Name: lipid bilayer experiments with contact bubble bilayers for patch-clampers
Uploaded: 2019-01-16T13:45:00
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著者は、テクニカル サポートに真理子山武と雅子高島を感謝したいです。この作品が支持された部分で科研費による補助金番号 16 H 00759 と 17 H 04017 (SO)。

1. リポソーム
<ol><li>(例えば、10 mg/mL) 望ましい集中にクロロホルムでリン脂質 (例えば粉末で 10 mg) を分散させます。</li>
	<li>クロロホルムを蒸発させます。<ol>
<li>場所丸底フラスコ、ロータリーエバポレーターでそれは N2ガス シリンダーに接続 (材料の表を参照してください) のセットでリン脂質液。(30 分程度) 後表示される薄いリン脂質膜まで室温で N<sub...

CBB 脂質二分子膜形成法は、単層20並んで油中水滴の原則に基づいています。技術的には、CBBs を形成するための手順が簡単、特にガラス マイクロ ピペットの操作に精通したパッチ ・ クランプの研究者。インジェクターを持つ 2 つのピペット マニピュレーターがありますパッチ クランプの電気生理学的のセットアップが容易に、CBB で使用されます。一方、CBB は従来の PLB ?...

イオン チャネルの細胞膜は単にサポート材料パートナー イオン流束を生成するためです。機能的には、膜はイオン チャンネルが埋め込まれて、電気絶縁体、すべての細胞膜が静止膜電位を別れて。従来、任意の膜電位は、チャネルを介して電圧電流の測定、外部回路から課されました。別の膜電位でのイオン流束のこの定量的評価では、これらのチャネルのイオン選択性透過などゲーティング機能1,2分子の特性を明らかにしました。イオン チャネルの機能解析のための膜プラットフォームは、細胞膜や脂質二分子膜です。歴史的に、シングル チャネル電気現在録音は脂質二重膜3,4で最初に実行された、関連技術をパッチ ・ クランプの方法 (図 1Aなどの細胞膜の開発しました。)5,6。以来、これらの 2 つの手法を個別にさまざまな目的 (図 1)7,8の進化しています。
膜脂質と二分子膜は、現在のチャネル蛋白質の機能と構造を支える役割研究の焦点です。したがって、膜脂質組成を変化させる方法の準備状況は、需要が高いです。平面脂質二分子膜 (PLB)8,9,10,11、油中水滴二層12、液滴インターフェイス層 (DIB)13,などの脂質二分子膜形成方法14,15,16,17,18,19テクニック (図 1) は、一般的な選択肢、20脂質組成の変動を受けるチャネル機能を調べることのための機会を提供することです。DIB は技術的に従来の PLB よりもはるかに簡単ですが、DIB の大きいサイズがシングル チャネル伝導性の通常サイズと現在のレコーディングを勉強のために適用するパッチ取り付けの阻害要因を作成 (< 100 pS)。
バック グラウンド ノイズを回避するために膜面積を最小化する必要があります。この問題は、脂質二重層 (図 1) の電気生理学的な技術の開発の歴史の繰り返しを思い出します。(先端ディップ法; ピペットの先端に形成された小型膜 (直径 1-30 μ m) 初期の頃の図 1C)21,22,商工会議所 (図 1B) の疎水性中隔のフリースタンディング膜 (直径 ~ 100 μ m) を使用してのではなく、 23日。多くの低いバック グラウンド ノイズ24電気計測のヒント ディップ法。PLB25,26, 先端ディップ22,23,27, パッチク ランプ-28,29,30,と私たちの経験31の方法は、水に油の膜の原理を使用して脂質二重層を形成、斬新なアイデアに私たちを導いた。連絡先バブル膜 (CBB) メソッド20,32としてこれを紹介しています。このメソッドで水滴を油相 (図 1D) にぶら下がっているのではなく水のバブルからの吹きガラス ピペット (先端を直径約 30 μ m) と(図 1と 2)、油相にどこ、バブルは、安定した圧力を適用することによって管理されます。バブルの表面で水-油界面における自発的に単分子膜形態。2 つのガラス ピペットの操作によって 2 つの気泡がドッキングしているし、2 つの単分子膜は平衡二分子膜領域を降伏、互いに近づくと、2 層が形成されます。バブルのサイズは、(保持圧力)、内バブル圧と同様に二層サイズによって制御されます。50 μ m の平均粒径がよく使用されます。泡のボリュームは小さい (< 100 pL)、バルク電解質相を構成する 1 マイクロリットルの範囲内にあるピペット ソリューションの大きいボリュームに接続されています。
CBB 法 (表 1) を使用する多くの利点があります。脂質二分子膜形成技術として様々 な組成の脂質膜を作り出すことができると従来の折りたたみ法33によるものよりも、非対称膜がより容易に形成された32 。2 層機械的に操作できます、静水圧差34,35曲げるだけことができる従来の PLB とは異なり。保持圧力を変更すると、泡で拡張または縮小、増加または減少させる膜張力32に 。2 層は、単分子膜、形態学的研究における膜の凍結破壊技術36,37のように機械的に取り外し可能が、CBB、策略により繰り返さデタッチし、アタッチ サイクル32.バブル内の電解液の少量は、二層にチャネル再構成リポソームの効率的な融合でき、チャネルの録音を得ることの確率は従来の PLB 手法でよりはるかに高い。小さな気泡容積も急速な灌流 (~ 20 ms) 内で一度別注入が可能ピペットが泡のいずれかを挿入します。パッチ ・ クランプのメソッドとは異なり、ただちに、壊れた、CBB 膜が再結成し、ピペットは、日に数回を使用できます。パッチ ・ クランプと PLB メソッドの利点を統合することにより、CBB はチャネル膜相互作用の前例のない研究を可能にする膜の物理化学的条件の変化する汎用性の高いプラットフォームを提供します。
CBB 形成過程の詳細なプロトコルを提示する前に膜形成の物理化学的背景膜形成に関する実験の難しさを解決するパッチ取り付けのために有用される最初にされます。それが発生しました。
CBB 実験は、界面化学科学38の教訓を伝えます。CBB のシャボン玉吹きストローから空気中に水のバブルが有機溶剤に吹かれて同様に、どこに似ています。膜脂質、水のバブルや有機溶剤のいずれかに含まれていない場合、水のバブルが膨張ほとんど 1 つに気づくでしょう。両親媒性脂質がない場合は、油水界面での表面張力が高いと泡を吹くためバブル内の圧力が高くなります。これはラプラス方程式の実現 (ΔP = 2 γ/R、どこ ΔP 内バブル圧力、γ は表面張力、R はバブルの半径)。有機相または電解質溶液での脂質の濃度が高い場合、単分子膜の脂質の密度増加、ギブスの吸着等温線によって決定される (-dγ = Γ私dµ私、表面の過剰は私Γ化合物は、μ は私がコンポーネントの化学ポテンシャル私)39、低い表面張力とバブル形成の容易さに 。CBB の接線角度 (図 2) から 2 層を観測できるし、単分子膜と膜の間の接触角を測定可能です。この角度は、単分子膜の surface tensions と二分子膜間の平衡を表します (若い方程式: γbi = γmo cos(θ)、どこ γbiは二分子膜張力 γmo膜張力はある、θ は接触角)。接触角の変化は、単分子膜の張力は接触角の変化から膜電位の関数として評価されることを考える二分子膜緊張の変化を示す (若いリップマン式: γmo = Cm V2/4 (cos (θ0) - cos (θv))、ところ Cm膜容量、V は膜電位を、θ0と θvは、それぞれ 0 と V mV で接触角)40,41 ,42。2 つの泡が十分に近い、彼らは自発的に互いに接近します。これは van der Waals 力によるものと我々 は視覚的に CBB 形成における動的な過程を観察できます。
CBB システムは個別のフェーズで構成されています: バルク石油相、すなわち、水の泡、単層および接触層 (図 3) でコーティングします。これらは、膜相周辺 2 単分子膜43,44に挟まれた薄い有機相溶媒を含むトーラスなど、PLB において複数のフェーズを連想させる。CBB の単分子膜の相は、二層のリーフレットと連続と脂質分子単層とリーフレットの間拡散します。単分子膜の相は、脂質の貯蔵所として機能する主要なフェーズを構成する気泡表面のほとんどをカバーします。単分子膜の脂質の疎水性尾はバルク油相を外側に延長ので、二層内部または疎水性コアはバルク油相に開きます。したがって、2 層に近い油相に注入される疎水性の物質は膜内部に容易にアクセスすることができます。これは我々 が開発した最近45、急速に (秒) 以内、膜脂質組成を変更シングル チャネル現在録音中膜灌流法です。2 層でコレステロール含有量が45の内外でのコレステロール血流を切り替えることにより可逆的に制御できることがわかった。関連する物質の濃度勾配の解消がマランゴニ効果46,として知られている拡散をすぐに単層および二層に関連する物質の濃度が異なる場合に、47。 その一方で、単一層にフリップフ ロップが遅い48,49,50。
CBB メソッドを使用すると、2 層が、電解質の pH 低 1 としてなど、多彩な物理化学的条件の下で形成されるシステム注 mV として高い膜電位、最大 3 M (K+、ナ+)塩濃度5160 ° C までの温度
そこに、CBB の形成のためのいくつかのオプションとチャネル分子の結合があります。油水界面単分子膜の形成に有機溶剤 (脂質アウト メソッドで脂質が追加されます。図 4A、4 C)やリポソーム (脂質の方法; としてバブル図 4B、4 D)特に、脂質のメソッドは非対称膜15,32の形成のためことができます。チャネル蛋白質に再構成されたに対しチャネル分子 (例えば、チャネル形成ペプチド) 水溶液に可溶、バブル (図 4A, B)52,53, に直接追加されます。リポソームは、バブル (図 4C, D) に追加されます。ここで、チャネル ペプチド (巨大 B (pTB); 脂質で法による CBBs の形成図 4A) または蛋白質 (KcsA カリウム チャネル、図 4C) が表示されます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:607px;" width="605">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">Azolectin (L-&#945;-Phosphatidylcholine, Type IV-S)</td>
			<td style="width:85px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">P3644</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:219px;">A/D Converter</td>
			<td style="width:85px;">Molecular Divices</td>
			<td style="width:124px;">Digidata1550A</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">Ag/AgCl electrode</td>
			<td style="width:85px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:124px;">64-1317</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Bath Sonicator</td>
			<td style="width:85px;">Branson</td>
			<td style="width:124px;">M1800H-J</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">Camera</td>
			<td style="width:85px;">Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:124px;">C11440-10C</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:219px;">Glass Capillary</td>
			<td style="width:85px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:124px;">30-0062</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Hepes</td>
			<td style="width:85px;">Dojindo</td>
			<td style="width:124px;">342-01375</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:219px;">Hole Slideglass</td>
			<td style="width:85px;">Matsunami Glass</td>
			<td style="width:124px;">S339929</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Inverted Microscope</td>
			<td style="width:85px;">Olympus</td>
			<td style="width:124px;">IX73</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Isolation Table</td>
			<td style="width:85px;">Herz</td>
			<td style="width:124px;">TDI-86LA(Y)2</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Micro Injenctor</td>
			<td style="width:85px;">Narishige</td>
			<td style="width:124px;">IM-11-2</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Micro Manipulator</td>
			<td style="width:85px;">Narishige</td>
			<td style="width:124px;">EMM</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Microforge</td>
			<td style="width:85px;">Narishige</td>
			<td style="width:124px;">MF-830</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Micropipette holder</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">n-Hexadecane</td>
			<td style="width:85px;">Nacalai</td>
			<td style="width:124px;">07819-32</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Patch-Clamp Amplifier</td>
			<td style="width:85px;">HEKA</td>
			<td style="width:124px;">EPC800</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">Pipette Puller</td>
			<td style="width:85px;">Sutter Instrument Co.</td>
			<td style="width:124px;">P-87</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine)</td>
			<td style="width:85px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:124px;">850457</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:219px;">POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine 
			)</td>
			<td style="width:85px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:124px;">850757</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">POPG (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) )</td>
			<td style="width:85px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:124px;">840457</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:85px;">Nacalai</td>
			<td style="width:124px;">28514-75</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Rotary Evapolator</td>
			<td style="width:85px;">Iwaki</td>
			<td style="width:124px;">REN-1000</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Succinic Acid</td>
			<td style="width:85px;">Nacalai</td>
			<td style="width:124px;">32402-05</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Vacuum Pump</td>
			<td style="width:85px;">Buchi</td>
			<td style="width:124px;">V-100</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lipid bilayer experiments with contact bubble bilayers for patch-clampers

脂質二重膜脂質組成の様々 な膜の下でチャネル膜相互作用の検査を許可する、イオン チャネルの機能研究のユニークな実験的プラットフォームを提供します。中でも、液滴インターフェイス層の人気を得ていますただし、大型膜面サイズは、低電気ノイズの記録を妨げています。平面脂質二分子膜の利点を組み合わせた連絡先気泡膜 (CBB) 法と脂質組成を変化させると二分子膜の力学をそれぞれ操作する能力などのパッチ ・ クランプ方法を設けています。従来のパッチ ・ クランプの実験のセットアップを使用して、CBB 試験が容易に行えます。簡単に言えば、有機溶媒 (ヘキサデカン)、ガラス ピペットで電解質溶液が吹かれると、ピペット圧力が安定気泡サイズを取得維持されます。泡が泡でリポソームから提供される脂質膜 (純粋な脂質または混合脂質) 自発的に並んでいます。次に、2 つ単分子膜並んで泡 (~ 50 μ m 径) ガラス ピペットの先端には、二重膜形成のためドッキングされます。チャンネル再構成リポソームのバブルへの導入は、ホールセル記録に匹敵する単一チャネル信号対雑音比と現在の録音を可能にする、膜チャネルの設立に します。非対称の脂質組成の CBBs 容易に形成されています。CBB が以前泡を吹き、新しいものの形成によって繰り返し更新されます。CBBs。 ここに様々 な化学的および物理的な摂動 (例えば膜灌流と二分子膜緊張) を課すことができる、CBB の形成のための基本的な手順を提案します。

典型的な CBB いた (図 5, 6) 50 μ m の直径、ヘキサデカン特定膜容量 0.65 μ F/cm2であった。バブルの大きさは任意内気泡圧によって制御されます。小さな泡が低ノイズ録音に必要な先端の直径は少ないはずです。たとえば、直径 50 μ m の気泡径、先端径を 30 μ m にする必要があります。
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Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers

ここでは、連絡先バブル膜法を用いた脂質膜の形成のためのプロトコルを提案する.有機溶媒、油水界面単分子層を形成するという水のバブルが吹かれます。2 つのピペットは、層を形成する泡のドック操作されます。

パッチ取り付けの連絡先バブル膜脂質二分子膜実験

Lipid bilayers provide a unique experimental platform for functional studies of ion channels, allowing the examination of channel-membrane interactions ...

接触気泡二重層法は、従来の脂質二重層の代替技術である。そしてこの方法は膜を通してより多目的な振動を可能にする。CBB法は平面脂質二重層およびパッチクランプ方法の利点を統合する。脂質二重層技術として、任意の脂質組成を有するCBBを形成することができる。高い信号対ノイズ比を持つ単一チャンネル電流記録用のCBBを開発しました。この方法は、膜振動の品種を可能にし、チャネル膜インターフェースに広大なタイプのプラットフォームを提供しています。誰もがシャボン玉を吹く経験があります。同様の操作は、口で吹くのではなく、適用される圧力を手動で微調整することによってCBB形成のために取られる。練習し、CBBをお楽しみください。この手順であることに、丸底フラスコで所望の濃度でクロロホルム中のリン脂質を分散させる。窒素ガスボンベに接続された回転エバポレーターにリン脂質溶液を置きます。薄いリン脂質フィルムが現れるまで、室温で窒素流でフラスコを回転させます。次に、開いたフラスコを真空ポンプに接続されたデシケータに入れなさい。真空ポンプを使用して、デシケータの内部を数時間吸引し、クロロホルムを完全に除去する。続いて、適量の電解質溶液をフラスコに加え、リン脂質を懸濁して、1ミリリットルのリン脂質懸濁液当たり2ミリグラムを得る。バスソニテーターを使用して20〜30秒間懸濁液をゾンシエートし、多層ベシクル懸濁液を得る。イオンチャネルタンパク質を含むプロテオリポソームの調製のために、多層ベシクル懸濁液にタンパク質溶液を加える。そして、バス超音波処理器を使用して数秒間超音波処理します。大きなボアガラスピペットを準備するには、ピペットプーラーにガラスキャピラリーを入れ、2ステップの引っ張りで細かい先細りの先端でマイクロピペットを製造します。次にマイクロフォージにマイクロピペットをセットし、直径30~50マイクロメートルのテーパー部分の白金フィラメントにマイクロピペットの先端を接触させます。フィラメントを短時間加熱し、すぐに消します。蒸留水とエタノールを使用して、浅い井戸でガラススライドの表面をきれいにします。次に、シリコン化試薬をガラススライドに塗布し、試薬を空気中で完全に乾燥させます。次に、ガラススライドを反転した顕微鏡のステージに置きます。シリコン化ガラススライドの浅い井戸に100マイクロリットルの六方デカンを加えます。ツベルクリンシリンジを用いて、マイクロピペットの長さの半分まで電解液を充填する。次に、マイクロピペットを圧力ポート付きのマイクロピペットホルダーにセットし、銀/塩化銀のワイヤ電極をピペット電解質溶液に浸します。マイクロピペットホルダの1つをパッチクランプアンプのヘッドステージに接続し、もう1つを電気的な地面に接続します。その後、マイクロインジェクターをマイクロピペットホルダーの圧力ポートに接続します。マイクロマニピュレーターを使用して、マイクロピペットを反転顕微鏡のステージより上の適切な位置に調整します。電極オフセット電位を調整するには、ガラススライドの浅いウェルの周りの平らな表面にマイクロピペットを充填するために使用される同じ電解質溶液の1マイクロリットルを置き、電解質ドームを作成します。両方のマイクロピペットの先端を電解質ドームに浸します。その後、パッチクランプアンプの電極オフセット電位を調整します。先端からリポソーム溶液を引き出すために、スライドガラスの浅いウェルの周りの平らな表面に1マイクロリットルのリポソーム溶液を加える。次に、ドームを含むリポソームにマイクロピペットの先端を置きます。マイクロインジェクターを用いてリポソーム含有溶液を吸引する。チャネル再構成リポソームの他のミコピーペットについても手順を繰り返します。今、浅い井戸の六角にマイクロピペットのを置きます。気泡が所望の大きさになるまで圧力を上げることで、ゆっくりと水泡を吹き、その後同じ圧力を維持します。気泡の大きさを安定に保つのが難しい場合は、オイル空気界面を通してチップを通過して、泡を捨てます。2つの安定した気泡が形成されるまで手順を繰り返します。2 つの気泡の間に接触を確立します。気泡の大きさを維持するために圧力を微調整し、一定の気泡内圧力でもサイズが徐々に変化する可能性があるため。パッチクレームアンプを使用して膜電位を適切な値に設定し、チャネル電流が出てくるのを待ちます。安定した脂質二重層形成のためには、ブロッターを洗浄することが不可欠である。ガラスキャピラリーやピペットの調製は、十分に洗浄し、洗浄剤分子による汚染を避けるべきです。CBBが水溶液またはリポソームのいずれかでチャネル分子を形成すると、数〜数十分のスパン内で二重層に自発的に挿入された。チャネルの挿入は、適用された膜電位の下での現在の振幅のステップの賢明な増加によって確認された。CBB法によって形成された二重層は、2つの単層に崩壊させることができる。pTBチャネル電流は、2つの単層を取り付けた直後に現れました。そして、接触が増加するにつれて電流が大きくなり、CBBのデタッチアタッチ操作と同期した電流の振幅が増加した。気泡の吹き出量が多くなると水溶液中の脂質濃度が低下し、単層が形成されない。その後、リポソームセクションの圧力を緩和してみてください。CBBの形成とチャネルの再構成が確立されると、水溶液および膜の組成を、拡散または親水性または疎水性物質を注入することによって変化させることができます。CBB法はチャネル膜インタープレイを探索する多目的な方法を開いた。

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