Name: lipid bilayer experiments with contact bubble bilayers for patch-clampers
Uploaded: 2019-01-16T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers at JoVE.com

Forfatterne vil takke Mariko Yamatake og Masako Takashima for teknisk assistanse. Dette arbeidet var støttes delvis av KAKENHI gi nummer 16H 00759 og 17 H 04017 (SO).

1. klargjør liposomer
<ol><li>Spre fosfolipider (f.eks, 10 mg i pulver) i kloroform i en ønsket konsentrasjon (f.eks, 10 mg/mL).</li>
	<li>Fordampe kloroform.<ol>
<li>Sted phospholipid løsningen i en runde bunn kolbe og setter den på en roterende fordamperen (se Tabell for materiale) koblet til en N2 gass-sylinder. Rotere kolbe under N2 flyt ved romtemperatur til en tynn phospholipid film vises (etter ~ 30 min).</li>
		<li>Plass åpne flasken i en desiccator ...

CBB metoden av lipid bilayer formasjon er basert på prinsippet om en vann-i-olje dråpe omgitt av en monolayer20. Teknisk, prosedyrene for å danne CBBs er enkel, spesielt for patch-klemme forskere, som er dyktige i å manipulere glass Mikropipetter. Elektrofysiologiske oppsettet for oppdateringen klemmen brukes lett CBB når to pipette manipulators med microinjectors er tilgjengelige. På den annen side, fordi CBB er en etterfølger av den konvensjonelle PLB, som mye mekanisk-kunnskap er akkumul...

Ionekanaler er cellemembranen ikke bare en støtte materiale, men en partner for å generere ion fluks. Funksjonelt, membranen er en elektrisk isolator i som ion kanaler er innebygd, og alle cellemembraner formidles med en hvile membran potensial. Konvensjonelt, ble en vilkårlig membran potensial innført fra en ekstern krets som elektrisk strøm gjennom kanaler ble målt. Dette kvantitativ vurdering av ion fluks på ulike membran potensialer avslørte molekylær egenskapene til disse kanalene, som deres ion-selektiv gjennomtrengning og gating funksjoner1,2. Membran plattformen for funksjonell studier av ionekanaler er cellen membran eller lipid bilayer membranen. Historisk enkanals elektrisk gjeldende innspillinger ble først fremført i lipid bilayers3,4, og relevante teknikker ble utviklet for celle membraner, som metoden patch-klemme (figur 1A )5,6. Siden da disse to teknikker har utviklet seg separat for ulike formål (figur 1)7,8.
Membran lipider og bilayer membraner er fokus for forskning for sine roller i å støtte struktur og funksjon av kanalen proteiner. Derfor er klar tilgjengeligheten av metoder å variere lipid sammensetningen i bilayers i høy etterspørsel. Lipid bilayer formasjon metoder som planar lipid bilayer (PLB)8,9,10,11, vann-i-olje dråpe bilayer12og slippverktøy grensesnittet bilayer (DIB)13, 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 teknikker (figur 1) er vanlig valg, gir en mulighet for å undersøke funksjonen kanalen under varierende lipid komposisjoner20. Tross av DIB er teknisk lettere å produsere enn den konvensjonelle PLB, den store størrelsen på DIB har skapt en disincentive for patch-clampers å bruke den for å studere enkanals gjeldende opptak med vanlig størrelse konduktans (< 100 hk).
For å omgå bakgrunnsstøy, minimeres bilayer området. Dette problemet minnes repetisjoner historie i utvikle elektrofysiologiske teknikker for lipid bilayers (figur 1). I begynnelsen, ble et lite bilayer (1-30 µm i diameter) dannet på spissen av en pipette (tips-dip-metoden. Figur 1 C) 21 , 22 , 23, snarere enn benytter en frittstående bilayer (~ 100 µm i diameter) på en hydrofobe septum i et kammer (figur 1B). Tips-dip metoden tillatt for elektriske målinger med mye lavere bakgrunn støy24. Våre erfaringer med PLB25,26, tips-dip22,23,27og patch-klemme28,29,30, 31 metoder ledet oss til en ny idé å danne lipid bilayers ved hjelp av prinsippene for vann-i-olje-bilayer. Vi har referert til dette som kontakt boble bilayer (CBB) metoden20,32. I denne metoden henger vanndråpene i en olje fase (figur 1D), en vann boble er blåst fra en glass pipette (med tuppens diameter på ca 30 µm) i olje fasen (figur 1E og 2), hvor den boble vedlikeholdes ved å bruke en jevn trykk. En monolayer former spontant på vann-olje grensesnittet på overflaten av boble. Deretter to bobler forankres gjennom manipulering av to glass Pipetter og bilayer er dannet som de to monolayers nærme hverandre, gir en likevekt bilayer området. Størrelsen på boblen styres av intra-boble trykket (holder press), og likeledes bilayer størrelsen. En gjennomsnittlig diameter på 50 µm brukes ofte. Selv om volumet av boblen er liten (< 100 pL), den er koblet til større volumet av pipette løsning i mikroliter området, utgjør elektrolytt bulklading.
Det er mange fordeler med å bruke metoden CBB (tabell 1). Som en lipid bilayer formasjon teknikk, membraner av ulike lipid komposisjoner kan produseres, og asymmetriske membraner er lettere dannet32 enn de av de konvensjonelle folding metode33. Bilayer kan være mekanisk manipulert, i motsetning til konvensjonelle PLB som kan bare være bøyd med en hydrostatisk trykk forskjellen34,35. Endrer holde trykket, bobler enten utvides eller krymper, fører til økt eller redusert membran spenning32. Bilayer er mekanisk avtakbar i monolayers, ligner på fryse-brudd teknikk36,37 av membraner i morfologiske studier, men med CBB, en manøver tillater for gjentatte koble fra og koble sykluser32 . Liten volumet av electrolyte løsning i boble kan effektiv blanding av kanal-rekonstituert liposomer i bilayer, og sannsynligheten for å få kanalen opptak er mye høyere enn med konvensjonelle PLB teknikken. Liten boble volumet kan også rask perfusjon (innen ~ 20 ms) når en annen injeksjon pipette settes inn i en av bobler. I motsetning til metoden patch-klemme når brutt, en CBB membran dannes re umiddelbart og gjentatte ganger, og Pipetter kan brukes flere ganger om dagen. Ved å integrere fordeler av oppdateringen-klemme og PLB metodene, gir CBB en allsidig plattform for å variere mekanisk-betingelsene av membranen, slik at for enestående studier av kanal-membran interaksjoner.
Før presentere detaljert protokollen CBB formasjon prosessen, er mekanisk-bakgrunn av bilayer dannelsen presentert første, som vil være nyttig for patch-clampers å løse eksperimentelle problemer knyttet til membran dannelse som er oppstått.
CBB eksperimenter formidle lærdom overflatekjemi vitenskap38. CBB ligner en såpeboble blåst fra et strå i luften, der likeledes en vann boble er blåst inn en organisk løsemiddel. En vil merke at en vann boble er neppe oppblåst når membran lipider ikke inkluderes i vann boble eller organisk løsemiddel. I fravær av amphipathic lipider, overflatespenning på en vann-olje-grensesnitt er høy og intra-boble presset til å blåse en boble vil være høy. Dette er en realisering av Laplace likning (ΔP = 2 γ/R, der ΔP er intra-boble trykket γ er overflatespenningen og R er radius boble). Når konsentrasjonen av lipider i organisk fasen eller elektrolytt-løsning er høy, tetthet av lipider i monolayer øker, så diktert av Gibbs adsorpsjon isotherm (-dγ = Γjeg dµjeg, hvor Γjeg er overflate overflødig sammensatte jeg, og µjeg er den kjemiske potensialet av komponenten jeg)39, fører til en lavere overflatespenning og brukervennlighet boble formasjon. CBB, bilayer kan observeres fra en tangentiell vinkel (figur 2) og kontakt vinkelen mellom monolayer og bilayer er målbare. Denne vinkelen representerer en likevekt mellom surface tensions av monolayer og bilayer (unge ligningen: γbi = γmo cos(θ), der den blebi er bilayer spenningen γmo er monolayer spenningen og θ er kontakt vinkelen). Endringene i kontakt vinkel angir endringer i bilayer spenningen, gitt at monolayer spenningen vurderes av endringer i kontakt vinkelen som en funksjon av membran potensial (Young-Lippmann ligningen: γmo = Cm V2 /4 (cos (θ0) - cos (θv)), der Cm er membran kapasitans, V er membran potensial og θ0 og θv er kontakt vinkler på 0 og V mV, henholdsvis)40,41 ,42. Når to bobler er nær nok, tilnærming de andre spontant. Dette skyldes van der Waals kraft, og vi kan visuelt observere denne dynamiske prosessen i CBB formasjonen.
En CBB system består av forskjellige faser: nemlig en bulk olje fasen, vann bobler belagt med en monolayer og en kontakte bilayer (Figur 3). Dette er minner om flere faser i en PLB, for eksempel en løsemiddel inneholder torus rundt bilayer fasen og en tynn organisk fase klemt av to monolayers43,44. CBB, monolayer fasen går bilayer brosjyren og lipid molekyler diffus lett mellom monolayer og heftet. Monolayer fasen dekker det meste av boble overflaten, utgjør den viktigste fasen som fungerer som en lipid-reservoaret. Fordi hydrofobe halen av lipider i monolayer strekker seg utover til olje bulklading, åpnes bilayer interiøret eller hydrofobe kjernen til olje bulklading. Dermed er en hydrofobe stoffet injiseres olje fasen nær bilayer lett tilgang bilayer interiøret. Dette er membran perfusjon teknikken vi hadde nylig utviklet45, som lipid sammensetningen i bilayer endres raskt (innen andre) under én kanal gjeldende innspillinger. Vi fant at kolesterol innholdet i bilayer reversibel kan kontrolleres ved å bytte kolesterol perfusjon og på45. Som konsentrasjonen av aktuelle stoffet i monolayer og bilayer er forskjellig, oppløses konsentrasjon gradient av aktuelle stoffet umiddelbart gjennom diffusjon, som er kjent som Marangoni effekt46, 47. derimot, flip-flops over monolayers er treg48,49,50.
Med metoden CBB bilayer er dannet under allsidig mekanisk-forhold, som en elektrolytt pH så lavt som 1 51, en salt (K+Na+, osv.) konsentrasjon til 3 M, en membran potensial så høyt som ±400 mV og et system temperaturen på opp til 60 ° C.
Det finnes flere alternativer for dannelsen av CBB og innlemmelse av kanalen molekyler deri. For dannelsen av monolayer på vann-olje grensesnittet legges lipider i en organisk løsemiddel (lipid-out-metoden. Figur 4 A, 4 C) eller boblediagrammer som liposomer (lipid-i metoden. Figur 4 B, 4 D). Spesielt tillater metoden lipid-i dannelse av asymmetrisk membraner15,32. Kanal molekyler løselig i vandig løsning (f.eks, kanal-forming peptider) legges direkte inn i boble (Figur 4A, B)52,53, mens kanalen proteiner er rekonstituert til liposomer, som legges deretter inn boble (Figur 4C, D). Her, dannelsen av CBBs av lipid-i metoden for enten en kanal peptid (polytheonamide B (pTB); Figur 4 A) eller et protein (KcsA kalium kanal, Figur 4C) vises.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:607px;" width="605">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">Azolectin (L-&#945;-Phosphatidylcholine, Type IV-S)</td>
			<td style="width:85px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">P3644</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:219px;">A/D Converter</td>
			<td style="width:85px;">Molecular Divices</td>
			<td style="width:124px;">Digidata1550A</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">Ag/AgCl electrode</td>
			<td style="width:85px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:124px;">64-1317</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Bath Sonicator</td>
			<td style="width:85px;">Branson</td>
			<td style="width:124px;">M1800H-J</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">Camera</td>
			<td style="width:85px;">Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:124px;">C11440-10C</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:219px;">Glass Capillary</td>
			<td style="width:85px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:124px;">30-0062</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Hepes</td>
			<td style="width:85px;">Dojindo</td>
			<td style="width:124px;">342-01375</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:219px;">Hole Slideglass</td>
			<td style="width:85px;">Matsunami Glass</td>
			<td style="width:124px;">S339929</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Inverted Microscope</td>
			<td style="width:85px;">Olympus</td>
			<td style="width:124px;">IX73</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Isolation Table</td>
			<td style="width:85px;">Herz</td>
			<td style="width:124px;">TDI-86LA(Y)2</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Micro Injenctor</td>
			<td style="width:85px;">Narishige</td>
			<td style="width:124px;">IM-11-2</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Micro Manipulator</td>
			<td style="width:85px;">Narishige</td>
			<td style="width:124px;">EMM</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Microforge</td>
			<td style="width:85px;">Narishige</td>
			<td style="width:124px;">MF-830</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Micropipette holder</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">n-Hexadecane</td>
			<td style="width:85px;">Nacalai</td>
			<td style="width:124px;">07819-32</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Patch-Clamp Amplifier</td>
			<td style="width:85px;">HEKA</td>
			<td style="width:124px;">EPC800</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">Pipette Puller</td>
			<td style="width:85px;">Sutter Instrument Co.</td>
			<td style="width:124px;">P-87</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine)</td>
			<td style="width:85px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:124px;">850457</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:219px;">POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine 
			)</td>
			<td style="width:85px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:124px;">850757</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">POPG (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) )</td>
			<td style="width:85px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:124px;">840457</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:85px;">Nacalai</td>
			<td style="width:124px;">28514-75</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Rotary Evapolator</td>
			<td style="width:85px;">Iwaki</td>
			<td style="width:124px;">REN-1000</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Succinic Acid</td>
			<td style="width:85px;">Nacalai</td>
			<td style="width:124px;">32402-05</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Vacuum Pump</td>
			<td style="width:85px;">Buchi</td>
			<td style="width:124px;">V-100</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lipid bilayer experiments with contact bubble bilayers for patch-clampers

Lipid bilayers gir en unik eksperimentelle plattform for funksjonell studier av ionekanaler, som tillater undersøkelse av kanal-membran interaksjoner under ulike membran lipid komposisjoner. Blant dem, har slippverktøy grensesnittet bilayer vunnet popularitet; men hindrer stort membran størrelsen innspillingen av lav elektrisk bakgrunnsstøy. Vi har etablert en kontakt boble bilayer (CBB) metode som kombinerer fordelene med planar lipid bilayer og patch-klemme metoder, for eksempel muligheten til å variere lipid sammensetningen og manipulere bilayer mekanikk, henholdsvis. Bruker oppsettet for konvensjonelle patch-klemme eksperimenter, kan CBB-baserte eksperimenter lett utføres. I korte trekk, en elektrolytt-løsning i en glass pipette er blåst inn i en organisk løsemiddel fase (hexadecane), og pipette trykket opprettholdes for å få en stabil boblestørrelse. Boblen er spontant foret med en lipid monolayer (ren lipider eller blandet lipider), som tilbys fra liposomer i bobler. Deretter forankres to monolayer-lined bobler (~ 50 µm i diameter) på spissen av glass Pipetter for bilayer-formasjonen. Innføring av kanal-rekonstituert liposomer i boblen fører til inkorporering av kanaler i bilayer, tillater én kanal stemmeopptaket med signal-til-støy forholdet sammenlignes med patch-klemme innspillinger. CBBs med en asymmetrisk lipid sammensetning dannes lett. CBB er fornyet gjentatte ganger av blåser ut tidligere bobler og danner nye. Ulike kjemiske og fysiske forstyrrelser (f.eks, membran perfusjon og bilayer spenning) kan bli pålagt CBBs. Herein, presenterer vi den grunnleggende prosedyren for CBB formasjon.

En typisk CBB hadde en diameter på 50 µm (figur 56) og bestemte membran kapasitans i hexadecane var 0,65 µF/cm2. Boblestørrelsen var tilfeldig kontrollert av intra-boble trykket. Når små bobler er nødvendig for støyfri opptak, skal tuppens diameter være tilsvarende liten. For eksempel for en boblestørrelse på 50 µm i diameter, bør tuppens diameter være 30 µm.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="...

Watch this Scientific Journal Video about Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers at JoVE.com

Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers

Her presenterer vi en protokoll for dannelsen av lipid bilayers med en kontakt boble bilayer metode. En vann boble er blåst inn en organisk løsemiddel, der et monolayer er dannet på vann-olje grensesnittet. To Pipetter manipulert for å forankre bobler å danne en bilayer.

Lipid Bilayer eksperimenter med kontakt boble Bilayers for oppdateringen-Clampers

Lipid bilayers provide a unique experimental platform for functional studies of ion channels, allowing the examination of channel-membrane interactions ...

Contact Bubble Bilayer-metoden er en alternativ teknikk for konvensjonelle Lipid Bilayers. og denne metoden gir mer allsidig vibrasjon gjennom membranen. CBB-metoden integrerer fordelene med Planar Lipid Bilayer og patch clamp-metoden.Som en lipid bilayer teknikk kan en CBB med en vilkårlig lipidsammensetning dannes. Vi har utviklet en CBB for enkeltkanalsstrømopptak med høyt signal-til-støy-forhold. Denne metoden tillater varianter av membran vibrasjoner og tilbyr en stor type plattform til kanalmembrangrensesnittet.Alle har opplevd å blåse en såpeboble. Lignende manøvrer tas for CBB-dannelse ved å finjustere det påførte trykket manuelt i stedet for å blåse gjennom munnen. Øv og nyt CBB.For å være denne prosedyren spre fosfolipider i kloroform ved ønsket konsentrasjon i en rund bunnkolbe. Plasser fosfolippidløsningen på en roterende fordamper som er koblet til en nitrogengassflaske. Roter kolben under nitrogenstrømmen ved romtemperatur til en tynn fosfolipdfilm vises.Deretter plasserer du den åpne kolben i en desiccator som er koblet til en vakuumpumpe. Bruk vakuumpumpen til å aspirere innsiden av desiccatoren i flere timer for å fjerne kloroformen grundig. Deretter legger du til et passende volum elektrolyttoppløsning i kolben og suspendere fosfolippid for å oppnå to milligrmer per milliliter fosfolipd suspensjon.Sonciate suspensjonen i 20 til 30 sekunder ved hjelp av en bad sonicator for å få en flerlags vesikkel suspensjon. For fremstilling av proteoliposomer som inneholder iionkanalproteiner, legg til en proteinløsning til flerlags vesikkelfjæring. Og sonicate i flere sekunder ved hjelp av bad sonicator.For å forberede store glasspipetter, legg en glasskapillær i en pipettetrekker og dikter mikropipetten med en fin konisk spiss gjennom to trinns trekking. Sett deretter mikropipetten på en mikro smie og kontakt spissen av mikropipetten til en platinafilament ved den koniske delen med en diameter på 30 til 50 mikrometer. Varm filamentet kort og slå den umiddelbart av.Bruk destillert vann og etanol rengjør overflaten av glasssklien med en grunn brønn. Deretter påfør silikoniseringsreagensen på glasssklie og la reagensen tørke helt i luften. Plasser deretter glasssklie på scenen av et omvendt mikroskop.Tilsett 100 mikroliter heksadekan i den grunne brønnen på den silikoniserte glasslysbildet. Bruk en tuberkulinsprøyte til å fylle elektrolyttoppløsningen opptil halvparten av mikropipetten. Sett deretter mikropipetten på mikropipetteholderen med trykkporten, slik at sølv/sølvkloridtrådelektroden kan suge i pipetteelektrolyttløsningen.Koble en av mikropipetteholderne til hodestadiet på en patch clamp forsterker og den andre til den elektriske bakken. Koble deretter en mikroinjektor til trykkporten på mikropipetteholderen. Juster mikropipetten til en passende posisjon over scenen på et omvendt mikroskop ved hjelp av mikromanipulatoren.For å justere potensialet for elektrodeforskyvning plasserer du én mikroliter av samme elektrolyttløsning som brukes til å fylle mikropipetten på den flate overflaten rundt den grunne brønnen på glasslysbildet for å skape en elektrolyttkuppel. Bløtlegg spissen av begge mikropipettene i elektrolyttkuppelen. Juster deretter elektrodeforskyvningspotensialet til patchklemmeforsterkeren.For å trekke liposometoppløsningen fra spissen, legg til en mikroliter liposomløsning på den flate overflaten rundt den grunne brønnen på lysbildeglasset. Deretter plasserer du spissen av mikropipetten i liposomet som inneholder kuppel. Aspirer liposomet som inneholder oppløsning ved hjelp av mikroinjektoren.Gjenta prosedyren for den andre mircopipette for aspirering kanal rekonstituerte liposomer. Plasser nå mikropipetten i heksadekanen i den grunne brønnen. Blås en vannboble sakte ved å øke trykket til boblen når ønsket størrelse og opprettholder det samme trykket deretter.Kast boblen ved å sende spissen gjennom oljeluftgrensesnittet hvis det er vanskelig å holde størrelsen på boblen stabil. Gjenta prosedyrene til to stabile bobler dannes. Etablere en kontakt mellom de to boblene.Finjuster trykket for å opprettholde boblestørrelsen, fordi størrelsen gradvis kan endres selv ved konstant intrabobletrykk. Sett membranpotensialet til riktig verdi ved hjelp av patch-kravforsterkeren og vent til kanalstrømmen skal dukke opp. For stabil lipid bilayer formasjon er det viktig å rengjøre blotters.Glasskapillær eller pipettepreparat bør vaskes grundig og unngå kontaminering av vaskemiddelmolekylene. Når CBB hadde dannet kanalmolekylene enten i vandig løsning eller i liposomet ble spontant satt inn i bilayer i løpet av noen få til dusinvis av minutter. Innsettinger av kanalene ble bekreftet av den trinnvise kloke økningen av nåværende amplitude under det påførte membranpotensialet.En bilayer dannet av CBB-metoden kan gå i oppløsning i to monolag. PTB-kanalstrømmen dukket opp umiddelbart etter at de to monolagene ble festet. Og strømmen ble større som er av kontakt økt amplituden av strømmen ble synkronisert med løsne feste manipulasjon av CBB.Hvis antallet utblåsninger av bobler øker lipidkonsentrasjonen i vandig oppløsning minker og monolayeren ikke dannes. Prøv deretter å lindre trykket på liposomet seksjon. Når CBB-formasjonen og kanalrekonstitueringen er etablert, kan du prøve å variere sammensetningene av vandig oppløsning og membran via overflod eller injisere hydrofile eller hydrofobe stoffer.CBB-metoden har åpnet allsidige måter å utforske kanalmembrans samspill på.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Neuroscience

Unit 1

Channels and the Electrical Properties of Membranes

SCIENTISTS IN ACTION

Functional Mapping with Simultaneous MEG and EEG

We use magnetoencephalography (MEG) and electroencephalography (EEG) to locate and determine the temporal evolution in brain areas involved in the ...

Combining Computer Game-Based Behavioural Experiments With High-Density EEG and Infrared Gaze Tracking

Experimental paradigms are valuable insofar as the timing and other parameters of their stimuli are well specified and controlled, and insofar as they ...

Examining Local Network Processing using Multi-contact Laminar Electrode Recording

Cortical layers are ubiquitous structures throughout neocortex1-4 that consist of highly recurrent local networks. In recent years, significant progress ...

Closed-loop Neuro-robotic Experiments to Test Computational Properties of Neuronal Networks

Lukket-sløyfe Neuro-robot eksperimenter for å teste Computational Egenskaper av nevrale nettverk

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation ...

SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy

SNARE-mediert Fusion Single Proteoliposomes med tethered Støttede bilagene i en mikrofluid Flow Cell overvåkes av polarisert TIRF Mikroskopi

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. ...

Fabrication of High Contact-Density, Flat-Interface Nerve Electrodes for Recording and Stimulation Applications

Fabrikasjon av High Kontakt-Density, Flatskjerm-Interface Nerve Elektroder for innspilling og stimulering Applications

Many attempts have been made to manufacture multi-contact nerve cuff electrodes that are safe, robust and reliable for long term neuroprosthetic ...

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Forberede frisk Retinal skiver fra voksne sebrafisk for Ex Vivo Imaging eksperimenter

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding ...

Conducting Hyperscanning Experiments with Functional Near-Infrared Spectroscopy

Gjennomføre Hyperscanning eksperimenter med funksjonell nær infrarød spektroskopi

Concurrent brain recordings of two or more interacting persons, an approach termed hyperscanning, are gaining increasing importance for our understanding ...

Using Neuron Spiking Activity to Trigger Closed-Loop Stimuli in Neurophysiological Experiments

Bruke Nevron skyter aktivitet å utløse lukket loop stimuli i nevrofysiologiske eksperimenter

Closed-loop neurophysiological systems use patterns of neuronal activity to trigger stimuli, which in turn affect brain activity. Such closed-loop systems ...

Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments

Generasjon oligodendrocytes og oligodendrocyte-conditioned medium for co-kultur eksperimenter

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials ...