Name: lipid bilayer experiments with contact bubble bilayers for patch-clampers
Uploaded: 2019-01-16T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers at JoVE.com

Os autores gostaria de agradecer Mariko Yamatake e Masako Takashima para assistência técnica. Este trabalho foi financiado em parte por KAKENHI concessão números 16H 00759 e 17 H 04017 (SO).

1. prepare os lipossomas
<ol><li>Disperse os fosfolípidos (por exemplo, 10 mg em pó) em clorofórmio em uma concentração desejada (por exemplo, 10 mg/mL).</li>
	<li>Evapore o clorofórmio.<ol>
<li>Lugar a solução de fosfolípidos em um balão de fundo redondo e o conjunto em um evaporador rotativo (ver Tabela de materiais) conectado a um cilindro de gás de2 N. Gire o frasco sob fluxo de2 N à temperatura ambiente até um filme fino fosfolipídeo aparece (d...

O método CBB de formação de bicamada lipídica é baseado no princípio de uma gota de água em óleo, revestida por uma monocamada de20. Tecnicamente, os procedimentos para a formação de CBBs são fáceis, especialmente para os pesquisadores da remendo-braçadeira, que são proficientes em manipular Micropipetas de vidro. A configuração eletrofisiológica para a braçadeira do remendo prontamente é usada na CBB quando dois manipuladores de pipeta com microinjectors estão disponíveis. Po...

Para canais de íon, a membrana celular não é simplesmente um material de apoio, mas um parceiro para gerar o fluxo de íons. Funcionalmente, a membrana é um isolador elétrico, no qual íon canais são incorporados, e todas as membranas celulares são transmitidas com um potencial de membrana de repouso. Convencionalmente, um potencial de membrana arbitrária foi imposta de um circuito externo pelo qual a corrente elétrica através dos canais foi medido. Esta avaliação quantitativa do fluxo de iões em potenciais de membrana diferentes revelou as propriedades moleculares destes canais, tais como sua permeação íon-seletivo e associada funções1,2. Plataforma para estudos funcionais de canais iônicos de membrana é a membrana celular ou membrana de bicamada lipídica. Historicamente, gravações de corrente elétricas monocanal realizaram-se primeiro no lipid bilayers3,4, e as técnicas pertinentes foram desenvolvidas para as membranas celulares, tais como o método de remendo-braçadeira (Figura 1A )5,6. Desde então, estas duas técnicas evoluíram separadamente para fins diferentes (Figura 1)7,8.
Lipídios de membrana e membranas de BICAMADA são atualmente o foco de pesquisa para os seus papéis no apoio a estrutura e função das proteínas de canal. Portanto, a pronta disponibilidade de métodos para variar a composição lipídica em bilayers está em alta demanda. Métodos de formação de bicamada lipídica como a planar lipídios BICAMADA (PLB)8,9,10,11, gotículas de água em óleo BICAMADA12e gota interface BICAMADA (DIB)13, 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , técnicas de 19 (Figura 1) são escolhas comuns, fornecendo uma oportunidade para examinar a função canal sob diferentes composições de lipídios20. Embora o DIB é tecnicamente muito mais fácil de produzir do que a convencional PLB, o grande tamanho de DIB criou um desincentivo para remendo-clampers para aplicá-la para o estudo atuais gravações de canal único com tamanho usual de condutância (< 100 picosegundo).
Para contornar o ruído de fundo, a área de BICAMADA deve ser minimizada. Esta questão recorda as repetições da história no desenvolvimento de técnicas eletrofisiológicas para bilayers do lipid (Figura 1). Nos primeiros dias, formou-se uma BICAMADA de pequeno porte (1-30 µm de diâmetro) na ponta de uma pipeta (método de imersão a dica; Figura 1 C) 21 , 22 , 23, em vez de usar uma BICAMADA autônoma (~ 100 µm de diâmetro) em um septo hidrofóbico em uma câmara (Figura 1B). O método de imersão a ponta permitido para medições elétricas com muito de ruído de fundo inferior24. Nossas experiências com o PLB25,26, ponta-mergulho22,23,27e remendo-braçadeira28,29,30, métodos de 31 nos levaram a uma nova ideia de formar bilayers do lipid usando os princípios da bicamada de água em óleo. Referimos a isto como o contato bolha BICAMADA (CBB) método20,32. Neste método, ao invés de pendurar as gotículas de água em uma fase de óleo (Figura 1D), uma bolha de água é levada de uma pipeta de vidro (com diâmetro de ponta de cerca de 30 µm) para a fase de óleo (Figura 1E e 2), onde o bolha é mantida através da aplicação de uma pressão constante. Um forms monocamada espontaneamente na interface água-óleo na superfície da bolha. Em seguida, duas bolhas são encaixadas através da manipulação de duas pipetas de vidro, e a BICAMADA é formada como as duas monocamadas aproximam uns aos outros, com uma área de BICAMADA de equilíbrio. O tamanho da bolha é controlado pela pressão intrabolha (mantendo a pressão) e, da mesma forma, o tamanho da bicamada. Diâmetro médio de 50 µm é frequentemente usado. Embora o volume da bolha é pequeno (< 100 pL), está relacionado com o maior volume da solução de pipeta que é na faixa de microlitros, constituindo a fase de eletrólito em massa.
Há muitos benefícios de usar o método da CBB (tabela 1). Como uma técnica de formação de bicamada lipídica, membranas de várias composições de lipídios podem ser produzidas, e membranas assimétricas são mais prontamente formado32 do que são aqueles pelo convencional método dobrável33. A BICAMADA pode ser manipulada mecanicamente, ao contrário do PLB convencional que só pode ser dobrado com uma diferença de pressão hidrostática34,35. Alterando a pressão de exploração, as bolhas ou expandir ou encolhem, levando ao aumento ou diminuição da membrana de tensão32. A BICAMADA é mecanicamente destacável em monocamadas, semelhantes a congelar-fratura técnica36,37 das membranas em estudos morfológicos, mas com a CBB, uma manobra permite múltiplas desanexar e anexar ciclos32 . O pequeno volume da solução de eletrólito dentro da bolha permite fusão eficiente de lipossomas canal-reconstituído a BICAMADA, e a probabilidade de conseguir as gravações do canal é muito maior do que com a técnica convencional de PLB. O volume de pequena bolha também permite perfusão rápida (dentro de ~ 20 ms) injeção uma vez outra pipeta é inserida em qualquer das bolhas. Ao contrário do método de remendo-braçadeira, uma vez quebrado, uma membrana CBB é re-formada imediatamente e repetidamente, e pipetas podem ser usadas várias vezes ao dia. Integrando os benefícios da remendo-braçadeira e métodos PLB, a CBB fornece uma plataforma versátil para variar as condições físico-químicas da membrana, permitindo estudos sem precedentes de interações de canal-membrana.
Antes de apresentar um protocolo detalhado do processo de formação de CBB, o fundo físico-químico da formação BICAMADA é apresentado primeiro, que será útil para remendo-clampers resolver dificuldades experimentais relacionadas com a formação da membrana que são encontrados.
Experimentos CBB dar aulas de química de superfície ciência38. A CBB é semelhante a uma bolha de sabão soprada de um canudo para o ar, onde da mesma forma, uma bolha de água é explodida em um solvente orgânico. Um vai notar que uma bolha de água dificilmente é inflada quando lipídios de membrana não estão incluídos na bolha de água ou solvente orgânico. Na ausência de lipídios anfifílicos, a tensão de superfície em uma interface água-óleo é elevada, e a pressão intrabolha para explodir uma bolha vai ser alta. Esta é uma realização da equação de Laplace (ΔP = 2 γ/R, onde ΔP é a pressão intrabolha, γ é a tensão de superfície, e R é o raio da bolha). Quando a concentração de lipídios na fase orgânica ou a solução eletrolítica é elevada, aumenta a densidade dos lipídios na monocamada, conforme indicado pela isoterma de adsorção de Gibbs (-dγ = Γeu dµeu, onde Γ é o excesso de superfície do composto i e µeu é o potencial químico do componente eu)39, levando a uma baixa tensão superficial e a facilidade de formação de bolhas. A CBB, a BICAMADA pode ser observada de um ângulo tangencial (Figura 2) e o ângulo de contato entre a monocamada e BICAMADA é mensurável. Este ângulo representa um equilíbrio entre a surface tensions da monocamada e BICAMADA (equação jovem: γbi = γmo cos(θ), onde γbi é a tensão de BICAMADA, γmo é a tensão de monocamadas e θ é o ângulo de contato). As alterações no ângulo contato indicam mudanças na tensão BICAMADA, dado que a tensão de monocamada é avaliada de alterações no ângulo de contato em função do potencial de membrana (equação de Young-Lippmann: γmo = Cm V2 /4 (cos (θ0) - cos (θv)), onde Cm é a capacitância de membrana, V é o potencial de membrana e θ0 e θv são os ângulos de contacto em 0 e V mV, respectivamente)40,41 ,,42. Quando duas bolhas estão perto o suficiente, eles se aproximam um do outro espontaneamente. Isto é devido a força van der Waals, e podemos observar visualmente este processo dinâmico na formação da CBB.
Um sistema CBB é composto por fases distintas: ou seja, uma fase de óleo em massa, revestidas com uma monocamada e uma contato BICAMADA (Figura 3) de bolhas de água. Estas são uma reminiscência das várias fases observadas em um PLB, tais como um toro que contenham solventes em torno da fase de BICAMADA e uma fase orgânica fina imprensado por duas monocamadas43,44. A CBB, fase monocamada é contínua com o folheto do BICAMADA e moléculas lipídicas prontamente difundem entre a monocamada e o folheto. A fase de monocamada cobre a maior parte da superfície da bolha, constituindo a fase principal que serve como um reservatório de lipídios. Porque a cauda hidrofóbica de lipídios na monocamada se estende para fora para a fase de óleo em massa, o interior da bicamada ou o núcleo hidrofóbico abre a fase de óleo a granel. Assim, uma substância hidrofóbica injectada a fase de óleo perto da bicamada é capaz de acessar facilmente o interior da bicamada. Esta é a técnica de perfusão de membrana que tínhamos desenvolvido recentemente45, pelo qual a composição de lipídios na BICAMADA mudou rapidamente (dentro de um segundo) durante gravações atuais de canal único. Nós achamos que o teor de colesterol na BICAMADA poderia ser reversível controlado por ligar a perfusão de colesterol e desligar45. No caso em que a concentração da substância relevante na monocamada e bicapa difere, o gradiente de concentração da substância relevante é imediatamente dissolvido através da difusão, que é conhecido como o efeito de Marangoni46, 47. por outro lado, flip-flops através de monocamadas são lento48,,49,50.
Usando o método da CBB, a BICAMADA é formada sob condições físico-químicas versáteis, como um pH de eletrólito tão baixo quanto 1 51, uma concentração de sal (K+, Na+, etc.) até 3 M, um potencial de membrana tão alto quanto ±400 mV e um sistema de temperatura até 60 ° c.
Existem várias opções para a formação da CBB e a incorporação de moléculas de canal nele. Para a formação da monocamada na interface água-óleo, lipídios são adicionados em um solvente orgânico (método de lipídios-out; Figura 4 A, 4 C) ou em uma bolha como lipossomas (lipid-no método; Figura 4 B, 4 D). Notavelmente, o lipid-em método permite a formação de membranas assimétricas15,32. Moléculas de canal solúveis em solução aquosa (por exemplo, canal-formando peptídeos) são adicionadas diretamente na bolha (Figura 4A, B)52,53, Considerando que as proteínas de canal são reconstituídas em lipossomas, que são adicionados dentro da bolha (Figura 4C, D). Neste documento, a formação da CBBs pelo método lipid-para um peptide de canal (polytheonamide B (pTB); Figura 4 A) ou de uma proteína (canal de potássio KcsA, Figura 4C) é mostrada.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:607px;" width="605">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">Azolectin (L-&#945;-Phosphatidylcholine, Type IV-S)</td>
			<td style="width:85px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">P3644</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:219px;">A/D Converter</td>
			<td style="width:85px;">Molecular Divices</td>
			<td style="width:124px;">Digidata1550A</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">Ag/AgCl electrode</td>
			<td style="width:85px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:124px;">64-1317</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Bath Sonicator</td>
			<td style="width:85px;">Branson</td>
			<td style="width:124px;">M1800H-J</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">Camera</td>
			<td style="width:85px;">Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:124px;">C11440-10C</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:219px;">Glass Capillary</td>
			<td style="width:85px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:124px;">30-0062</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Hepes</td>
			<td style="width:85px;">Dojindo</td>
			<td style="width:124px;">342-01375</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:219px;">Hole Slideglass</td>
			<td style="width:85px;">Matsunami Glass</td>
			<td style="width:124px;">S339929</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Inverted Microscope</td>
			<td style="width:85px;">Olympus</td>
			<td style="width:124px;">IX73</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Isolation Table</td>
			<td style="width:85px;">Herz</td>
			<td style="width:124px;">TDI-86LA(Y)2</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Micro Injenctor</td>
			<td style="width:85px;">Narishige</td>
			<td style="width:124px;">IM-11-2</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Micro Manipulator</td>
			<td style="width:85px;">Narishige</td>
			<td style="width:124px;">EMM</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Microforge</td>
			<td style="width:85px;">Narishige</td>
			<td style="width:124px;">MF-830</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Micropipette holder</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">n-Hexadecane</td>
			<td style="width:85px;">Nacalai</td>
			<td style="width:124px;">07819-32</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Patch-Clamp Amplifier</td>
			<td style="width:85px;">HEKA</td>
			<td style="width:124px;">EPC800</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">Pipette Puller</td>
			<td style="width:85px;">Sutter Instrument Co.</td>
			<td style="width:124px;">P-87</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine)</td>
			<td style="width:85px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:124px;">850457</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:219px;">POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine 
			)</td>
			<td style="width:85px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:124px;">850757</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">POPG (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) )</td>
			<td style="width:85px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:124px;">840457</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:85px;">Nacalai</td>
			<td style="width:124px;">28514-75</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Rotary Evapolator</td>
			<td style="width:85px;">Iwaki</td>
			<td style="width:124px;">REN-1000</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Succinic Acid</td>
			<td style="width:85px;">Nacalai</td>
			<td style="width:124px;">32402-05</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Vacuum Pump</td>
			<td style="width:85px;">Buchi</td>
			<td style="width:124px;">V-100</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lipid bilayer experiments with contact bubble bilayers for patch-clampers

Bilayers do lipid fornecem uma única plataforma experimental para estudos funcionais de canais iônicos, permitindo que o exame das interações de canal-membrana sob a membrana várias composições de lipídios. Entre eles, a BICAMADA de interface da gota ganhou popularidade; no entanto, o tamanho grande membrana dificulta a gravação do ruído de fundo eléctrica baixa. Nós temos estabelecido um método de BICAMADA (CBB) contato bolha que combina os benefícios da bicamada lipídica planar e remendo-braçadeira métodos, tais como a capacidade de variar a composição de lipídios e manipular a mecânica de BICAMADA, respectivamente. Usando a configuração para experimentos de remendo-braçadeira convencional, CBB-baseado podem ser prontamente realizados experimentos. Em breve, uma solução de eletrólito em uma pipeta de vidro é fundida em uma fase de solvente orgânica (hexadecano) e a pressão da pipeta é mantida para obter um tamanho de bolha estável. A bolha é espontaneamente forrada com uma monocamada de lipídios (lipídios puros ou mistos de lipídios), que é fornecida de lipossomas nas bolhas. Em seguida, as duas bolhas de monocamada-alinhado (~ 50 µm de diâmetro) na ponta da pipeta de vidro são encaixadas para formação da bicamada. Introdução do canal-reconstituído lipossomas dentro da bolha leva à incorporação de canais na BICAMADA, permitindo a gravação atual de canal único com uma relação sinal-ruído comparável de gravações de remendo-braçadeira. CBBs com uma composição assimétrica lipídios formam-se facilmente. A CBB é renovada repetidamente por estourar as bolhas anteriores e formando novos. Várias perturbações físicas e químicas (por exemplo, perfusão de membrana e a BICAMADA tensão) podem ser impostas a CBBs. aquiem, apresentamos o procedimento básico para formação da CBB.

Um típico CBB tinha um diâmetro de 50 µm (Figura 56), sendo a capacitância de membrana específicas em hexadecano 0.65 µF/cm2. O tamanho da bolha arbitrariamente era controlado pela pressão intrabolha. Quando pequenas bolhas são necessárias para as gravações de baixo ruído, o diâmetro da ponta deve ser correspondentemente pequeno. Por exemplo, para um tamanho de bolha de 50 µm de diâmetro, o diâmetro da ponta deve se...

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Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers

Aqui, apresentamos um protocolo para a formação de bilayers do lipid usando um método de BICAMADA contato bolha. Uma bolha de água é explodida em um solvente orgânico, segundo a qual uma monocamada é constituída na interface água-óleo. Duas pipetas são manipuladas para encaixar as bolhas para formar uma BICAMADA.

Experimentos de bicamada lipídica com contato bolha Bilayers para Patch-Clampers

Lipid bilayers provide a unique experimental platform for functional studies of ion channels, allowing the examination of channel-membrane interactions ...

O método Contact Bubble Bilayer é uma técnica alternativa para bicamadas lipídicas convencionais. e este método permite vibração mais versátil através da membrana. O método CBB integra os benefícios do Planar Lipid Bilayer e do método de remendo.Como técnica de bicamadas lipídicas, uma CBB com uma composição lipídica arbitrária pode ser formada. Desenvolvemos um CBB para gravações de corrente de canal único com alta relação sinal/ruído. Este método permite variedades de vibrações de membrana e oferece uma vasta plataforma tipo para a interface de membrana de canal.Todo mundo já experimentou soprar uma bolha de sabão. Manobras semelhantes são tomadas para a formação de CBB, ajustando manualmente a pressão aplicada em vez de soprar pela boca. Pratique e aproveite a CBB.Para ser este procedimento dispersar fosfolipídios em clorofórmio em uma concentração desejada em um frasco fundo redondo. Coloque a solução fosfolipítida em um evaporador rotativo conectado a um cilindro de gás nitrogênio. Gire o frasco sob o fluxo de nitrogênio à temperatura ambiente até que uma fina película fosfolipílica apareça.Em seguida, coloque o frasco aberto em um dessecator conectado a uma bomba de vácuo. Usando a bomba de vácuo aspira o interior do dessecator por várias horas para remover completamente o clorofórmio. Posteriormente adicione um volume apropriado de solução de eletrólito ao frasco e suspenda o fosfolipídio para obter dois milligrmas por suspensão fosfolipídida mililitro.Sonciar a suspensão por 20 a 30 segundos usando um sonicator de banho para obter uma suspensão de vesícula multicamadas. Para a preparação de proteolipósos que contenham proteínas do canal de íons, adicione uma solução proteica à suspensão de vesícula multicamadas. E sonicate por vários segundos usando o sonicator de banho.Para preparar grandes pipetas de vidro, coloque um capilar de vidro em um puxador de pipeta e forja a micropipette com uma fina ponta afilada através de dois passos puxando. Em seguida, coloque a micropipette em uma micro forja e entre em contato com a ponta da micropipette a um filamento de platina na porção afilada com um diâmetro de 30 a 50 micrômetros. Aqueça o filamento brevemente e desligue-o imediatamente.O uso de água destilada e etanol limpa a superfície do escorregador de vidro com um poço raso. Em seguida, aplique o reagente de silício no slide de vidro e deixe o reagente secar completamente no ar. Em seguida, coloque o deslizamento de vidro no palco de um microscópio invertido.Adicione 100 microlitadores de hexadecano no poço raso do escorregador de vidro siliconado. Usando uma seringa tuberculina encha a solução de eletrólitos até metade do comprimento da micropipette. Em seguida, coloque a micropipette no suporte de micropipette com a porta de pressão, permitindo que o eletrodo do fio de cloreto de prata/prata mergulhe na solução de eletrólitos de pipeta.Conecte um dos suportes de micropipette ao estágio da cabeça de um amplificador de grampo de remendo e o outro ao solo elétrico. Posteriormente, conecte um microinjetor à porta de pressão do suporte de micropipette. Ajuste a micropipette a uma posição apropriada acima do estágio de um microscópio invertido usando o micromanipulador.Para ajustar o potencial de deslocamento do eletrodo, coloque um microliter da mesma solução de eletrólito usada para encher a micropipette na superfície plana ao redor do poço raso do deslizamento de vidro para criar uma cúpula eletrólito. Mergulhe a ponta de ambos os micropipettos na cúpula eletrólito. Depois ajuste o potencial de deslocamento do eletrodo do amplificador de grampo de remendo.Para extrair a solução lipossa da ponta, adicione um microliter de solução lipossa na superfície plana ao redor do poço raso do vidro deslizante. Em seguida, coloque a ponta da micropipette na cúpula que contém liposom. Aspire a solução contendo lipossomo usando o microinjetor.Repita o procedimento para a outra mircopipette para lipossomos reconstituídos do canal aspirado. Agora coloque a micropipette no hexadecano no poço raso. Sopre uma bolha de água lentamente aumentando a pressão até que a bolha atinja o tamanho desejado e mantenha a mesma pressão depois disso.Descarte a bolha passando a ponta através da interface óleo-ar se for difícil manter o tamanho da bolha estável. Repita os procedimentos até formar duas bolhas estáveis. Estabeleça um contato entre as duas bolhas.Ajuste a pressão para manter o tamanho da bolha, porque o tamanho pode mudar gradualmente mesmo com a pressão intra-bolha constante. Defina o potencial da membrana para o valor apropriado usando o amplificador de reivindicação de patch e aguarde que a corrente do canal surja. Para formação de bicamadas lipídicas estáveis é essencial limpar as manchas.A preparação capilar de vidro ou pipeta deve ser lavada completamente e evitar a contaminação pelas moléculas de detergente. Uma vez que a CBB tinha formado as moléculas do canal em solução aquosa ou no lipossomo foram espontaneamente inseridos na bicamada dentro de alguns a dezenas de minutos. As inserções dos canais foram confirmadas pelo aumento da amplitude atual sob o potencial de membrana aplicada.Um bicamado formado pelo método CBB pode ser desintegrado em duas monocamadas. A corrente do canal pTB surgiu imediatamente após anexar as duas monocamadas. E a corrente ficou maior à medida que o contato aumentava a amplitude da corrente sincronizada com a manipulação de desvinculação da CBB.Se o número de bolhas aumentar a concentração lipídica na solução aquosa diminuir e a monocamada não for formada. Em seguida, tente aliviar a pressão na seção liposso. Uma vez estabelecida a formação da CBB e a reconstituição do canal, você pode tentar variar as composições de solução aquosa e membrana através de profusão ou injetando uma substância hidrofílica ou hidrofóbica.O método CBB abriu formas versáteis de explorar as interações entre canais e membranas.

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In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. ...

Fabrication of High Contact-Density, Flat-Interface Nerve Electrodes for Recording and Stimulation Applications

Fabricação de alta Contact densidade, eletrodos nervosas Plano de Interface para gravação e estimulação Applications

Many attempts have been made to manufacture multi-contact nerve cuff electrodes that are safe, robust and reliable for long term neuroprosthetic ...

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Prepara frescas fatias da retina de adultos do Zebrafish para Ex Vivo experimentos de imagem

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding ...

Conducting Hyperscanning Experiments with Functional Near-Infrared Spectroscopy

Hyperscanning experimentos com espectroscopia de infravermelho próximo funcional

Concurrent brain recordings of two or more interacting persons, an approach termed hyperscanning, are gaining increasing importance for our understanding ...

Using Neuron Spiking Activity to Trigger Closed-Loop Stimuli in Neurophysiological Experiments

Usando a atividade de spiking do neurônio para provocar estímulos do Closed-Loop em experiências neurophysiological

Closed-loop neurophysiological systems use patterns of neuronal activity to trigger stimuli, which in turn affect brain activity. Such closed-loop systems ...

Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments

Geração de Oligodendrocytes e Oligodendrocyte-Conditioned Medium para Experimentos de Cocultura

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials ...