Name: lipid bilayer experiments with contact bubble bilayers for patch-clampers
Uploaded: 2019-01-16T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers at JoVE.com

Los autores desean agradecer a Mariko Yamatake y Masako Takashima para asistencia técnica. Este trabajo fue financiado en parte por KAKENHI grant números 16H 00759 y 17 H 04017 (SO).

1. preparar liposomas
<ol><li>Dispersar los fosfolípidos (por ejemplo, 10 mg en polvo) en cloroformo a una concentración deseada (p. ej., 10 mg/mL).</li>
	<li>Evaporar el cloroformo.<ol>
<li>Lugar la solución de fosfolípidos en un matraz de fondo redondo y el conjunto en un evaporador rotatorio (véase Tabla de materiales) conectado a un cilindro de gas N2 . Gire el frasco bajo el flujo de N2 a temperatura ambiente hasta que aparezca una película fina de fos...

El método de enganche de la formación de la bicapa de lípidos se basa en el principio de una gotita de agua en aceite, revestido por una monocapa20. Técnicamente, los procedimientos para la formación de CBB son fáciles, especialmente para los investigadores de la abrazadera del remiendo, que son expertos en manipular Micropipetas de vidrio. La configuración electrofisiológica para la abrazadera del remiendo se utiliza fácilmente en el CBB cuando dos manipuladores de la pipeta con microman...

De canales iónicos de la membrana celular no es simplemente un material de apoyo sino un socio para generar el flujo de iones. Funcionalmente, la membrana es un aislador eléctrico en que ion canales están integrados, y todas las membranas celulares son impartidas con un potencial de membrana de reposo. Convencionalmente, se impuso una potencial arbitrario de la membrana de un circuito externo por el cual se midió la corriente eléctrica a través de los canales. Esta evaluación cuantitativa del flujo de iones en potenciales de membrana diferentes reveló las propiedades moleculares de estos canales, como su permeabilidad ion selectivo y bloquea funciones1,2. La plataforma para estudios funcionales de los canales iónicos de membrana es la membrana celular o la membrana de bicapa lipídica. Históricamente, solo canal eléctricas actuales grabaciones se realizaron primero en bicapas de lípidos3,4, y las técnicas relevantes fueron desarrolladas para las membranas celulares, como el método de patch-clamp (figura 1A )5,6. Desde entonces, estas dos técnicas han evolucionado por separado para diferentes propósitos (figura 1)7,8.
Lípidos de membrana y membranas bicapa son actualmente el foco de investigación para su papel en el apoyo a la estructura y función de proteínas de canal. Por lo tanto, la disponibilidad inmediata de los métodos para variar la composición de lípido en bicapas está en alta demanda. Lípidos bicapa formación métodos, como la plana lípidos bicapa (PLB)8,9,10,11, gota de agua en aceite bicapa12y gota interfaz bicapa (DIB)13, 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 técnicas (figura 1) son opciones comunes, proporcionando una oportunidad para examinar la función de canal en diferentes composiciones de lípidos20. Aunque el DIB es técnicamente mucho más fácil de producir que la PLB convencional, el gran tamaño de la DIB ha creado un desincentivo para abrazaderas de parche aplicar para el estudio de grabaciones actuales monocanal con conductancia generalmente tamaño (< 100 pS).
Para evitar el ruido de fondo, debe minimizarse el área de la bicapa. Este tema recuerda las repeticiones de la historia en el desarrollo de técnicas electrofisiológicas para bicapas de lípidos (figura 1). En los primeros días, una bicapa de pequeño tamaño (1-30 μm de diámetro) se formó en la punta de una pipeta (método de inmersión en punta; Figura 1 C) 21 , 22 , 23, en lugar de usar una bicapa independiente (~ 100 μm de diámetro) en un tabique hidrofóbico en una cámara (figura 1B). El método de inmersión en punta para mediciones eléctricas con mucho más bajo de ruido de fondo24. Nuestras experiencias con25,26de PLB, punta-dip22,23,27y abrazadera del remiendo28,29,30, 31 métodos nos llevaron a una idea novedosa de formar bicapas de lípidos mediante el uso de los principios de la bicapa de agua en aceite. Nos hemos referido a esto como la burbuja contacto método bicapa (CBB)20,32. En este método, en lugar de colgar las gotitas de agua en una fase de aceite (figura 1D), una burbuja de agua está fundida de una pipeta de vidrio (con diámetro de punta de aproximadamente 30 μm) en la fase de aceite (figura 1E y 2), donde el la burbuja se mantiene mediante la aplicación de una presión constante. Una forma de capa monomolecular espontáneamente en la interfase agua-aceite en la superficie de la burbuja. A continuación, dos burbujas se acoplan a través de la manipulación de dos pipetas de vidrio y la bicapa está formada como las dos monocapas aproximan, dando un área de bicapa de equilibrio. El tamaño de la burbuja es controlado por la presión intra-burbuja (con presión) y además el tamaño de la bicapa. Con frecuencia se utiliza un diámetro promedio de 50 μm. Aunque el volumen de la burbuja es pequeño (< 100 pL), está conectado con el mayor volumen de la solución de la pipeta que está en la gama de microlitro, constituyendo la fase de electrólito a granel.
Hay muchos beneficios al utilizar el método de enganche (tabla 1). Como una técnica de formación de bicapa lipídica, pueden producir membranas de varias composiciones de lípidos y membranas asimétricas son más fácilmente formada32 que son los del método plegable convencional33. La bicapa se puede manipularse mecánicamente, a diferencia de la PLB convencional que sólo se puede doblar con una diferencia de presión hidrostática34,35. Cambiando la presión de la tenencia, las burbujas expansión o encogen, conduciendo a aumento o disminución de la membrana de tensión32. La bicapa es mecánicamente desmontable en monocapas, similares a la congelación de la fractura técnica36,37 de membranas en estudios morfológicos, pero con el enganche, una maniobra permite separar y fijar ciclos32 repetidos . El pequeño volumen de la solución electrolítica dentro de la burbuja permite eficiente fusión de liposomas canal reconstituido en la bicapa, y la probabilidad de obtener grabaciones de canal es mucho mayor que con la técnica convencional de la PLB. El volumen de la burbuja pequeña también permite perfusión rápida (dentro de ~ 20 ms) inyección una vez otra pipeta se introduce en cualquiera de las burbujas. A diferencia del método de la abrazadera del remiendo, una vez roto, una membrana CBB nuevamente se forma inmediatamente y en varias ocasiones, y pipetas pueden utilizarse varias veces al día. Mediante la integración de beneficios de los métodos de la PLB y abrazadera del remiendo, el enganche esférico proporciona una plataforma versátil para variar las condiciones fisicoquímicas de la membrana, permitiendo estudios sin precedentes de las interacciones membrana-canal.
Antes de presentar un protocolo detallado del proceso de formación de CBB, el fondo fisicoquímico de la formación de la bicapa se presenta primero, que será útil para parche-abrazaderas resolver las dificultades experimentales relativos a la formación de la membrana se encuentran.
Experimentos CBB imparten lecciones de química superficial ciencia38. El CBB es similar a una burbuja de jabón soplada de una pajita en el aire, donde además, se sopla una burbuja de agua en un solvente orgánico. Uno notará que una burbuja de agua apenas se infla cuando lípidos de membrana no están incluidos en la burbuja de agua o en solvente orgánico. En la ausencia de lípidos anfipáticos, la tensión superficial en una interfase agua-aceite es alta y la presión intra-burbujas para soplar una burbuja será alta. Se trata de una realización de la ecuación de Laplace (ΔP = γ/R 2, donde ΔP es la presión intra-burbuja, γ es la tensión superficial y R es el radio de la burbuja). Cuando la concentración de lípidos en la fase orgánica o en la solución de electrolitos es alta, aumenta la densidad de los lípidos en la monocapa, dictadas por el isoterma de adsorción de Gibbs (-dγ = Γ dµ, donde Γ es el exceso de superficie del compuesto i y μ es el potencial químico del componente i)39, conduce a una baja tensión superficial y facilitar la formación de burbujas. En el enganche, la bicapa puede ser observada desde un ángulo tangencial (figura 2), y el ángulo de contacto entre el monocapa y bicapa es mensurable. Este ángulo representa un equilibrio entre la surface tensions de la monocapa y bicapa (ecuación joven: γbi = γmo cos(θ), donde γbi es la tensión de la bicapa,mo γ es la tensión de la monocapa, y θ es el ángulo de contacto). Los cambios en el ángulo de contacto indican cambios en la tensión de la bicapa, ya que la tensión de la monocapa se evalúa de los cambios en el ángulo de contacto en función de la membrana potencial (ecuación Young-Lippmann: γmo = Cm V2 /4 (cos (θ0) - cos (θv)), donde Cm es la capacitancia de la membrana, V es el potencial de membrana y θ0 y θv son los ángulos de contacto 0 y V mV, respectivamente)40,41 ,42. Cuando dos burbujas se encuentra lo suficientemente cercanas, se acercan entre sí espontáneamente. Esto es debido a las fuerzas de van der Waals, y visualmente podemos observar este proceso dinámico de formación de CBB.
Un sistema CBB consta de distintas fases: a saber, una fase de aceite a granel, agua burbujas recubiertas con una capa monomolecular y una bicapa contacto (figura 3). Estos son una reminiscencias de las múltiples fases observadas en un PLB, como un toro que contiene el solvente en la fase de la bicapa y una fase orgánica fina intercalada por dos monocapas43,44. En el enganche, la fase de monocapa es continua con el folleto de la bicapa, y moléculas de lípidos fácilmente difusión entre el monocapa y el folleto. La fase de monocapa cubre la mayor parte de la superficie de la burbuja, que constituye la fase principal que sirve como un reservorio de lípidos. Ya que la cola hidrofóbica de los lípidos en la monocapa se extiende hacia afuera a la fase de aceite a granel, el interior de la bicapa o el núcleo hidrofóbico se abre a la fase de aceite a granel. Así, una sustancia hidrofóbica que inyecta en la fase de aceite cerca de la bicapa es capaz de acceder fácilmente al interior de la bicapa. Esta es la técnica de perfusión de membrana que habíamos desarrollado recientemente45, por la que la composición de lípidos de la bicapa se cambia rápidamente (dentro de un segundo) durante grabaciones actuales de un canal. Encontramos que el contenido de colesterol en la bicapa puede ser reversible controlado por conectar/desconectar la perfusión de colesterol45. En caso de que la concentración de la sustancia en la monocapa y bicapa difiere, el gradiente de la concentración de la sustancia se disuelve inmediatamente a través de la difusión, que se conoce como el efecto de Marangoni46, 47. por otra parte, flip-flop a través de los monocapas son lento48,49,50.
Usando el método de enganche, la bicapa está formada bajo condiciones fisicoquímicas versátiles, como un pH del electrolito como 1 51, una concentración de sal (K+, Na+, etcetera.) hasta 3 M, un tan alta como ±400 mV del potencial de la membrana y un sistema de temperatura de 60 ° C.
Hay varias opciones para la formación de la CBB y la incorporación de moléculas de canal en el mismo. Para la formación de la monocapa en la interfase agua-aceite, se añaden lípidos en un disolvente orgánico (método de lípidos; Figura 4 A, C 4) o en una burbuja como liposomas (método de lípidos; Figura 4 B, 4 D). En particular, el método de lípidos permite la formación de membranas asimétricas15,32. Moléculas de canal solubles en solución acuosa(por ejemplo, el canal formando péptidos) se agregan directamente en la burbuja (figura 4A, B)52,53, mientras que las proteínas de canal son reconstituidas en liposomas, que se añaden en la burbuja (figura 4C, D). En este documento, la formación de CBB por el método de lípidos para un péptido canal (polytheonamide B (pTB); Figura 4 A) o una proteína (canal de potasio de la emisora KcsA, figura 4C).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:607px;" width="605">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">Azolectin (L-&#945;-Phosphatidylcholine, Type IV-S)</td>
			<td style="width:85px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">P3644</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:219px;">A/D Converter</td>
			<td style="width:85px;">Molecular Divices</td>
			<td style="width:124px;">Digidata1550A</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">Ag/AgCl electrode</td>
			<td style="width:85px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:124px;">64-1317</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Bath Sonicator</td>
			<td style="width:85px;">Branson</td>
			<td style="width:124px;">M1800H-J</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">Camera</td>
			<td style="width:85px;">Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:124px;">C11440-10C</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:219px;">Glass Capillary</td>
			<td style="width:85px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:124px;">30-0062</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Hepes</td>
			<td style="width:85px;">Dojindo</td>
			<td style="width:124px;">342-01375</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:219px;">Hole Slideglass</td>
			<td style="width:85px;">Matsunami Glass</td>
			<td style="width:124px;">S339929</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Inverted Microscope</td>
			<td style="width:85px;">Olympus</td>
			<td style="width:124px;">IX73</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Isolation Table</td>
			<td style="width:85px;">Herz</td>
			<td style="width:124px;">TDI-86LA(Y)2</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Micro Injenctor</td>
			<td style="width:85px;">Narishige</td>
			<td style="width:124px;">IM-11-2</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Micro Manipulator</td>
			<td style="width:85px;">Narishige</td>
			<td style="width:124px;">EMM</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Microforge</td>
			<td style="width:85px;">Narishige</td>
			<td style="width:124px;">MF-830</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Micropipette holder</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">n-Hexadecane</td>
			<td style="width:85px;">Nacalai</td>
			<td style="width:124px;">07819-32</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Patch-Clamp Amplifier</td>
			<td style="width:85px;">HEKA</td>
			<td style="width:124px;">EPC800</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">Pipette Puller</td>
			<td style="width:85px;">Sutter Instrument Co.</td>
			<td style="width:124px;">P-87</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine)</td>
			<td style="width:85px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:124px;">850457</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:219px;">POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine 
			)</td>
			<td style="width:85px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:124px;">850757</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">POPG (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) )</td>
			<td style="width:85px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:124px;">840457</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:85px;">Nacalai</td>
			<td style="width:124px;">28514-75</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Rotary Evapolator</td>
			<td style="width:85px;">Iwaki</td>
			<td style="width:124px;">REN-1000</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Succinic Acid</td>
			<td style="width:85px;">Nacalai</td>
			<td style="width:124px;">32402-05</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Vacuum Pump</td>
			<td style="width:85px;">Buchi</td>
			<td style="width:124px;">V-100</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lipid bilayer experiments with contact bubble bilayers for patch-clampers

Bicapas de lípidos proporcionan una plataforma experimental única para estudios funcionales de los canales iónicos, permitiendo el examen de las interacciones membrana-canal bajo membrana varias composiciones de lípidos. Entre ellos, la bicapa de la interfaz de gota ha ganado popularidad; sin embargo, el tamaño grande de la membrana impide la grabación de bajo ruido eléctrico. Hemos establecido un método de contacto burbuja bicapa (CBB) que combina los beneficios de la bicapa lipídica planar y métodos de la abrazadera del remiendo, como la capacidad para variar la composición de lípidos y de manipular a los mecánicos de la bicapa, respectivamente. Usando la configuración para los experimentos de patch-clamp convencionales, experimentos basados en el CBB se pueden fácilmente realizar. En Resumen, la solución de un electrolito en una pipeta de vidrio está fundida en una fase solvente orgánica (hexadecano), y la presión de la pipeta se mantiene para conseguir un tamaño de burbuja estable. La burbuja está llena espontáneamente de una monocapa de lípidos (lípidos puros o mezcla de lípidos), que se proporciona de liposomas en las burbujas. A continuación, se acoplan las dos burbujas revestimiento de monocapa (~ 50 μm de diámetro) en la punta de las pipetas de vidrio para la formación de la bicapa. Introducción de liposomas canal reconstituido en la burbuja conduce a la incorporación de canales en la bicapa, lo que permite un canal grabación actuales con una relación señal a ruido comparable a la de grabaciones de patch-clamp. CBB con una composición asimétrica de los lípidos se forma fácilmente. El enganche se renueva varias veces soplar las burbujas anteriores y formando otras nuevas. Diversas perturbaciones químicas y físicas (e.g., perfusión de membrana y la bicapa tensión) pueden ser impuestas en el CBB. adjunto, presentamos el procedimiento básico para la formación del CBB.

Un enganche típico tenía un diámetro de 50 μm (figura 56) y la capacitancia de membrana específicos en hexadecano fue 0.65 μF/cm2. El tamaño de la burbuja fue arbitrariamente controlado por la presión intra-burbuja. Cuando pequeñas burbujas son necesarias para grabaciones de poco ruido, el diámetro de la punta debe ser correspondientemente pequeño. Por ejemplo, para un tamaño de burbuja de 50 μm de diámetro, el diáme...

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Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers

Aquí, presentamos un protocolo para la formación de bicapas lipídicas soportadas utilizando un método de contacto burbuja bicapa. Se sopla una burbuja de agua en un solvente orgánico, por el que se forma una monocapa en la interfase agua-aceite. Dos pipetas son manipulados para acoplar las burbujas para formar una bicapa.

Lípidos bicapa experimentos con bicapas de burbuja contacto para parche-abrazaderas

Lipid bilayers provide a unique experimental platform for functional studies of ion channels, allowing the examination of channel-membrane interactions ...

El método Contact Bubble Bilayer es una técnica alternativa para las bicapas lipídicas convencionales. y este método permite una vibración más versátil a través de la membrana. El método CBB integra los beneficios de Planar Lipid Bilayer y el método de abrazadera de parche.Como técnica de bicapía de lípidos se puede formar un CBB con una composición lipídica arbitraria. Hemos desarrollado un CBB para grabaciones de corriente de canal único con alta relación señal-ruido. Este método permite variedades de vibraciones de membrana y ofrece una plataforma de tipo vasto a la interfaz de membrana de canal.Todo el mundo ha experimentado soplando una burbuja de jabón. Maniobras similares se toman para la formación de CBB mediante el ajuste manual de la presión aplicada en lugar de soplar por la boca. Practica y disfruta del CBB.Para ser este procedimiento dispersar los fosfolípidos en cloroformo a una concentración deseada en un matraz inferior redondo. Coloque la solución de fosfolípidos en un evaporador rotatorio conectado a un cilindro de gas nitrógeno. Gire el matraz bajo flujo de nitrógeno a temperatura ambiente hasta que aparezca una película fosfolípida delgada.A continuación, coloque el matraz abierto en un desecador que esté conectado a una bomba de vacío. Usando la bomba de vacío aspirar el interior del desecador durante varias horas para eliminar el cloroformo a fondo. Posteriormente añadir un volumen adecuado de solución de electrolitos al matraz y suspender el fosfolípido para obtener una suspensión de fosfolípidos de dos mililitros por mililitro.Sonciate la suspensión durante 20 a 30 segundos usando un sonicador de baño para obtener una suspensión de vesícula multicapa. Para la preparación de proteoliposomas que contengan proteínas de canal iónico, agregue una solución proteica a la suspensión de vesícula multicapa. Y sonicar durante varios segundos usando el sonicador de baño.Para preparar pipetas de vidrio de diámetro grande, coloque un capilar de vidrio en un tirador de pipeta y fabrique la micropipeta con una punta cónica fina a través de un tirón de dos pasos. A continuación, ajuste la micropipeta en una micro forja y entre en contacto la punta de la micropipeta con un filamento de platino en la porción cónica con un diámetro de 30 a 50 micrómetros. Caliente el filamento brevemente y apáelo inmediatamente.Usando agua destilada y etanol limpie la superficie del tobogán de vidrio con un pozo poco profundo. A continuación, aplique el reactivo de silicona sobre el portaobjetos de vidrio y deje que el reactivo se seque completamente en el aire. A continuación, coloque el portaobjetos de vidrio en el escenario de un microscopio invertido.Añadir 100 microlitros de hexadecano en el pozo poco profundo del portaobjetos de vidrio siliconizado. Con una jeringa de tuberculina, llene la solución de electrolitos hasta la mitad de la longitud de la micropipeta. A continuación, ajuste la micropipeta en el soporte de micropipeta con el puerto de presión, lo que permite que el electrodo de alambre de cloruro de plata/plata se empape en la solución de electrolito de pipeta.Conecte uno de los soportes de micropipeta a la etapa principal de un amplificador de abrazadera de parche y el otro al suelo eléctrico. Posteriormente conecte un microinyector al puerto de presión del soporte de micropipeta. Ajuste la micropipeta a una posición adecuada por encima de la etapa de un microscopio invertido utilizando el micromanipulador.Para ajustar el potencial de desplazamiento del electrodo, coloque un microlitro de la misma solución de electrolito utilizada para llenar la micropipeta en la superficie plana alrededor del pozo poco profundo de la diapositiva de vidrio para crear una cúpula de electrolito. Sumerja la punta de ambas micropipetas en la cúpula de electrolitos. A continuación, ajuste el potencial de desplazamiento del electrodo del amplificador de abrazadera de parche.Para extraer la solución liposoma de la punta, agregue un microlitro de solución liposoma en la superficie plana alrededor del pozo poco profundo del vaso deslizante. A continuación, coloque la punta de la micropipeta en el liposoma que contiene la cúpula. Aspirar el liposoma que contiene la solución utilizando el microinyector.Repita el procedimiento para el otro mircopipetto para aspirar liposomas reconstituidos por canal. Ahora coloque la micropipeta en el hexadecano en el pozo poco profundo. Soplar una burbuja de agua lentamente aumentando la presión hasta que la burbuja alcance el tamaño deseado y mantener la misma presión a partir de entonces.Deseche la burbuja pasando la punta a través de la interfaz aceite-aire si es difícil mantener el tamaño de la burbuja estable. Repita los procedimientos hasta que se formen dos burbujas estables. Establezca un contacto entre las dos burbujas.Ajuste la presión para mantener el tamaño de la burbuja, ya que el tamaño puede cambiar gradualmente incluso a la presión constante dentro de la burbuja. Establezca el potencial de membrana en el valor adecuado utilizando el amplificador de reclamación de parche y espere a que surja la corriente del canal. Para la formación estable de la bicacapa lipídica es esencial limpiar las manchas.La preparación capilar o pipeta de vidrio debe lavarse a fondo y evitar la contaminación por las moléculas de detergente. Una vez que el CBB había formado las moléculas del canal ya sea en solución acuosa o en el liposoma se insertaron espontáneamente en la bicapas en el lapso de unos pocos a docenas de minutos. Las inserciones de los canales fueron confirmadas por el aumento escalonado de la amplitud de corriente bajo el potencial de membrana aplicado.Una bicacapa formada por el método CBB se puede desintegrar en dos monocapas. La corriente del canal pTB surgió inmediatamente después de conectar las dos monocapas. Y la corriente se hizo más grande a medida que el contacto aumentaba la amplitud de la corriente se sincronizaba con la manipulación de la conexión de desprendimiento del CBB.Si el número de explosiones de burbujas aumenta la concentración de lípidos en la solución acuosa disminuye y la monocapa no se forma. Luego trata de aliviar la presión sobre la sección de liposomas. Una vez establecida la formación de CBB y la reconstitución del canal, puede intentar variar las composiciones de la solución acuosa y la membrana a través de la profusión o la inyección de sustancias hidrófilas o hidrófobas.El método CBB ha abierto formas versátiles de explorar las interfaces de membrana de canal.

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Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Preparación frescas rebanadas retinales de pez cebra adulto para Ex Vivo de experimentos

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding ...

Conducting Hyperscanning Experiments with Functional Near-Infrared Spectroscopy

Realización de experimentos de Hyperscanning con funcional espectroscopia del infrarrojo cercano

Concurrent brain recordings of two or more interacting persons, an approach termed hyperscanning, are gaining increasing importance for our understanding ...

Using Neuron Spiking Activity to Trigger Closed-Loop Stimuli in Neurophysiological Experiments

Uso de la actividad de spiking de neuronas para desencadenar estímulos de bucle cerrado en experimentos neurofisiológicos

Closed-loop neurophysiological systems use patterns of neuronal activity to trigger stimuli, which in turn affect brain activity. Such closed-loop systems ...

Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments

Generación de oligodendrocitos y medio condicionado por oligodendrocitos para experimentos de cocultura

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials ...