µm (Figura 56) e la capacità di membrana specifici in esadecano era 0,65 µF/cm2. La dimensione della bolla è stato arbitrariamente controllata dalla pressione intra-bolla. Quando piccole bolle sono necessari per le registrazioni di basso rumore, il diametro della punta deve essere corrispondentemente piccolo. Ad esempio, per una dimensione di bolla di 50 µm di diametro, il diametro della p...

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Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers

Qui, presentiamo un protocollo per la formazione di lipidici utilizzando un metodo di doppio strato di contatto bolla. Una bolla di acqua è soffiata in un solvente organico, per cui un monostrato è formato all'interfaccia acqua-olio. Due pipette sono manipolati per ancorare le bolle per formare un doppio strato.

Esperimenti di Bilayer del lipido con contatto bolla lipidici per Patch-affrancate

Lipid bilayers provide a unique experimental platform for functional studies of ion channels, allowing the examination of channel-membrane interactions ...

Il metodo Contact Bubble Bilayer è una tecnica alternativa per i bistrati lipidici convenzionali. e questo metodo consente vibrazioni più versatili attraverso la membrana. Il metodo CBB integra i vantaggi del bistrato lipidico planare e del metodo del patch clamp.Come tecnica lipidica bistrato si può formare una CBB con una composizione lipidica arbitraria. Abbiamo sviluppato una CBB per registrazioni di corrente a canale singolo con un elevato rapporto segnale/rumore. Questo metodo consente varietà di vibrazioni a membrana e offre una vasta piattaforma di tipo all'interfaccia della membrana del canale.Tutti hanno provato a soffiare una bolla di sapone. Manovre simili vengono prese per la formazione di CBB per perfezionare manualmente la pressione applicata piuttosto che soffiare per bocca. Esercitati e goditi la CBB.Per essere questa procedura disperdere i fosfolipidi in cloroformio a una concentrazione desiderata in un pallone inferiore rotondo. Posizionare la soluzione fosfolipidica su un evaporatore rotante collegato a una bombola di gas azoto. Ruotare il pallone sotto il flusso di azoto a temperatura ambiente fino a quando non appare una sottile pellicola fosfolipidica.Quindi posizionare il pallone aperto in un essiccatore collegato a una pompa per vuoto. Utilizzando la pompa per vuoto aspirare l'interno dell'essiccatore per diverse ore per rimuovere accuratamente il cloroformio. Successivamente aggiungere un volume appropriato di soluzione elettrolitica al pallone e sospendere il fosfolipide per ottenere due milligrmi per sospensione fosfolipidica millilitro.Sonciate la sospensione per 20-30 secondi utilizzando un sonicatore da bagno per ottenere una sospensione vesicolare multistrato. Per la preparazione di proteoliposomes che contengono proteine del canale ionica, aggiungere una soluzione proteica alla sospensione vescicolare multistrato. E sonicare per diversi secondi usando il sonicatore da bagno.Per preparare pipette di vetro di grandi dimensioni, posizionare un capillare di vetro in un estrattore di pipetta e fabbricare la micropipetta con una punta affusolata fine attraverso la trazione in due gradini. Quindi impostare la micropipetta su una micro fucina e contattare la punta della micropipetta su un filamento di platino nella porzione affusolata con un diametro da 30 a 50 micrometri. Scaldare brevemente il filamento e spegnerlo immediatamente.Utilizzando acqua distillata ed etanolo pulire la superficie dello scivolo di vetro con un pozzo poco profondo. Successivamente applicare il reagente siliconizzante sullo scivolo di vetro e lasciare asciugare completamente il reagente nell'aria. Quindi posizionare lo scivolo di vetro sul palco di un microscopio invertito.Aggiungere 100 microlitri di esadecano nel pozzo poco profondo dello scivolo di vetro siliconizzato. L'uso di una siringa tubercorina riempie la soluzione elettrolita fino alla metà della lunghezza della micropipetta. Successivamente impostare la micropipetta sul supporto in micropipetta con la porta di pressione, consentendo all'elettrodo di filo di cloruro argento/argento di immergersi nella soluzione elettrolita pipetta.Collegare uno dei supporti di micropipetta allo stadio di testa di un amplificatore a morsetto patch e l'altro al terreno elettrico. Successivamente collegare un microiniettore alla porta di pressione del supporto di micropipetta. Regolare la micropipetta in una posizione appropriata sopra lo stadio di un microscopio invertito utilizzando il micromanipolatore.Per regolare il potenziale di offset dell'elettrodo, posizionare un microliter della stessa soluzione elettrolitica utilizzata per riempire la micropipetta sulla superficie piana attorno al pozzo poco profondo dello scivolo di vetro per creare una cupola elettrolitica. Immergere la punta di entrambe le micropipette nella cupola dell'elettrolita. Successivamente regolare il potenziale di offset dell'elettrodo dell'amplificatore del morsetto patch.Per disegnare la soluzione liposoma dalla punta, aggiungere un microlitro di soluzione liposoma sulla superficie piana attorno al pozzo poco profondo del vetro scorrevole. Quindi posizionare la punta della micropipetta nel liposoma contenente cupola. Aspirare la soluzione contenente liposoma utilizzando il microiniettore.Ripetere la procedura per l'altro mircopipette per l'aspirazione dei liposomi ricostituiti del canale. Ora posizionare la micropipetta nell'esadecano nel pozzo poco profondo. Soffiare lentamente una bolla d'acqua aumentando la pressione fino a quando la bolla raggiunge la dimensione desiderata e mantenere la stessa pressione in seguito.Scartare la bolla passando la punta attraverso l'interfaccia olio-aria se è difficile mantenere stabili le dimensioni della bolla. Ripetere le procedure fino a formare due bolle stabili. Stabilire un contatto tra le due bolle.Mettere a punto la pressione per mantenere le dimensioni della bolla, perché le dimensioni possono cambiare gradualmente anche alla pressione costante intra-bolla. Impostare il potenziale della membrana sul valore appropriato utilizzando l'amplificatore di attestazione della patch e attendere che la corrente del canale emerga. Per una formazione stabile dei due livelli lipidici è essenziale pulire i blotter.La preparazione capillare del vetro o della pipetta deve essere lavata accuratamente ed evitare la contaminazione da parte delle molecole di detergente. Una volta che la CBB aveva formato le molecole di canale in soluzione acquosa o nel liposoma sono state spontaneamente inserite nel bistrato nell'arco di pochi o decine di minuti. Gli inserimenti dei canali sono stati confermati dal saggio aumento dell'ampiezza di corrente sotto il potenziale della membrana applicata.Un bistrato formato dal metodo CBB può essere disintegrato in due monostrati. La corrente del canale pTB è emersa immediatamente dopo aver collegato i due monostrati. E la corrente divenne più grande man mano che le sono di contatto aumentavano l'ampiezza della corrente era sincronizzata con la manipolazione del detach attach della CBB.Se il numero soffia fuori dalle bolle aumenta la concentrazione lipidica nella soluzione acquosa diminuisce e il monostrato non si forma. Quindi cerca di alleviare la pressione sulla sezione liposoma. Una volta stabilita la formazione di CBB e la ricostituzione del canale, puoi provare a variare le composizioni di soluzione acquosa e membrana tramite profusione o iniettando sostanze idrofile o idrofobiche.Il metodo CBB ha aperto modi versatili per esplorare gli interplay canale-membrana.

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Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation ...

SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy

Fusion SNARE-mediata del singolo proteoliposomi con bilayers Tethered supportati in una cella di flusso Microfluidic monitorati da polarizzata microscopia TIRF

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. ...

Fabrication of High Contact-Density, Flat-Interface Nerve Electrodes for Recording and Stimulation Applications

Fabbricazione di High Contact-Density, Flat-Interface Elettrodi nervose per la registrazione e la stimolazione Applicazioni

Many attempts have been made to manufacture multi-contact nerve cuff electrodes that are safe, robust and reliable for long term neuroprosthetic ...

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Preparazione fette fresche della retina dallo Zebrafish adulto per Ex Vivo Imaging esperimenti

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding ...

Conducting Hyperscanning Experiments with Functional Near-Infrared Spectroscopy

Esperimenti di Hyperscanning con spettroscopia funzionale nel vicino infrarosso

Concurrent brain recordings of two or more interacting persons, an approach termed hyperscanning, are gaining increasing importance for our understanding ...

Using Neuron Spiking Activity to Trigger Closed-Loop Stimuli in Neurophysiological Experiments

Utilizzo dell'attività di spiking del neurone per attivare gli stimoli a ciclo chiuso negli esperimenti neurofisiologici

Closed-loop neurophysiological systems use patterns of neuronal activity to trigger stimuli, which in turn affect brain activity. Such closed-loop systems ...

Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments

Generazione di Oligodendrociti e Mezzo Condizionato oligodendrocito per Esperimenti Co-Culture

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials ...