Name: lipid bilayer experiments with contact bubble bilayers for patch-clampers
Uploaded: 2019-01-16T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers at JoVE.com

저자 마 리코 Yamatake와 마사코 다카시마 기술 지원에 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 지원 부분에서 KAKENHI에 의해 부여 번호 16 H 00759 및 17 H 04017 (SO).

1. 리 준비
<ol><li>원하는 농도 (예를 들어, 10 mg/mL)에 클로 프롬에 인지질 (예를 들어, 가루에 10 mg)을 분산.</li>
	<li>클로 프롬을 증발.<ol>
<li>장소는 둥근 바닥 플라스 크 및 회전 하는 증발 기에는 N2 가스 실린더에 연결 ( 테이블의 자료를 참조) 설정에서 인지질 솔루션. 상 온에서 N2 흐름 아래 플라스 크를 돌려 얇은 인지질 영화 (~ 30 분) 후 나타납니다.</li>...

지질 bilayer 형성의 CBB 메서드 단층20줄지어 물에 기름 방울의 원리를 기반으로 합니다. 기술적으로, Cbb 형성에 대 한 절차는 쉽게, 특히 패치 클램프 연구자, 유리 micropipettes 조작에 능숙 합니다. Microinjectors와 함께 두 개의 피 펫 조작자 사용할 수 있을 때 패치 클램프에 대 한 electrophysiological 설치 쉽게는 CBB에 사용 됩니다. 다른 한편으로는 CBB 기존의 첨 두 부하의 후임은, 때문에 ...

이온 채널, 세포 막 하지만 되지 않습니다 단순히 지원 자료 파트너 이온 플럭스를 생성 하기 위한. 기능적으로, 막은 이온 채널 포함, 전기 절연체 이며 모든 세포 막 휴식 막 잠재력으로 헤어 하지 않습니다. 전통적으로, 임의의 막 잠재적인 채널을 통해 전기 전류를 측정 하는 외부 회로에서 부과 되었다. 다른 막 잠재력에 이온 플럭스의 양적 평가이 그들의 이온 선택 투과 등 제어 기능1,2채널, 분자 속성을 밝혔다. 이온 채널의 기능 연구에 대 한 막 플랫폼 세포 막 또는 지질 bilayer 막입니다. 역사적으로, 단일 채널 전기 현재 녹음 지질 bilayers3,4에 초연 했다 그리고 패치 클램프 방법 (그림 1A 와 같이 세포 막에 대 한 관련 기술 개발 ),56. 그 이후,이 두 가지 기술을 다른 목적 (그림 1)7,8별도로 진화 했습니다.
막 지질 bilayer 막 하 고 현재 채널 단백질의 기능과 구조를 지 원하는 그들의 역할에 대 한 연구의 초점입니다. 따라서, bilayers에 지질 구성을 변경 하는 방법의 준비 여부 수요가입니다. 평면 지질 bilayer (첨 두 부하)8,,910,11, 물에서 기름 방울 bilayer12, 드롭릿 인터페이스 bilayer (DIB)13, 등 지질 bilayer 형성 방법 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 기술 (그림 1) 일반적인 선택, 다양 한 지질 구성20에서 채널 기능을 조사 하기 위한 기회를 제공 하는. DIB는 기술적으로 훨씬 쉽게 기존의 첨 두 부하 보다 생산 하는 DIB의 대형 패치-clampers 단일 채널 현재 녹음 일반적인 크기의 전도도와 공부에 대 한 적용에 대 한 억제 만들었습니다 (< 100 pS).
배경 잡음을 회피, bilayer 영역을 최소화 해야 합니다. 이 문제는 electrophysiological 지질 bilayers (그림 1) 기술 개발 역사의 반복 회상 합니다. 초기에, 소형 bilayer (1-30 µ m 직경에서) 피 펫 (팁-딥 방법;의 끝에 형성 되었다 그림 1 C) 21 , 22 , 23, 보다는 (그림 1B) 챔버에 소수 성 심장에 독립형 bilayer (~ 100 µ m 직경에서)를 사용 하 여. 팁-딥 방법 훨씬 낮은 배경 잡음24전기 측정에 대 한 허용. 우리의 경험 첨 두 부하25,26, 팁-딥22,,2327, 및 패치 클램프28,,2930, 31 방법 이끌어 냈다 우리 물에서 기름 bilayer의 원리를 사용 하 여 형성 하는 지질 bilayers의 소설을 생각. 우리는 연락처 거품 bilayer (CBB) 메서드20,32라고이. 이 방법에서는, 석유 단계 (그림 1D), 물방울 거 보다 물 거품은 날 려 (팁 약 30 µ m의 직경)와 유리 피 펫에서(그림 1와 2), 기름 단계로 어디에 거품은 지속적인 압력을 적용 하 여 유지 됩니다. 거품의 표면에 물-오일 인터페이스에 저절로 단층 양식. 다음, 두 거품 두 유리 펫의 조작을 통해 도킹 하 고 두 monolayers 접근, 서로 평형 bilayer 지역 양보는 bilayer 형성 됩니다. 거품의 크기는 내부 거품 압력 (압력을 들고), 그리고 마찬가지로 bilayer 크기에 의해 제어 됩니다. 50 µ m의 평균 직경은 자주 사용 됩니다. 거품의 볼륨은 작은 (< 100 pL), 대량 전해질 단계 구성 microliter 범위 내에 있는 피 펫 솔루션의 더 큰 볼륨에 연결 된다.
CBB 방법 (표 1)를 사용 하 여 많은 이득이 있다. 지질 bilayer 형성 기술, 다양 한 지질 성분의 세포 막 생성 될 수 있다, 그리고 비대칭 막 더 쉽게 형성된32 보다 그 기존의 접는 방법33. bilayer 조작할 수 있습니다 기계적으로, 액체 정역학 압력 차이34,35으로 구부러진 수 있습니다 기존의 첨 두 부하와는 달리. 지주 압력을 변경 하 여 거품을 확장 하거나 축소, 증가 또는 감소 막 긴장32로 이어지는. bilayer monolayers, 유사한 형태학 연구, 세포 막의 고정-골절 기법36,37 에 기계적으로 분리 하지만, CBB 책략 수 반복 분리 하 고 사이클32 연결에 대 한 . 거품 내 전해질 솔루션의 작은 볼륨 bilayer로 리 채널 재구성의 효율적인 융합 있으며 채널 녹음을 얻기의 확율은 기존의 첨 두 부하 기술 보다 훨씬 높다. 작은 거품 볼륨도 수 (~ 20 ms) 이내 빠른 관류 한번 다른 주입 피펫은 거품 중 하나에 삽입 됩니다. 패치 클램프 방법 달리 즉시 그리고 되풀이 하 여, CBB 막 다시 형성, 일단 하 고 펫 하루에 여러 번 사용할 수 있습니다. 패치 클램프 및 첨 두 부하 방법의 혜택을 통합 하 여는 CBB 제공 하는 막의 물리 화학적 조건을 변경 하는 다양 한 플랫폼 채널 막 상호 작용의 전례 없는 연구에 대 한.
CBB 형성 과정의 상세한 프로토콜을 제시 하기 전에 bilayer 형성의 물리 화학적 배경 막 형성에 관한 실험 어려움을 해결 하기 위해 패치-clampers에 대 한 도움이 될 것입니다 먼저 제시 그는 발생 했습니다.
CBB 실험 표면 화학 과학38의 교훈을 르 친다. CBB는 비누 거품 어디 마찬가지로, 물 거품은 날 려 유기 용 매에는 공중으로 빨 대에서 날 려와 비슷합니다. 한 때 막 지질 물 거품 또는 유기 용 매에 포함 되지 않습니다 물 거품 거의 비정상적 알아차릴 것 이다. Amphipathic 지질의 부재, 물-오일 인터페이스에 표면 장력, 높은 이며 거품 부 대 내 거품 압력 높을 것 이다. 이것은 라플라스 방정식의 실현 (ΔP = 2 γ/R, 어디 ΔP 내부 거품 압력 γ 표면 장력은 이며, R은 거품형 반지름). 유기 단계 또는 전해질 용액에 지질 농도가 높은 경우는 단층에 lipids의 밀도 증가, 깁스 흡착 등온선에 의해 규정 (-dγ = Γ나 dµ나, Γ나 가 표면 초과 화합물의, 그리고 μi 은 부품의 화학 잠재력 i)39, 낮은 표면 장력 및 거품 형성의 용이성. CBB는 bilayer 탄젠트 각도 (그림 2)에서 관찰 될 수 있다 고 단층 bilayer 사이의 접촉 각 측정은. 이 각도 단층의 surface tensions와 bilayer 사이 평형 나타냅니다 (젊은 방정식: γbi = γ모 cos(θ), 어디 γbi bilayer 긴장, γ모 단층 긴장 이며 θ 이다 접촉 각). 단층 긴장에 따른 접촉 각 잠재적인 막의 기능으로 평가 되는 접촉 각의 변화 bilayer 긴장에 있는 변화를 나타냅니다 (영 Lippmann 방정식: γ모 = Cm V2 /4 (cos (θ0)-cos (θv)), 어디 Cm 막 용량, V 막 잠재력, 이며 θ0 θv 는 각각 0과 V mV에서 연락처 각도)40,41 ,42. 두 거품은 충분히 가까이, 그들은 접근 서로 자발적으로. 이것은 반 데르 발스 힘 그리고 우리 시각 CBB 형성에서이 동적 과정을 관찰할 수 있다.
CBB 시스템 가지 고유 단계로 구성 됩니다: 즉, 대량 기름 단계는 단층 및 접촉 bilayer (그림 3)으로 거품을 물. 이들은 여러 단계 첨 두 부하, bilayer 단계와 두 개의 monolayers43,44여 끼여 얇은 유기 단계 용 매 포함 된 토 러 스 등에서 관찰의 연상. CBB에서 단층 단계 bilayer 전단지와 연속 이며 지질 분자 사이는 단층 및 전단지 쉽게 확산. 단층 단계 거품 표면, 지질 저수지 역할 주요 단계 구성의 대부분을 다루고 있습니다. 지질은 단층에서의 소수 성 꼬리 대량 기름 단계에 밖으로 확장, 때문에 bilayer 내부 또는 소수 핵심 대량 기름 단계로 열립니다. 따라서, 소수 성 물질은 bilayer 가까운 석유 단계에 주입 bilayer 인테리어에 쉽게 액세스할 수 있다. 이것은 우리가 개발 했다 최근45, 여는 bilayer의 지질 조성 변경 빠르게 (1 초) 이내 단일 채널 현재 녹음 중 막 관류 기술. 우리는 bilayer에 콜레스테롤 내용 역 켜고45콜레스테롤 관류를 전환 하 여 통제 될 수 발견. 관련 물질의 농도 기온 변화도 연수 효과46, 로 알려져 있는 유포를 통해 즉시 해산 단층 bilayer에 관련 된 물질의 농도 차이가, 그 47. 다른 한편으로는 monolayers에 걸쳐 플립플롭은 느린48,,4950.
CBB 메서드를 사용 하는 bilayer 1 낮은 전해질 pH 등 다양 한 물리 화학적 조건 형성은 51, 3 M까지 (+K, Na+)소금 농도, ±400 mV, 높은 막 잠재력 및 시스템 최대 60 ° c.의 온도
있다는 CBB의 형성에 대 한 몇 가지 옵션 및 채널 분자의 거기에. 물-오일 인터페이스에서 단층의 형성, 대 한 지질 (지질-아웃 방법; 유기 용 매에 추가 됩니다. 그림 4 A, 4 C) 또는 리 (지질에 방법;으로 거품 그림 4 B, 4 D)입니다. 특히, 지질에서 메서드는 비대칭 막15,32의 형성에 대 한 수 있습니다. 채널 단백질으로 재구성 되는 반면 채널 분자 (예를 들어, 채널을 형성 하는 펩 티 드) 수성 해결책에서 녹는 거품 (그림 4A, B)52,53에 직접 추가 리 거품 (그림 4C, D)에 추가 됩니다. 여기, 채널 펩타이드 (polytheonamide B (pTB); 지질 방법에 의해 Cbb의 형성 그림 4 A) 또는 단백질 (KcsA 칼륨 채널, 그림 4C) 표시 됩니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:607px;" width="605">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">Azolectin (L-&#945;-Phosphatidylcholine, Type IV-S)</td>
			<td style="width:85px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">P3644</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:219px;">A/D Converter</td>
			<td style="width:85px;">Molecular Divices</td>
			<td style="width:124px;">Digidata1550A</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">Ag/AgCl electrode</td>
			<td style="width:85px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:124px;">64-1317</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Bath Sonicator</td>
			<td style="width:85px;">Branson</td>
			<td style="width:124px;">M1800H-J</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">Camera</td>
			<td style="width:85px;">Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:124px;">C11440-10C</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:219px;">Glass Capillary</td>
			<td style="width:85px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:124px;">30-0062</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Hepes</td>
			<td style="width:85px;">Dojindo</td>
			<td style="width:124px;">342-01375</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:219px;">Hole Slideglass</td>
			<td style="width:85px;">Matsunami Glass</td>
			<td style="width:124px;">S339929</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Inverted Microscope</td>
			<td style="width:85px;">Olympus</td>
			<td style="width:124px;">IX73</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Isolation Table</td>
			<td style="width:85px;">Herz</td>
			<td style="width:124px;">TDI-86LA(Y)2</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Micro Injenctor</td>
			<td style="width:85px;">Narishige</td>
			<td style="width:124px;">IM-11-2</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Micro Manipulator</td>
			<td style="width:85px;">Narishige</td>
			<td style="width:124px;">EMM</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Microforge</td>
			<td style="width:85px;">Narishige</td>
			<td style="width:124px;">MF-830</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Micropipette holder</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">n-Hexadecane</td>
			<td style="width:85px;">Nacalai</td>
			<td style="width:124px;">07819-32</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Patch-Clamp Amplifier</td>
			<td style="width:85px;">HEKA</td>
			<td style="width:124px;">EPC800</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">Pipette Puller</td>
			<td style="width:85px;">Sutter Instrument Co.</td>
			<td style="width:124px;">P-87</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine)</td>
			<td style="width:85px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:124px;">850457</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:219px;">POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine 
			)</td>
			<td style="width:85px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:124px;">850757</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">POPG (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) )</td>
			<td style="width:85px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:124px;">840457</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:85px;">Nacalai</td>
			<td style="width:124px;">28514-75</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Rotary Evapolator</td>
			<td style="width:85px;">Iwaki</td>
			<td style="width:124px;">REN-1000</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Succinic Acid</td>
			<td style="width:85px;">Nacalai</td>
			<td style="width:124px;">32402-05</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Vacuum Pump</td>
			<td style="width:85px;">Buchi</td>
			<td style="width:124px;">V-100</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lipid bilayer experiments with contact bubble bilayers for patch-clampers

지질 bilayers 수 있도록 다양 한 멤브레인에서 채널 막 상호 작용의 시험 지질 구성 하는 이온 채널의 기능 연구에 대 한 독특한 실험 플랫폼을 제공 합니다. 그 중 물방울 인터페이스 bilayer; 인기를 얻고 있다 그러나, 큰 막 크기 낮은 전기 잡음의 녹음 방해. 우리는 평면 지질 bilayer의 이점을 결합 하는 연락처 거품 bilayer (CBB) 메서드 및 패치 클램프 방법, 지질 구성 변경 하 고 각각 bilayer 기계를 조작 하는 등 설립. 기존의 패치 클램프 실험에 대 한 설치 프로그램을 사용 하 여, CBB 기반 실험 수 쉽게 수행. 간단히, 유리 피 펫에서 전해질 솔루션 단계로 유기 용 매 (hexadecane), 날 려 및 피 펫 압력은 안정 되어 있는 거품 크기를 유지 하 고 있다. 거품은 거품에 리에서 제공 되는 지질 단층 (순수 지질 또는 혼합된 지질), 자발적으로 늘어서 있다. 다음, 두 개의 단층 늘어선 거품 (~ 50 µ m 직경에서) 유리 펫의 팁에서 bilayer 형성에 대 한 도킹 됩니다. 거품으로 채널 재구성 리의 소개 채널 신호 대 잡음 비율 단일 채널 현재 녹음 패치 클램프 기록의 비교를 허용 하는 bilayer의 이끌어 낸다. Cbb는 비대칭 지질 성분과 쉽게 형성 된다. CBB는 이전 거품 밖으로 하 고 새로운 것 들을 형성 하 여 반복적으로 갱신 됩니다. 다양 한 화학 및 물리적 섭 (예를 들어, 막 관류와 bilayer 긴장) Cbb 여기에 부과 될 수 있습니다, 그리고 선물이 CBB 형성에 대 한 기본 절차.

전형적인 CBB (그림 56) 50 µ m의 직경 졌고 hexadecane에 특정 막 커패시턴스 0.65 μ F/c m2했다. 거품 크기는 임의로 내부 거품 압력에 의해 제어 됩니다. 작은 거품은 저 잡음 기록에 필요한 팁 직경 대응 하 게 작은 되어야 합니다. 예를 들어 직경에서 50 µ m의 거품 크기, 팁 직경 30 µ m 이어야 합니다.
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Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers

여기, 선물이 연락처 거품 bilayer 메서드를 사용 하 여 지질 bilayers의 대형을 위한 프로토콜. 물 거품 물-오일 인터페이스에는 단층은 형성 하는 그것에 의하여, 유기 용 매에 불어 진다. 두 펫은 bilayer를 형성 하기 위하여 거품을 도킹 하려면 조작 됩니다.

패치-Clampers에 대 한 연락처 거품 Bilayers 지질 Bilayer 실험

Lipid bilayers provide a unique experimental platform for functional studies of ion channels, allowing the examination of channel-membrane interactions ...

접촉 버블 Bilayer 방법은 기존의 지질 양층에 대한 대체 기술이다. 이 방법을 사용하면 멤브레인을 통해 보다 다재다능한 진동이 가능합니다. CBB 방법은 Planar 지질 Bilayer 및 패치 클램프 방법의 이점을 통합합니다.지질 이중층 기술로임의 지질 조성물을 가진 CBB가 형성될 수 있다. 신호 대 노이즈 비율이 높은 단일 채널 전류 녹음을 위한 CBB를 개발했습니다. 이 방법은 다양한 멤브레인 진동을 허용하고 채널 멤브레인 인터페이스에 대한 방대한 유형 플랫폼을 제공합니다.모두가 비누 거품을 불고 경험했다. 입으로 불어오는 대신 가해지는 압력을 수동으로 미세 조정하여 CBB 형성을 위해 유사한 기동을 수행합니다. 연습과 CBB를 즐길 수 있습니다.이 절차가 되는 것은 둥근 바닥 플라스크에서 원하는 농도에서 클로로포름에 인지질을 분산시한다. 질소 가스 실린더에 연결된 회전 증발기에 인지질 용액을 놓습니다. 얇은 인지질 필름이 나타날 때까지 실온에서 질소 흐름 하에서 플라스크를 회전시다.다음으로 열린 플라스크를 진공 펌프에 연결된 데시카이터에 넣습니다. 진공 펌프를 사용하여 건조기 의 내부를 몇 시간 동안 흡인하여 클로로포형을 완전히 제거합니다. 이어서 플라스크에 적절한 양의 전해질 용액을 추가하고 인지질을 일시 중단하여 밀리리터 인지질 현탁액당 2밀리그마스를 얻습니다.목욕 초음파 처리기를 사용하여 20~ 30초 동안 서스펜션을 손시아테하여 다층 소포 서스펜션을 얻습니다. 이온 채널 단백질을 함유한 프로테올리포좀의 제조를 위해 다층 소포 현탁액에 단백질 용액을 추가합니다. 그리고 목욕 초음파 를 사용하여 몇 초 동안 초음파 처리합니다.큰 보어 유리 파이펫을 준비하려면 유리 모세관을 파이펫 풀러에 넣고 미세 한 테이퍼 팁으로 마이크로 피펫을 2 단계 당기는 것으로 조작합니다. 그런 다음 마이크로 단조에 마이크로 파이프를 설정하고 직경 30 ~ 50 마이크로 미터의 테이퍼 부분에 백금 필라멘트마이크로 마이크로 파이펫의 끝을 접촉. 필라멘트를 짧게 가열하고 즉시 끕니다.증류수와 에탄올을 사용하여 유리 슬라이드의 표면을 얕은 우물로 청소합니다. 다음으로 실리콘 화시약을 유리 슬라이드에 바르고 시약이 완전히 공기 중으로 건조하게 합니다. 그런 다음 반전 된 현미경의 무대에 유리 슬라이드를 놓습니다.실리콘 유리 슬라이드의 얕은 우물에 육사데카인 100 마이크로리터를 추가합니다. 결핵 주사기를 사용하여 마이크로 피펫의 절반 길이까지 전해질 용액을 채웁니다. 다음으로 압력 포트를 사용하여 마이크로 피펫 홀더에 마이크로 파이펫을 설치하여 은/은 염화물 와이어 전극이 파이펫 전해질 용액에 담글 수 있도록 합니다.마이크로파이펫 홀더 중 하나를 패치 클램프 증폭기의 헤드 스테이지에 연결하고 다른 하나는 전기 접지에 연결합니다. 그런 후 마이크로피펫 홀더의 압력 포트에 마이크로인젝터를 연결합니다. 마이크로 피펫을 현미경 조작기를 사용하여 반전된 현미경의 단계 위에 적절한 위치로 조정합니다.전극 오프셋 전위를 조정하려면 유리 슬라이드의 얕은 우물 주위의 평평한 표면에 마이크로 피펫을 채우는 데 사용되는 동일한 전해질 용액의 마이크로리터 1개를 배치하여 전해질 돔을 만듭니다. 전해질 돔에 두 마이크로파이펫의 끝을 담급니다. 그런 다음 패치 클램프 증폭기의 전극 오프셋 전위를 조정합니다.팁에서 리포솜 용액을 그리려면 슬라이드 유리의 얕은 우물 주위의 평평한 표면에 리포솜 용액 1 마이크로리터를 추가합니다. 다음으로 마이크로피펫 끝을 돔이 들어 있는 리포솜에 넣습니다. 마이크로 인젝터를 사용하여 리포솜 함유 용액을 흡인.다른 미르코피펫에 대한 절차를 반복하여 재구성된 리포솜을 증분하는 채널을 습살합니다. 이제 얕은 우물에 육사데칸에 마이크로 피펫의 배치. 거품이 원하는 크기에 도달할 때까지 압력을 증가시켜 천천히 물 거품을 날려 그 후 동일한 압력을 유지하십시오.거품의 크기를 안정적으로 유지하기 어려운 경우 오일 에어 인터페이스를 통해 팁을 전달하여 거품을 폐기하십시오. 두 개의 안정적인 기포가 형성될 때까지 절차를 반복합니다. 두 거품 사이의 접촉을 설정합니다.일정한 거품 압력에서도 크기가 점진적으로 변할 수 있기 때문에 거품 크기를 유지하기 위해 압력을 미세 조정합니다. 패치 클레임 증폭기를 사용하여 멤브레인 잠재력을 적절한 값으로 설정하고 채널 전류가 나타날 때까지 기다립니다. 안정적인 지질 이중 층 형성을 위해 블로터를 청소하는 것이 필수적입니다.유리 모세관 또는 파이펫 제제는 철저히 세척되어야하며 세제 분자에 의한 오염을 피해야합니다. 일단 CBB는 수성 용액또는 리포솜에서 채널 분자를 형성하면 자발적으로 수십 분의 범위 내에서 이중 층으로 삽입되었다. 채널의 삽입은 적용된 멤브레인 전위 하에서 현재 진폭의 단계 현명한 증가에 의해 확인되었다.CBB 방법에 의해 형성된 이중층은 두 개의 단층으로 분해될 수 있다. pTB 채널 전류는 두 개의 단층층을 부착한 직후 나타났다. 그리고 전류가 커지면서 전류의 진폭이 증가하여 CBB의 분리 부착 조작과 동기화되었다.기포의 수가 불어나면 수성 용액의 지질 농도가 감소하고 단층이 형성되지 않는다. 그런 다음 리포솜 섹션에 대한 압력을 완화하십시오. 일단 CBB 형성 및 채널 재구성이 확립되면 증혈또는 소수성 물질을 주입하거나 주입을 통해 수성 용액 및 막의 조성물을 변화시키려고 시도할 수 있습니다.CBB 방법은 채널 멤브레인 상호 연극을 탐구하는 다양한 방법을 열었습니다.

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Unit 1

Channels and the Electrical Properties of Membranes

SCIENTISTS IN ACTION

Functional Mapping with Simultaneous MEG and EEG

동시 MEG와 EEG와 기능 매핑

We use magnetoencephalography (MEG) and electroencephalography (EEG) to locate and determine the temporal evolution in brain areas involved in the ...

연구

신경과학

Combining Computer Game-Based Behavioural Experiments With High-Density EEG and Infrared Gaze Tracking

결합 컴퓨터 게임 기반 고밀도 뇌파와 적외선 가즈 추적 Behavioural 실험

Experimental paradigms are valuable insofar as the timing and other parameters of their stimuli are well specified and controlled, and insofar as they ...

Examining Local Network Processing using Multi-contact Laminar Electrode Recording

사용하는 로컬 네트워크 처리를 검토 멀티 연락처 판상 전극 기록

Cortical layers are ubiquitous structures throughout neocortex1-4 that consist of highly recurrent local networks. In recent years, significant progress ...

Closed-loop Neuro-robotic Experiments to Test Computational Properties of Neuronal Networks

폐쇄 루프 신경 로봇 실험은 신경 네트워크의 전산 등록을 테스트하는

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation ...

SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy

편광 TIRF 현미경에 의해 감시 미세 유동 흐름 전지에 닿는 지원 이중층 단일 테오의 SNARE 매개 퓨전

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. ...

Fabrication of High Contact-Density, Flat-Interface Nerve Electrodes for Recording and Stimulation Applications

녹화 및 자극 애플리케이션을위한 높은 접촉 밀도의 제작, 평면 인터페이스 신경 전극

Many attempts have been made to manufacture multi-contact nerve cuff electrodes that are safe, robust and reliable for long term neuroprosthetic ...

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Ex Vivo 실험 이미징에 대 한 성인 제 브라에서 준비 신선한 망막 조각

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding ...

Conducting Hyperscanning Experiments with Functional Near-Infrared Spectroscopy

Hyperscanning 기능성 근 적외선 분광학 실험 실시

Concurrent brain recordings of two or more interacting persons, an approach termed hyperscanning, are gaining increasing importance for our understanding ...

Using Neuron Spiking Activity to Trigger Closed-Loop Stimuli in Neurophysiological Experiments

신경 생리학적 실험에서 신경 스파이크 활동을 사용하여 폐쇄 루프 자극을 트리거합니다.

Closed-loop neurophysiological systems use patterns of neuronal activity to trigger stimuli, which in turn affect brain activity. Such closed-loop systems ...

Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments

공동 문화 실험을 위한 올리고엔드로시테 및 올리고엔드로시테-컨디셔닝 배지 생성

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials ...