Name: lipid bilayer experiments with contact bubble bilayers for patch-clampers
Uploaded: 2019-01-16T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers at JoVE.com

Författarna vill tacka Mariko Yamatake och Masako Takashima för tekniskt bistånd. Detta arbete var stöds delvis av KAKENHI grant nummer 16H 00759 och 17 H 04017 (SO).

1. Förbered liposomer
<ol><li>Skingra fosfolipider (t.ex., 10 mg i pulver) i kloroform vid en önskad koncentration (t.ex., 10 mg/mL).</li>
	<li>Avdunsta kloroform.<ol>
<li>Plats fosfolipid lösningen i en runda-botten kolven och ställ den på en rotationsindunstare (se Tabell för material) ansluten till gasflaskan N2 . Rotera kolven under N2 flöde i rumstemperatur tills en tunn fosfolipid film visas (efter ~ 30 min).</li>
		<li>Placera öppna kolven i exsick...

Metoden CBB för lipid lipidens bildandet är baserad på principen om en vatten-i-olja droplet kantad av en enskiktslager20. Tekniskt, förfarandena för att bilda CBBs är lätt, särskilt för patch-clamp forskare, som är skicklig på att manipulera glas Mikropipetter. Den elektrofysiologiska setup för patch klämman används lätt i CBB när två pipett manipulatorer med microinjectors finns tillgängliga. Däremot, eftersom CBB är en efterträdare av den konventionella PLB, för vilket en ...

Jonkanaler är cellmembranet inte bara ett stödjande material utan en partner för att generera den ion fluxen. Funktionellt, membranet är en elektrisk isolator som ion kanaler är inbäddade, och alla cellmembran är förmedlas med en vilande membranpotential. Konventionellt, infördes en godtycklig membranpotential från en yttre krets som elektrisk ström genom kanaler mättes. Denna kvantitativa utvärderingen av ion flux på olika membran potentialer avslöjade dessa kanaler, såsom deras jonselektiva genomträngning och Usenets funktioner1,2molekylära egenskaper. Membranet plattformen för funktionella studier av jonkanaler är antingen cellmembranet eller lipid lipidens membranet. Historiskt, enkanalig elektriska aktuella registreringar utfördes först i lipid lipidmonolager3,4och de relevanta teknikerna utvecklades för cellmembran, såsom metoden patch-clamp (figur 1A )5,6. Sedan dess har har dessa två tekniker utvecklats separat för olika ändamål (figur 1)7,8.
Membran lipider och lipidens membran är för närvarande i fokus för forskning för sina roller i att stödja struktur och funktion av kanal proteiner. Snabb tillgång till metoder att variera lipid sammansättningen i lipidmonolager är därför i hög efterfrågan. Lipid lipidens bildandet metoder såsom den planar lipid lipidens (PLB)8,9,10,11, vatten-i-olja droplet lipidens12och droplet gränssnitt lipidens (DIB)13, 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 tekniker (figur 1) är gemensamma val, vilket ger en möjlighet för att undersöka funktionen kanal under varierande lipid kompositioner20. Även om DIB är tekniskt enklare att producera än de konventionella PLB, storleken på DIB har skapat en avskräckande för patch-låskretsar att tillämpa den för att studera enkanalig nuvarande inspelningar med vanliga medelstora konduktans (< 100 pS).
För att kringgå bakgrundsljud, måste området lipidens minimeras. Denna fråga påminner om repetitioner av historia i utveckla elektrofysiologiska tekniker för lipid lipidmonolager (figur 1). I början bildades en små lipidens (1-30 µm i diameter) på spetsen av en pipett (tip-dip metod. Figur 1 C) 21 , 22 , 23, i stället för att använda en fristående lipidens (~ 100 µm i diameter) på en hydrofoba septum i en kammare (figur 1B). Tip-dip metoden möjliggjorde elektriska mätningar med mycket lägre bakgrund buller24. Våra erfarenheter med PLB25,26, tip-dip22,23,27och patch-clamp28,29,30, 31 metoder ledde oss till en ny idé att bilda lipid lipidmonolager med hjälp av principerna för den vatten-i-olja lipidens. Vi har hänvisat till detta som kontakt bubbla lipidens (CBB) metod20,32. I denna metod, snarare än hängande vattendropparna i en olja fas (figur 1D), en vatten bubbla blåses från glas pipett (med spets diameter av ungefärligt 30 µm) in i olja fas (figur 1E och 2), där den bubbla upprätthålls genom att tillämpa ett fast tryck. En enskiktslager bildar spontant på gränssnittet vatten-olja på ytan av bubblan. Sedan två bubblor är dockade genom manipulering av två glas pipetter och lipidens bildas när de två enskiktslager närmar varandra, vilket ger en jämvikt lipidens område. Storleken på bubblan styrs av intra-bubble trycket (hålla trycket) och jämväl lipidens storlek. En genomsnittlig diameter av 50 µm används ofta. Även om volymen av bubblan är liten (< 100 pL), den är ansluten till den större volymen av pipett lösningen som är i intervallet mikroliter, som utgör den bulk elektrolyt fasen.
Det finns många fördelar med att använda metoden CBB (tabell 1). Membran av olika lipid kompositioner kan produceras som en lipid lipidens bildandet teknik, och asymmetrisk membran är lättare bildas32 än de av de konventionella vikning metod33. Lipidens kan manipuleras mekaniskt, till skillnad från den konventionella PLB som endast kan böjas med ett hydrostatiskt tryck skillnaden34,35. Genom att ändra anläggningen trycket, bubblorna antingen Förstora eller förminska, leder till ökad eller minskad membran spänning32. Lipidens är mekaniskt löstagbar i enskiktslager, liknar de frysa-fraktur teknik36,37 membran i morfologiska studier, men med CBB, en manöver möjliggör upprepade lossa och fästa cykler32 . Den lilla volymen av elektrolytlösning inom bubblan tillåter effektiv fusion av kanal-färdigberett liposomer till lipidens och sannolikheten att få kanal inspelningar är mycket högre än med konventionella PLB tekniken. Liten bubbla volymen kan också snabba perfusion (inom ~ 20 ms) en gång en annan injektion pipett infogas antingen av bubblor. Till skillnad från metoden patch-clamp, när brutit, CBB membran bildas igen omedelbart och upprepade gånger, och pipetter kan användas flera gånger om dagen. Genom att integrera fördelarna med patch-clamp och PLB metoder, ger CBB en mångsidig plattform för att variera de fysikalisk-kemiska förhållandena av membranet, så att för oöverträffad studier av kanal-membran interaktioner.
Innan vi presenterar en detaljerad protokollet av CBB bildandet processen, presenteras fysikalisk bakgrund av lipidens bildandet första, som kommer att vara till hjälp för patch-låskretsar att lösa experimentella svårigheter avseende membran bildandet som påträffas.
CBB experiment ge lektioner i ytkemi vetenskap38. CBB är lik en såpbubbla som blåst från ett sugrör i luften, där jämväl, en vatten bubbla blåses in i ett organiskt lösningsmedel. Man kommer att märka att en vatten bubbla knappast är uppblåst när membran lipider inte ingår i antingen vatten bubblan eller organiska lösningsmedel. I avsaknad av sulfat lipider, ytspänningen på ett vatten-olja-gränssnitt är hög och intra-bubble trycket för att blåsa en bubbla kommer att vara hög. Detta är ett förverkligande av Laplace ekvation (ΔP = 2 γ/R, där ΔP är intra-bubble trycket, γ är ytspänningen och R är radien bubbla). När koncentrationen av lipider i antingen den organiska fasen eller elektrolytlösningen är hög, tätheten av lipider i enskiktslager ökar, som dikteras av den Gibbs adsorption isotherm (-dγ = Γjag dµjag, där Γjag är ytan överskottet av förening jag och µjag är kemiska potentialen för komponenten jag)39, leder till en lägre ytspänning och användarvänlighet bubbla bildandet. I CBB, lipidens kan observeras från en tangentiell vinkel (figur 2) och kontakt vinkeln mellan enskiktslager och lipidens är mätbara. Denna vinkel representerar en equilibrium mellan surface tensions av enskiktslager och lipidens (unga ekvation: γbi = γmo cos(θ), där γbi är lipidens spänningen, γmo är enskiktslager spänningen och θ är den kontakta vinkeln). Förändringarna i kontaktvinkel ange förändringar i lipidens spänningen, tanke på att enskiktslager spänningen utvärderas från förändringar i kontaktvinkel som en funktion av membranet potential (ung-Lippmann ekvation: γmo = Cm V2 /4 (cos (θ0) - cos (θv)), där Cm är den membran kapacitansen, V är membranpotentialen och θ0 och θv är kontakt vinklarna vid 0 och V mV, respektive)40,41 ,42. När två bubblor är tillräckligt nära, närmar de sig varandra spontant. Detta är på grund av van der Waals kraften, och vi kan visuellt Observera denna dynamiska process i CBB formation.
Ett CBB-system består av olika faser: nämligen en bulk olja fas, vatten bubblor belagd med en enskiktslager och en kontakta lipidens (figur 3). Dessa är som påminner om flera faser i en PLB, såsom lösningsmedel innehållande torus runt den lipidens och en tunn organisk fas inklämt av två enskiktslager43,44. I CBB, fasen enskiktslager är kontinuerlig med lipidens bipacksedeln och lipid molekyler diffunderar lätt mellan enskiktslager och bipacksedeln. Den enskiktslager fasen omfattar de flesta av bubbla ytan, som utgör den stora fasen som fungerar som en reservoar som lipid. Eftersom hydrofoba svansen av lipider i enskiktslager sträcker sig utåt till bulk olja fas, öppnar lipidens inredningen eller hydrofoba kärnan till bulk olja fas. En hydrofob substans som injiceras in i olja fas nära lipidens är alltså kunna lätt komma åt lipidens interiören. Detta är den membran perfusion teknik vi hade utvecklat nyligen45, som lipid sammansättningen i lipidens ändras snabbt (inom en sekund) under kanal nuvarande inspelningar. Vi hittade att kolesterolhalten i lipidens reversibelt kunde kontrolleras genom stänger kolesterol perfusionen på45. I händelse av att koncentrationen av det aktuella ämnet i enskiktslager och lipidens skiljer sig, upplösas koncentrationsgradient av den relevanta substansen omedelbart genom diffusion, som är känd som den Marangoni effekt46, 47. däremot, flip-flops över enskiktslager är långsam48,49,50.
Använder metoden CBB lipidens bildas under mångsidig fysikalisk-kemiska förhållanden, såsom en elektrolyt pH så lågt som 1 51, en salt (K+, Na+, etc.) koncentration upp till 3 M, en så hög som ±400 mV membranpotentialen och ett system temperatur på upp till 60 ° C.
Det finns flera alternativ för bildandet av CBB och införlivandet av kanal molekyler däri. För bildandet av enskiktslager i vatten-olja-gränssnittet läggs lipider antingen i ett organiskt lösningsmedel (lipid-ut metoden. Figur 4 A, 4 C) eller i en bubbla som liposomer (lipid-i metod. Figur 4 ” B, 4 D). Särskilt, tillåter lipid-i metoden bildandet av asymmetriska membran15,32. Kanal-molekyler som är lösliga i vattenlösning (t.ex., kanal-bildar peptider) läggs direkt in i den bubbla (figur 4A, B)52,53, medan kanal proteiner är beredd till liposomer, som läggs sedan in i bubblan (figur 4C, D). Häri, bildandet av CBBs av lipid-i-metoden för antingen en kanal peptid (polytheonamide B (pTB); Figur 4 A) eller ett protein (KcsA kaliumkanal, figur 4C) visas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:607px;" width="605">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">Azolectin (L-&#945;-Phosphatidylcholine, Type IV-S)</td>
			<td style="width:85px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">P3644</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:219px;">A/D Converter</td>
			<td style="width:85px;">Molecular Divices</td>
			<td style="width:124px;">Digidata1550A</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">Ag/AgCl electrode</td>
			<td style="width:85px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:124px;">64-1317</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Bath Sonicator</td>
			<td style="width:85px;">Branson</td>
			<td style="width:124px;">M1800H-J</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">Camera</td>
			<td style="width:85px;">Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:124px;">C11440-10C</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:219px;">Glass Capillary</td>
			<td style="width:85px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:124px;">30-0062</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Hepes</td>
			<td style="width:85px;">Dojindo</td>
			<td style="width:124px;">342-01375</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:219px;">Hole Slideglass</td>
			<td style="width:85px;">Matsunami Glass</td>
			<td style="width:124px;">S339929</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Inverted Microscope</td>
			<td style="width:85px;">Olympus</td>
			<td style="width:124px;">IX73</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Isolation Table</td>
			<td style="width:85px;">Herz</td>
			<td style="width:124px;">TDI-86LA(Y)2</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Micro Injenctor</td>
			<td style="width:85px;">Narishige</td>
			<td style="width:124px;">IM-11-2</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Micro Manipulator</td>
			<td style="width:85px;">Narishige</td>
			<td style="width:124px;">EMM</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Microforge</td>
			<td style="width:85px;">Narishige</td>
			<td style="width:124px;">MF-830</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Micropipette holder</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">n-Hexadecane</td>
			<td style="width:85px;">Nacalai</td>
			<td style="width:124px;">07819-32</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Patch-Clamp Amplifier</td>
			<td style="width:85px;">HEKA</td>
			<td style="width:124px;">EPC800</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">Pipette Puller</td>
			<td style="width:85px;">Sutter Instrument Co.</td>
			<td style="width:124px;">P-87</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine)</td>
			<td style="width:85px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:124px;">850457</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:219px;">POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine 
			)</td>
			<td style="width:85px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:124px;">850757</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">POPG (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) )</td>
			<td style="width:85px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:124px;">840457</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:85px;">Nacalai</td>
			<td style="width:124px;">28514-75</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Rotary Evapolator</td>
			<td style="width:85px;">Iwaki</td>
			<td style="width:124px;">REN-1000</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Succinic Acid</td>
			<td style="width:85px;">Nacalai</td>
			<td style="width:124px;">32402-05</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Vacuum Pump</td>
			<td style="width:85px;">Buchi</td>
			<td style="width:124px;">V-100</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lipid bilayer experiments with contact bubble bilayers for patch-clampers

Lipid lipidmonolager ger en unik experimentell plattform för funktionella studier av jonkanaler, vilket gör att undersökningen av kanal-membran interaktioner under olika membran lipider kompositioner. Bland dem, har den droplet gränssnitt lipidens vunnit popularitet; dock hindrar stort membran storlek inspelning av låga elektriska bakgrundsljud. Vi har etablerat en kontakt bubbla lipidens (CBB) metod som kombinerar fördelarna med planar lipid lipidens och patch-clamp metoder, såsom förmågan att variera lipid sammansättning och att manipulera lipidens mekanikerna, respektive. Med hjälp av setup för konventionella patch-clamp experiment, utföras CBB-baserade experiment lätt. I korthet en elektrolytlösning i glas pipett blåses in i ett organiskt lösningsmedel fas (hexadecane) och pipett trycket upprätthålls för att erhålla en stabil bubblornas storlek. Bubblan är spontant fodrad med en lipid enskiktslager (ren lipider eller blandade lipider), som ges från liposomer i bubblorna. Nästa, de två enskiktslager-fodrade bubblorna (~ 50 µm i diameter) på spetsen av glas pipetter är dockade för lipidens bildandet. Införsel av kanal-färdigberett liposomer bubblan leder till inkorporeringen av kanaler i den lipidens, möjliggör enkanalig pågående inspelning med en signal-brus-förhållande jämförbar med patch-clamp inspelningar. CBBs med en asymmetrisk lipid sammansättning bildas lätt. CBB förnyas flera gånger med blåser ut tidigare bubblor och bildar nya. Olika kemiska och fysiska störningar (t.ex., membran perfusion och lipidens spänningar) kan åläggas den CBBs. häri presenterar vi den grundläggande proceduren för CBB bildandet.

En typisk CBB hade en diameter av 50 µm (figur 56) och den specifika membran kapacitansen i hexadecane var 0,65 µF/cm2. Bubbelstorleken kontrollerades godtyckligt av intra-bubble trycket. När små bubblor är nödvändiga för låg ljudnivå inspelningar, bör spets diameter vara motsvarande små. Till exempel för en bubbelstorlek 50 µm i diameter, bör spets diameter vara 30 µm.
<p class="jove_content" fo:keep-together.w...

Watch this Scientific Journal Video about Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers at JoVE.com

Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers

Här presenterar vi ett protokoll för bildandet av lipid lipidmonolager med en kontakt bubbla lipidens metod. En vatten bubbla blåses in i ett organiskt lösningsmedel, whereby en enskiktslager bildas i vatten-olja-gränssnittet. Två pipetter är manipulerade docka bubblorna för att bilda en lipidens.

Lipid lipidens experiment med kontakt bubbla lipidmonolager för Patch-låskretsar

Lipid bilayers provide a unique experimental platform for functional studies of ion channels, allowing the examination of channel-membrane interactions ...

Metoden Contact Bubble Bilayer är en alternativ teknik för konventionella Lipid Bilayers. och denna metod tillåter mer mångsidig vibration genom membranet. CBB-metoden integrerar fördelarna med Planar Lipid Bilayer och patch clamp-metoden.Som en lipid bilayer teknik en CBB med en godtycklig lipidkomposition kan bildas. Vi har utvecklat en CBB för enkanalsströminspelningar med hög signal-till bruskvot. Denna metod tillåter sorter av membranvibrationer och erbjuder en stor typplattform till kanalmembrangränssnittet.Alla har upplevt att blåsa en såpbubbla. Liknande manövrar tas för CBB-bildande genom att manuellt finjustera det applicerade trycket snarare än att blåsa genom munnen. Öva och njut av CBB.Till att vara detta förfarande skingra fosfolipider i kloroform vid en önskad koncentration i en rund bottenkolv. Placera fosfolipidlösningen på en roterande förångare som är ansluten till en gasbehållare för kväve. Rotera kolven under kväveflödet vid rumstemperatur tills en tunn fosfolipidfilm visas.Placera nästa den öppna kolven till en exsiccator som är ansluten till en vakuumpump. Använda vakuumpumpen aspirera insidan av desiccator i flera timmar för att avlägsna kloroformen noggrant. Därefter tillsätt en lämplig volym elektrolytlösning till kolven och suspendera fosfolipiden för att få en två milligrmas per milliliter fosfolipid suspension.Sonciate suspensionen i 20 till 30 sekunder med hjälp av ett bad sonicator för att få en flerskiktad vesikel suspension. För framställning av proteoliposomer som innehåller jonkanalproteiner, tillsätt en proteinlösning till den flerskiktade vesikelupphängningen. Och sonikera i flera sekunder med hjälp av badet sonicator.För att förbereda stora borrglaspipetter, placera en glaskammar i en pipettdragare och fabricera mikropipettet med en fin avsmalnande spets genom två steg dra. Ställ sedan mikropipettet på en mikrosmidja och kontakta toppen på mikropipettet till en platinafilament vid den avsmalnande delen med en diameter på 30 till 50 mikrometer. Värm glödtråden en kort stund och stäng genast av den.Använda destillerat vatten och etanol rengöra ytan av glaset bilden med en grund brunn. Applicera därefter silikoniseringsreagensen på glasglaset och låt reagensen torka helt i luften. Placera sedan glasrutschkanan på scenen av ett inverterat mikroskop.Lägg till 100 mikroliter av hexadecane i den grunda brunnen av silikoniserad glasrutschkana. Med hjälp av en tuberkulinspruta fyll elektrolytlösningen upp till halva längden av mikropipette. Nästa uppsättning mikropipette på mikropipette hållaren med tryckporten, så att silver / silver klorid tråd elektrod att suga i pipettelektrolytlösning.Anslut en av mikropipettehållarna till huvudsteget i en patchklämsteg och den andra till den elektriska marken. Därefter ansluta en microinjector till trycket porten av micropipette innehavaren. Justera mikropipettet till en lämplig position ovanför stadiet av ett inverterat mikroskop med hjälp av mikromanipulatorn.För att justera elektrodförskjutningspotentialen placerar du en mikroliter av samma elektrolytlösning som används för att fylla mikropipettet på den plana ytan runt glasglasets grunda brunn för att skapa en elektrolytkupol. Blötlägg spetsen på båda mikropipettes i elektrolytkupolen. Efteråt justera elektrod offset potential av patch clamp förstärkare.För att dra liposomlösningen från spetsen, tillsätt en mikroliter av liposomlösning på den plana ytan runt rutiga brunnen i diaglaset. Nästa plats toppen av mikropipettet i liposomen som innehåller kupol. Aspirera den liposom som innehåller lösning med hjälp av mikroinjektorn.Upprepa proceduren för den andra mircopipette för aspirerande kanal rekonstituerade liposomer. Placera nu mikropipettets i hexadecanen i den grunda brunnen. Blås en vattenbubbla långsamt genom att öka trycket tills bubblan når önskad storlek och behålla samma tryck därefter.Kasta bubblan genom att skicka spetsen genom olje-luft gränssnittet om det är svårt att hålla storleken på bubblan stabil. Upprepa procedurerna tills två stabila bubblor bildas. Upprätta en kontakt mellan de två bubblorna.Finjustera trycket för att behålla bubbelstorleken, eftersom storleken gradvis kan ändras även vid det konstanta tryck inom bubblan. Ställ in membranet potential till lämpligt värde med hjälp av patch anspråk förstärkare och vänta på kanalströmmen att växa fram. För stabil lipid bilayerbildning är det viktigt att rengöra blotters.Glaskafillär eller pipetterepreparering bör tvättas noggrant och undvika kontamination av tvättmedelsmolekylerna. När CBB hade bildat kanalmolekylerna antingen i vattenlösning eller i liposomen sattes spontant in i bilayer inom loppet av några till dussintals minuter. Infogningar av kanalerna bekräftades av steg klokt ökningen av nuvarande amplitud under den tillämpade membran potential.En bilayer som bildas av CBB-metoden kan upplösas i två enskikt. PTB-kanalströmmen uppstod direkt efter att de två monolayersna fästs. Och strömmen blev större, som är av kontakt ökande amplituden av strömmen synkroniserades med det lossa fästa manipulering av CBBEN.Om antalet blåsa outs av bubblor ökar lipidkoncentrationen i vattenlösningen minskar och monolayer bildas inte. Försök sedan att lätta på trycket på liposomsektionen. När CBB-formationen och kanalrekonstitutionen är etablerad kan du försöka variera kompositioner av vattenlösning och membran via profusion eller injicera en hydrofil eller hydrofoba ämnen.CBB-metoden har öppnat mångsidiga sätt att utforska kanal-membran-samspel.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Neuroscience

Unit 1

Channels and the Electrical Properties of Membranes

SCIENTISTS IN ACTION

Functional Mapping with Simultaneous MEG and EEG

Funktionell kartläggning med samtidig MEG och EEG

We use magnetoencephalography (MEG) and electroencephalography (EEG) to locate and determine the temporal evolution in brain areas involved in the ...

Combining Computer Game-Based Behavioural Experiments With High-Density EEG and Infrared Gaze Tracking

Kombinera Datorspel-Based beteendevetenskap experiment med High-Density EEG och Infraröd Gaze spårning

Experimental paradigms are valuable insofar as the timing and other parameters of their stimuli are well specified and controlled, and insofar as they ...

Examining Local Network Processing using Multi-contact Laminar Electrode Recording

Undersöka Lokalt nätverk Behandling med hjälp av Multi-kontakt laminärt elektrod inspelning

Cortical layers are ubiquitous structures throughout neocortex1-4 that consist of highly recurrent local networks. In recent years, significant progress ...

Closed-loop Neuro-robotic Experiments to Test Computational Properties of Neuronal Networks

Slutna Neuro-robot experiment för att testa Computational Egenskaper för neurala nätverk

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation ...

SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy

SNARE-medierad fusion av Single proteoliposomer med tjudrad bilayers stöds i en mikroflödes Flow Cell övervakas av polariserat TIRF mikroskopi

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. ...

Fabrication of High Contact-Density, Flat-Interface Nerve Electrodes for Recording and Stimulation Applications

Tillverkning av hög Kontakt densitet Platt-Interface Nerv Elektroder för inspelning och Stimulation Applications

Many attempts have been made to manufacture multi-contact nerve cuff electrodes that are safe, robust and reliable for long term neuroprosthetic ...

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Förbereda färska Retinal skivor från vuxna zebrafiskar för Ex Vivo Imaging experiment

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding ...

Conducting Hyperscanning Experiments with Functional Near-Infrared Spectroscopy

Genomföra Hyperscanning experiment med funktionella nära-infraröd spektroskopi

Concurrent brain recordings of two or more interacting persons, an approach termed hyperscanning, are gaining increasing importance for our understanding ...

Using Neuron Spiking Activity to Trigger Closed-Loop Stimuli in Neurophysiological Experiments

Använda neuron Tillspikning aktivitet för att utlösa slutna kretsar stimuli i neurofysiologiska experiment

Closed-loop neurophysiological systems use patterns of neuronal activity to trigger stimuli, which in turn affect brain activity. Such closed-loop systems ...

Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments

Generation oligodendrocyter och Oligodendrocyte-Konditionerat medium för samkulturexperiment

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials ...