Name: lipid bilayer experiments with contact bubble bilayers for patch-clampers
Uploaded: 2019-01-16T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers at JoVE.com

Yazarlar Mariko Yamatake ve Masako Takashima teknik yardım için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser desteklenmiştir kısmen KAKENHI tarafından grant 16 H 00759 ve 17 H 04017 (SO) numaraları.

1. lipozomlar hazırlayın
<ol><li>Fosfolipitler (Örneğin, 10 mg toz) (Örneğin, 10 mg/mL) istenen bir konsantrasyon, kloroform dağıtmak.</li>
	<li>Kloroform buharlaşır.<ol>
<li>Rotary Evaporatör üzerinde ( Tablo malzemelerigörmek) N2 gaz silindir bağlı bir yuvarlak alt şişesi ve fosfolipid çözümde bir yer. Bir ince fosfolipid film (~ 30 dakika sonra) görünene kadar şişesi N2 akışı oda sıcaklığında altında döndürün.</li>
		<li>Bir ...

CBB yöntemi lipid bilayer oluşumu monolayer20ile kaplı bir petrol su damlacığı prensibi temel alır. Teknik olarak, CBBs şekillendirme için kolay, özellikle yama-kelepçe araştırmacılar, cam Mikropipetler manipüle yetkin olan işlemlerdir. İki pipet manipülatörler microinjectors ile kullanılabilir olduğunda yama kelepçe için elektrofizyolojik Kurulumu kolayca CBB içinde kullanılır. CBB geleneksel PLB halefi olduğundan, öte yandan, fizikokimyasal bilgi büyük miktarda biri...

İyon kanalları, hücre zarının sadece destekleyici bir malzeme ama bir ortak iyon akı üretmek için değildir. İşlevsel olarak, membran hangi iyon kanalları katıştırılmış bir elektrik yalıtkan ve tüm hücre zarlarında istirahat membran potansiyeli ile öğretilir olmasıdır. Geleneksel olarak, rasgele bir membran potansiyel bir dış devre hangi kanallardan elektrik akımı ölçüldü getirilmedi. İyon akı farklı membran potansiyeli, bu kantitatif değerlendirilmesi iyon-seçici nüfuz ve gating işlevleri1,2gibi bu kanallar moleküler özelliklerini ortaya koymuştur. Membran için iyon kanallarının fonksiyonel çalışmalar hücre zarı veya lipid bilayer membran bir platformdur. Tarihsel olarak, tek kanallı elektrik geçerli kayıtları ilk lipid bilayers3,4' te gerçekleştirilen ve ilgili teknikleri (Şekil 1A yama-kelepçe yöntemi gibi hücre zarı için geliştirilmiştir )5,6. O zamandan beri bu iki teknik ayrı ayrı farklı amaçlar (Şekil 1)7,8için evrim geçirmiş.
Membran lipidler ve bilayer membranlar araştırma yapısı ve fonksiyonu kanal proteinlerin desteklemedeki rollerini için odak noktası şu anda vardır. Bu nedenle, hazır bilayers lipid bileşiminde değişir yöntemlerden yüksek talep olduğunu. Lipid bilayer oluşumu yöntemleri düzlemsel lipid bilayer (PLB)8,9,10,11, petrol su damlacığı bilayer12ve damlacık arabirimi bilayer (DIB)13, gibi 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 teknikleri (Şekil 1) altında lipit kompozisyonları20farklı kanal işlevi incelenmesi için bir fırsat sağlayan ortak seçeneklerdir. DIB geleneksel PLB üretmek Teknik olarak çok daha kolay olsa da, DIB büyük boy tek kanallı geçerli kayıtları her zamanki ölçekli gürültülerinden ile çalışmak için uygulamak yama-clampers için bir engel oluşturmuştur (< 100 pS).
Arka plan gürültü sorunu çözecek, bilayer alan indirilmelidir. Bu sorun tekrarlar için lipid bilayers (Şekil 1) elektrofizyolojik teknikleri gelişmekte olan tarihin hatırlıyor. İlk günlerde, bir pipet (İpucu daldırma yöntemi; ucunda bir küçük boyutlu bilayer (çapı 1-30 µm) kuruldu Resim 1 C) 21 , 22 , 23kullanmak yerine, bir müstakil bilayer (çapı ~ 100 µm) (resim 1B) bir odasında bir hidrofobik septum üzerinde. Çok alt arka plan gürültü24ile elektriksel ölçümler için izin ucu daldırma yöntemi. Tecrübelerimizi PLB25,26, ucu daldırma22,23,27ve yama-kelepçe28,29,30, 31 yöntemleri bize petrol su bilayer ilkeleri kullanarak lipid bilayers oluşturan bir fikir yol açtı. Bu kişi kabarcık bilayer (CBB) yöntemi20,32atıfta bulunmuşlardır. Bu yöntemde, petrol aşamasında (Şekil 1D), su damlaları asılı yerine su balonu Cam Pipet (ile uç çapı yaklaşık 30 µm) üzerinden petrol faz (Şekil 1E ve 2), nereye attı kabarcık sabit bir basınç uygulayarak korunur. Kabarcık bir monolayer formları kendiliğinden vasıl yüzey su-yağ arayüzey. Sonra iki kabarcıklar iki Cam pipetler manipülasyonu yerleştirilmiş ve iki monolayers, bir denge bilayer alanı verimli yaklaşım olarak bilayer oluşturulur. Kabarcık boyutu (basınç holding) içi-balon basıncı ve bilayer boyutu tarafından aynı şekilde denetlenir. Bir ortalama çapı 50 µm sık sık kullanılır. Kabarcık hacmi küçük olmasına rağmen (< 100 pL), toplu elektrolit faz oluşturan microliter aralığında pipet çözüm hacmin daha büyük bağlı.
CBB yöntemi (Tablo 1) kullanmak için birçok faydası vardır. Bir lipid bilayer oluşumu Teknik olarak çeşitli lipit kompozisyonları zarı üretilebilir ve daha geleneksel katlama yöntemi33tarafından asimetrik membran daha kolay kurulan32 vardır. Bilayer mekanik olarak, sadece bir hidrostatik basınç farkı34,35ile bükülebilir geleneksel PLB aksine manipüle edilebilir. Holding basıncı değiştirerek, baloncuklar genişletmek ya da daraltmak, artan veya azalan membran gerginlik-32önde gelen. Bilayer içine monolayers, membran morfolojik çalışmalarda, donma-kırık tekniği36,37 benzer mekanik olarak ayrılabilir ama CBB ile ayırma ve iliştirme döngüleri32 tekrarlanan bir manevra sağlar . Ve kanal kayıtları alma ihtimali çok geleneksel PLB tekniği ile daha yüksek kanal yeniden düzenlendi lipozomlar verimli füzyon bilayer içine küçük hacimli balonu içinde elektrolit çözüm sağlar. Küçük kabarcık birim aynı zamanda hızlı perfüzyon (içinde ~ 20 ms) bir kez başka bir enjeksiyon sağlar. pipet ya baloncuklar eklenir. Yama-kelepçe yöntemi, aksine kırık sonra bir CBB membran hemen ve art arda yeniden oluşturulur ve pipetler günde birkaç kez kullanılabilir. Yarar-in belgili tanımlık yama-kelepçe ve PLB yöntemleri entegre ederek, CBB membran, fizikokimyasal şartları değiştirmek için çok yönlü bir platform kanal-membran etkileşimleri benzeri görülmemiş çalışmaları için izin sağlar.
CBB oluşumu işleminin ayrıntılı bir protokol sunmadan önce bilayer oluşumu fizikokimyasal arka plan membran oluşumu ile ilgili deneysel zorlukları gidermek yama-clampers için yardımcı olacaktır ilk sunulur Bu karşılaşılmaktadır.
CBB deneyler yüzey kimyası bilim38dersleri vermek. CBB sabun köpüğü nerede aynı şekilde, bir su balonu organik bir çözücü attı havaya, pipet havaya benzer. Bir membran lipidler su balonu veya organik çözücü dahil değildir zaman su balonu pek şişirilmiş fark edeceksiniz. Amfipatik lipidler yokluğunda bir su-yağ arabirimi, yüzey gerilimi yüksek ve bir balon üfleme için Intra-balon basıncı yüksek olacaktır. Bu bir Laplace denklemi hayata geçirilmesidir (ΔP 2 γ/nerede ΔP içi-balon basıncı, γ olduğunu yüzey gerilimi ise R kabarcık yarıçapı R, =). Lipidler konsantrasyonu Organik faz veya elektrolit çözüm yüksek olduğunda, lipitler monolayer yoğunluğu, Gibbs adsorpsiyon İzoterm tarafından dikte edildiği gibi artar (-dγ = Γben yüzey aşırı nerede Γben dµben, Ben veben µ bileşiktir bileşen kimyasal potansiyel ben)39önde gelen bir alt yüzey gerilimi ve kabarcık oluşumu kolaylığı,. CBB bilayer bir teğet açı (Şekil 2) gözlenebilir ve ölçülebilir monolayer ve bilayer arasında iletişim açıdır. Bu açıyı monolayer surface tensions ve bilayer arasında bir denge ifade eder (genç denklem: γbı γmo cos(θ), nerede γbı var bilayer gerginlik, γmo monolayer gerilim ise θ temas açısı =). Monolayer gerginlik temas açısı değişikliklerden membran potansiyel bir fonksiyonu olarak değerlendirilir verilen bu değişiklikler bilayer gerginlik temas açısı değişimler gösterir (genç-Lippmann denklem: γmo = Cm V2 /4 (cos (θ0) - cos (θv)), nerede Cm şey zar kapasitans, V potansiyel membran ve θ0 ve θv 0 ve V mV, iletişim açılarla sırasıyla)40,41 ,42. İki kabarcıklar yeterince yakın olduğunda, onlar birbirlerini kendiliğinden yaklaşım. Bu van der Waals kuvvetleri nedeniyle ve görsel olarak CBB oluşumu dinamik bu süreçte gözlemleyebilirsiniz.
CBB sistem ayrı aşamadan oluşmaktadır: Yani, bir toplu petrol aşamasında, su kabarcıkları bir monolayer ve ekibine ulaşarak bilayer (Şekil 3) ile kaplı. Birden fazla aşama çözücü içeren simit bilayer faz ve bir ince organik faz tarafından iki monolayers43,44sandviç gibi bir PLB gözlenen anımsatan bunlar. CBB monolayer aşamasıdır bilayer broşür ile sürekli ve lipid molekülleri kolayca monolayer ve broşür arasında yaygın. Monolayer faz lipid su deposu olarak hizmet vermektedir büyük aşama oluşturan kabarcık yüzeyinin en kapsar. Çünkü monolayer lipidler hidrofobik kuyruğunun dışa toplu petrol aşamaya uzanır, bilayer iç veya hidrofobik çekirdeğin toplu petrol aşamaya açar. Böylece, bilayer yakın yağ fazına enjekte bir hidrofobik kolayca bilayer iç erişmeye devam edebilirsiniz bir maddedir. Son zamanlarda hangi bilayer lipid bileşiminde hızla (bir saniye içerisinde) tek kanallı geçerli kayıtları sırasında değiştirilir45, gelişen membran perfüzyon tekniğidir. Bilayer kolesterol içeriği geri dönülebilir olarak kolesterol perfüzyon ve45kapalı geçiş yaparak denetlenebilecek olduğunu bulduk. Monolayer ve bilayer ilgili madde konsantrasyonu farklı olay nedeniyle ilgili maddenin konsantrasyon gradyanı hemen Marangoni etkisi46, bilinen difüzyon tasfiye edilir 47. öte yandan, parmak arası terlik monolayers arasında yavaş48,49,50vardır.
CBB yöntemini kullanarak, bilayer 1 düşük bir elektrolit pH gibi çok yönlü fizikokimyasal koşullarda oluşturulur 51, 3 M kadar tuz (K+, Na+, vb) konsantrasyon, bir membran potansiyeli ±400 mV yüksek ve bir sistem ilâ 60 ° c sıcaklık
Orada CBB oluşumu için çeşitli seçenekler ve kanal moleküllerin birleşme orada. Su-yağ arayüzüne monolayer oluşumu için lipitler ya da organik bir çözücü (lipit-out yöntemi; eklenir Şekil 4 A, 4 C) veya bir kabarcık olarak lipozomlar (lipit-Yöntem; Şekil 4 B, 4 D). Özellikle, lipid Yöntem asimetrik membran15,32oluşumu için sağlar. Oysa kanal proteinlerin içine yeniden kanal molekülleri sulu çözüm (Örneğin, kanal oluşturmayan peptidler) çözünür doğrudan kabarcık (Şekil 4A, B)52,53, eklenir lipozomlar, o zaman (Şekil 4C, D) kabarcık eklenir. Burada, CBBs oluşumu için ya bir kanal peptid (polytheonamide B (pTB); lipid yöntemi ile Şekil 4 A) veya bir protein (KcsA Potasyum kanal, Şekil 4C) gösterilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:607px;" width="605">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">Azolectin (L-&#945;-Phosphatidylcholine, Type IV-S)</td>
			<td style="width:85px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">P3644</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:219px;">A/D Converter</td>
			<td style="width:85px;">Molecular Divices</td>
			<td style="width:124px;">Digidata1550A</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">Ag/AgCl electrode</td>
			<td style="width:85px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:124px;">64-1317</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Bath Sonicator</td>
			<td style="width:85px;">Branson</td>
			<td style="width:124px;">M1800H-J</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">Camera</td>
			<td style="width:85px;">Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:124px;">C11440-10C</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:219px;">Glass Capillary</td>
			<td style="width:85px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:124px;">30-0062</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Hepes</td>
			<td style="width:85px;">Dojindo</td>
			<td style="width:124px;">342-01375</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:219px;">Hole Slideglass</td>
			<td style="width:85px;">Matsunami Glass</td>
			<td style="width:124px;">S339929</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Inverted Microscope</td>
			<td style="width:85px;">Olympus</td>
			<td style="width:124px;">IX73</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Isolation Table</td>
			<td style="width:85px;">Herz</td>
			<td style="width:124px;">TDI-86LA(Y)2</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Micro Injenctor</td>
			<td style="width:85px;">Narishige</td>
			<td style="width:124px;">IM-11-2</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Micro Manipulator</td>
			<td style="width:85px;">Narishige</td>
			<td style="width:124px;">EMM</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Microforge</td>
			<td style="width:85px;">Narishige</td>
			<td style="width:124px;">MF-830</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Micropipette holder</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">n-Hexadecane</td>
			<td style="width:85px;">Nacalai</td>
			<td style="width:124px;">07819-32</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Patch-Clamp Amplifier</td>
			<td style="width:85px;">HEKA</td>
			<td style="width:124px;">EPC800</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">Pipette Puller</td>
			<td style="width:85px;">Sutter Instrument Co.</td>
			<td style="width:124px;">P-87</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine)</td>
			<td style="width:85px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:124px;">850457</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:219px;">POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine 
			)</td>
			<td style="width:85px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:124px;">850757</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:219px;">POPG (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) )</td>
			<td style="width:85px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:124px;">840457</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:85px;">Nacalai</td>
			<td style="width:124px;">28514-75</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Rotary Evapolator</td>
			<td style="width:85px;">Iwaki</td>
			<td style="width:124px;">REN-1000</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Succinic Acid</td>
			<td style="width:85px;">Nacalai</td>
			<td style="width:124px;">32402-05</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Vacuum Pump</td>
			<td style="width:85px;">Buchi</td>
			<td style="width:124px;">V-100</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lipid bilayer experiments with contact bubble bilayers for patch-clampers

Lipid bilayers iyon kanalları, kanal-membran etkileşimleri çeşitli membran altında incelenmesi lipit kompozisyonları sağlayan fonksiyonel çalışmalar için benzersiz bir deneysel platform sağlar. Bunlar arasında damlacık arabirimi bilayer popülerlik kazanmıştır; Ancak, büyük zar boyutu düşük elektrik arka plan gürültü kayıt engeller. Düzlemsel lipid bilayer avantajlarını birleştiren bir iletişim kabarcık bilayer (CBB) yöntemi ve lipid bileşimi değişir ve bilayer mekanik, sırasıyla işlemek olanağı gibi yama-kelepçe yöntemleri kurduk. Kurulumu geleneksel yama-kelepçe deneyler için kullanarak, deneyler CBB tabanlı kolayca gerçekleştirilebilir. Kısaca, bir cam pipet elektrolit çözümde bir organik çözücü faz (hexadecane) attı ve pipet basınç istikrarlı kabarcık boyutu elde etmek için korunur. Kabarcık kendiliğinden lipozomlar kabarcıkları üzerinden sağlanan bir lipid monolayer (saf yağlar veya karışık lipidler) ile kaplı olduğu. Daha sonra iki monolayer kaplı kabarcıklar (~ 50 µm çapında) Cam pipetler ucundaki bilayer oluşumu için yerleştirilmiş. Kanal yeniden düzenlendi lipozomlar giriş kabarcık içine bırakmak için tek kanallı geçerli kaydı bir sinyal-gürültü oranı ile yama-kelepçe kayıtları karşılaştırılabilir bilayer kanallarında birleşme yol açar. CBBs bir asimetrik lipid bileşimi ile kolayca meydana gelir. CBB art arda önceki kabarcıklar üfleme ve yenilerini şekillendirme yenilenir. (Örneğin, membran perfüzyon ve bilayer gerginlik) çeşitli kimyasal ve fiziksel tedirginlikler CBBs. İşbu üzerinde empoze edilebilir, biz temel yordamı CBB oluşumu için mevcut.

Tipik bir CBB çapı 50 µm (Şekil 56) ve hexadecane belirli membran kapasitans 0.65 µF/cm2. Kabarcık boyutu keyfi içi-balon basıncı tarafından kontrol ediliyordu. Küçük kabarcıklar düşük gürültü kayıtları için gerekli olduğunda, uç çapı buna küçük olmalıdır. Örneğin, çapı 50 µm kabarcık boyutunun için uç çapı 30 µm olması gerekir.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1"...

Watch this Scientific Journal Video about Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers at JoVE.com

Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers

Burada, bir kişi kabarcık bilayer yöntemiyle lipid bilayers oluşumu için bir iletişim kuralı mevcut. Mademki bir monolayer su-yağ arayüzü oluşan organik bir çözücü içine su balonu patladı. İki pipetler bir bilayer oluşturmak için ve baloncuklar sabitlemek için manipüle edilir.

Lipid Bilayer deneyler ile iletişim balonu Bilayers yama-Clampers için

Lipid bilayers provide a unique experimental platform for functional studies of ion channels, allowing the examination of channel-membrane interactions ...

Temas Kabarcık Bilayer yöntemi geleneksel Lipid Bilayers için alternatif bir tekniktir. ve bu yöntem membran üzerinden daha çok yönlü titreşim sağlar. CBB yöntemi Düzlemsel Lipid Bilayer ve yama kelepçe yönteminin faydalarını entegre eder.Bir lipid çift katmanlı teknik olarak rasgele lipid bileşimi ile bir CBB oluşturulabilir. Yüksek sinyal-gürültü oranına sahip tek kanallı akım kayıtları için bir CBB geliştirdik. Bu yöntem membran titreşim çeşitleri sağlar ve kanal membran arayüzü için geniş bir tip platform sunuyor.Herkes sabun köpüğü üfleme yi yatmıştır. Benzer manevralar ağızdan üfleme yerine uygulanan basıncı manuel olarak ince ayarlayarak CBB oluşumu için alınır. Pratik ve CBB keyfini çıkarın.Bu işlem olmak için yuvarlak bir alt şişede istenilen konsantrasyonda kloroform fosfolipidler dağıtmak. Fosfolipid çözeltisini bir azot gazı silindirine bağlı bir döner evaporatörüzerine yerleştirin. İnce bir fosfolipid film görünene kadar oda sıcaklığında azot akışı altında şişedöndürün.Sonraki yerde bir vakum pompası bağlı bir kurutucu içine açık şişe. Vakum pompası kullanarak iyice kloroform kaldırmak için birkaç saat için kurutucu iç aspire. Daha sonra şişeye uygun miktarda elektrolit çözeltisi ekleyin ve mililitre fosfolipid süspansiyon başına iki miligrmas elde etmek için fosfolipid askıya alın.Çok katmanlı vezikül süspansiyon elde etmek için bir banyo sonicator kullanarak 20 ila 30 saniye için süspansiyon sonciate. Iyon kanal proteinleri içeren proteolipozomların hazırlanması için, çok katmanlı vezikül süspansiyon bir protein çözeltisi ekleyin. Ve banyo sonicator kullanarak birkaç saniye sonicate.Büyük delikli cam pipetler hazırlamak için, bir pipet çekmecebir cam kılcal yerleştirin ve iki adım çekerek ince konik ucu ile mikro pipet imal. Daha sonra mikro pipeti mikro bir forge üzerine ayarlayın ve mikropipetin ucunu 30 ila 50 mikrometre çapında konik kısımdaki platin iplikle tulaşın. Filamenti kısa bir süre ısıtın ve hemen kapatın.Distile su ve etanol kullanarak sığ bir kuyu ile cam slayt yüzeyini temizleyin. Daha sonra cam kaydırak üzerine silikonlaştırıcı reaktif uygulayın ve reaktif tamamen havada kurumasını bekleyin. Sonra ters bir mikroskop sahnesine cam slayt yerleştirin.Silikonlu cam slayt sığ kuyuiçine heksadecane 100 mikrolitre ekleyin. Bir tüberkülin şırınga kullanarak mikropipetin yarısına kadar elektrolit çözeltisi doldurun. Daha sonra mikropipeti basınç portlu mikropipet tutucuya ayarlayın ve gümüş/gümüş klorür telelektrotun pipet elektrolit çözeltisine batırMasını sağlar.Mikropipet tutuculardan birini yama kelepçesi amplifikatörünün baş aşamasına, diğerini de elektrik zeminine bağlayın. Daha sonra mikropipet tutucunun basınç portuna bir mikroenjektör bağlayın. Mikropipeti, mikromanipülörü kullanarak ters bir mikroskop un sahnesinin üzerinde uygun bir konuma ayarlayın.Elektrot ofset potansiyelini ayarlamak için, bir elektrolit kubbe oluşturmak için cam slayt sığ kuyu etrafında düz yüzeyüzerinde mikropipet doldurmak için kullanılan aynı elektrolit çözeltisinin bir mikrolitre yerleştirin. Her iki mikropipetin ucunu elektrolit kubbesinde ıslatın. Daha sonra yama kelepçesi amplifikatörünün elektrot ofset potansiyelini ayarlayın.Ucundan lipozom çözeltisi çizmek için, slayt cam sığ kuyu etrafında düz yüzeye lipozom çözeltisi bir mikrolitre ekleyin. Sonraki yer lipozom kubbe içeren mikropipet ucu. Mikroenjektör kullanarak lipozom içeren çözeltiyi aspire edin.Kanal yeniden lipozomlar yeniden spirating için diğer mircopipette için prosedürü tekrarlayın. Şimdi sığ kuyuda heksadecane içinde mikropipet yerleştirin. Kabarcık istenilen boyuta ulaşana kadar basıncı artırarak yavaş yavaş bir su kabarcığı darbe ve bundan sonra aynı basıncı korumak.Kabarcığın boyutunu sabit tutmak zorsa, yağ-hava arabiriminden ucu geçirerek kabarcığı atın. İki kararlı kabarcık lar oluşana kadar yordamları tekrarlayın. Iki kabarcıklar arasında bir temas kurun.Boyutu yavaş yavaş sabit kabarcık içi basınç bile değişebilir, çünkü kabarcık boyutunu korumak için basınç ince ayar. Yama talep amplifikatörü kullanarak membran potansiyelini uygun değere ayarlayın ve kanal akımının ortaya çıkmasını bekleyin. Kararlı lipid çift katmanlı oluşumu için lekeleri temizlemek için gereklidir.Cam kılcal damar veya pipet hazırlama iyice yıkanmalı ve deterjan molekülleri tarafından kontaminasyon önlenmelidir. CBB kanal moleküllerini oluşturduktan sonra ya sulu çözeltide ya da lipozomda birkaç ila düzinelerce dakika içinde çift katmanlı içine kendiliğinden yerleştirildi. Kanalların eklemeleri, uygulanan membran potansiyeli altında mevcut genliğin adım adım artması yla doğrulandı.CBB yöntemi ile oluşturulan bir çift katmanlı iki tek katmanlı parçalanabilir. PTB kanal akımı iki tek katmanlı taktıktan hemen sonra ortaya çıktı. Ve temas genliği arttıkça akım daha büyük oldu akım CBB'nin detach eklemek manipülasyonu ile senkronize edildi.Kabarcıkların sayısı patlarsa sulu çözeltideki lipid konsantrasyonu azalır ve monolayer oluşmaz. Sonra lipozom bölümünde baskıyı hafifletmeye çalışın. CBB oluşumu ve kanal reconstitution kurulduktan sonra profüzyon veya hidrofilik veya hidrofobik maddeler enjekte yoluyla sulu çözelti ve membran bileşimlerini değiştirmek için deneyebilirsiniz.CBB yöntemi kanal membran interplays keşfetmek için çok yönlü yollar açmıştır.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Neuroscience

Unit 1

Channels and the Electrical Properties of Membranes

SCIENTISTS IN ACTION

Functional Mapping with Simultaneous MEG and EEG

Eşzamanlı MEG ve EEG Fonksiyonel Haritalama

We use magnetoencephalography (MEG) and electroencephalography (EEG) to locate and determine the temporal evolution in brain areas involved in the ...

Combining Computer Game-Based Behavioural Experiments With High-Density EEG and Infrared Gaze Tracking

Birleştiren Bilgisayar Oyun-Tabanlı Yüksek Yoğunlukta EEG ve Kızılötesi Gaze Takip Davranışsal deneyler

Experimental paradigms are valuable insofar as the timing and other parameters of their stimuli are well specified and controlled, and insofar as they ...

Examining Local Network Processing using Multi-contact Laminar Electrode Recording

Multi-contact kullanarak Yerel Ağ İşleme incelenmesi Laminer Elektrot Kayıt

Cortical layers are ubiquitous structures throughout neocortex1-4 that consist of highly recurrent local networks. In recent years, significant progress ...

Closed-loop Neuro-robotic Experiments to Test Computational Properties of Neuronal Networks

Kapalı döngü Nöro-robotik Deneyler Nöronal Ağları Hesaplamalı Properties Test

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation ...

SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy

Polarize TIRF Mikroskopi tarafından İzlenen mikroakışkan Akış Hücredeki Gergin Desteklenen Bilayers Tek Proteoliposomes ve tuzak aracılı Fusion

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. ...

Fabrication of High Contact-Density, Flat-Interface Nerve Electrodes for Recording and Stimulation Applications

Kayıt ve Stimülasyon Uygulamaları için Yüksek İletişim-Yoğunluk Fabrikasyon, Düz Arayüz Sinir Elektrotlar

Many attempts have been made to manufacture multi-contact nerve cuff electrodes that are safe, robust and reliable for long term neuroprosthetic ...

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Ex Vivo deneyler görüntüleme için yetişkin Zebra balığı üzerinden hazırlanması taze retina dilimleri

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding ...

Conducting Hyperscanning Experiments with Functional Near-Infrared Spectroscopy

Hyperscanning deneyler fonksiyonel yakın kızılötesi spektroskopi ile

Concurrent brain recordings of two or more interacting persons, an approach termed hyperscanning, are gaining increasing importance for our understanding ...

Using Neuron Spiking Activity to Trigger Closed-Loop Stimuli in Neurophysiological Experiments

Nörofizyolojik Deneylerde Kapalı Döngü Uyaranlarını Tetiklemek Için Nöron Spiking Aktivitesinin Kullanılması

Closed-loop neurophysiological systems use patterns of neuronal activity to trigger stimuli, which in turn affect brain activity. Such closed-loop systems ...

Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments

Oligodendrocytes ve Oligodendrocyte-Ko-Kültür Deneyleri için Şartlı Orta Üretimi

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials ...