Name: real time detection of in vitro tumor cell apoptosis induced by cd8+ t cells to study immune suppressive functions of tumor-infiltrating myeloid cells
Uploaded: 2019-01-29T12:30:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells at JoVE

وأيد هذا العمل المنح المقدمة من مؤسسة ويلكوم ترست (101067/Z/13/Z (برنامج العمل المشترك)، 109657/Z/15/Z (المعارف التقليدية)، 615KIT/J22738 (المعارف التقليدية)، المملكة المتحدة)، ولجنة نهر الميكونج (MR/N022556/1 (برنامج العمل المشترك، المعارف التقليدية)، المملكة المتحدة). شركة نفط الشمال العراقية ودس الاعتراف بدعم من "المظهرية فحص مركز فينوميكس اكتشاف المبادرة الوطنية" والمملكة المتحدة بحوث السرطان (NOC)

<ol>
	<li>Barry, M., Bleackley, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+T+lymphocytes:+all+roads+lead+to+death.">Cytotoxic T lymphocytes: all roads lead to death.</a> Nature Reviews in Immunology. 2, 401-409 (2002).</li><li>Durgeau, A., Virk, Y., Corgnac, S., Mami-Chouaib, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+targeting+CD8+T-cell+immunity+for+more+effective+cancer+immunotherapy.+Frontiers+in+Immunology.">Recent advances in targeting CD8 T-cell immunity for more effective cancer immunotherapy. Frontiers in Immunology.</a> 9. , 14 (2018).</li><li>Tanaka, A., Sakaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cells+in+cancer+immunotherapy.">Regulatory T cells in cancer immunotherapy.</a> Cell Research. 27, 109-118 (2017).</li><li>Fleming, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+myeloid-derived+suppressor+cells+to+bypass+tumor-induced+immunosuppression.">Targeting myeloid-derived suppressor cells to bypass tumor-induced immunosuppression.</a> Frontiers in Immunology. 9, 398 (2018).</li><li>Cassetta, L., Kitamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+targeting:+opening+new+possibilities+for+cancer+immunotherapy.">Macrophage targeting: opening new possibilities for cancer immunotherapy.</a> Immunology. 155, 285-293 (2018).</li><li>Chahroudi, A., Silvestri, G., Feinberg, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+T+cell-mediated+cytotoxicity+using+fluorogenic+caspase+substrates.">Measuring T cell-mediated cytotoxicity using fluorogenic caspase substrates.</a> Methods. 31, 120-126 (2003).</li><li>Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+flow+cytometric+assays+for+monitoring+cell-mediated+cytotoxicity.">New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity.</a> Expert Review of Vaccines. 9, 601-616 (2010).</li><li>Azimi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification,+isolation,+and+functional+assay+of+regulatory+T+Cells.">Identification, isolation, and functional assay of regulatory T Cells.</a> Immunological Investigation. 45, 584-602 (2016).</li><li>Bruger, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+measure+the+immunosuppressive+activity+of+MDSC:+assays,+problems+and+potential+solutions.">How to measure the immunosuppressive activity of MDSC: assays, problems and potential solutions.</a> Cancer Immunology Immunotherapy. , (2018).</li><li>Qian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+macrophage+population+mediates+metastatic+breast+cancer+cell+extravasation,+establishment+and+growth.">A distinct macrophage population mediates metastatic breast cancer cell extravasation, establishment and growth.</a> PLoS One. 4, e6562 (2009).</li><li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytes+differentiate+to+immune+suppressive+precursors+of+metastasis-associated+macrophages+in+mouse+models+of+metastatic+breast+cancer.">Monocytes differentiate to immune suppressive precursors of metastasis-associated macrophages in mouse models of metastatic breast cancer.</a> Frontiers in Immunology. 8, 2004 (2018).</li><li>Bronte, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+myeloid-derived+suppressor+cell+nomenclature+and+characterization+standards.">Recommendations for myeloid-derived suppressor cell nomenclature and characterization standards.</a> Nature Communications. 7, 12150 (2016).</li><li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCL2-induced+chemokine+cascade+promotes+breast+cancer+metastasis+by+enhancing+retention+of+metastasis-associated+macrophages.">CCL2-induced chemokine cascade promotes breast cancer metastasis by enhancing retention of metastasis-associated macrophages.</a> Journal of Experimental Medicine. 212, 1043-1059 (2015).</li><li>Ewens, A., Mihich, E., Ehrke, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distant+metastasis+from+subcutaneously+grown+E0771+medullary+breast+adenocarcinoma.">Distant metastasis from subcutaneously grown E0771 medullary breast adenocarcinoma.</a> AnticancerResearch. 25, 3905-3915 (2005).</li><li>Choppa, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+PCR+for+the+detection+of+Mycoplasma+fermentans,+M.+hominisandM.+penetransin+cell+cultures+and+blood+samples+of+patients+with+chronic+fatigue+syndrome.">Multiplex PCR for the detection of Mycoplasma fermentans, M. hominisandM. penetransin cell cultures and blood samples of patients with chronic fatigue syndrome.</a> Molecular and Cellular Probes. 12, 301-308 (1998).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current protocols in immunology. , (2001).</li><li>Koyanagi, M., Kawakabe, S., Arimura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+colorimetric+cell+proliferation+assays+in+immune+cells.">A comparative study of colorimetric cell proliferation assays in immune cells.</a> Cytotechnology. 68, 1489-1498 (2016).</li><li>Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid-derived-suppressor+cells+as+regulators+of+the+immune+system.">Myeloid-derived-suppressor cells as regulators of the immune system.</a> Nature Reviews in Immunology. 9, 162-174 (2009).</li><li>Cassetta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+and+human+tumor-associated+macrophages.">Isolation of mouse and human tumor-associated macrophages.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 899. 899, 211-229 (2016).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

يستند هذا الأسلوب على ثقافة المشارك منفصلة خطوتين: شارك استزراع CD8+ تي الخلايا مع خلايا القامع محتملة، وشارك استزراع CD8 'مشروطة مسبقاً'+ تي الخلايا مع الخلايا السرطانية المستهدفة (الشكل 1). ثقافة المشاركة والخطوة الأولى مماثلة تماما لتلك ل CD8+ تي الخلية فحوصات الانتشار التي تستخدم عادة لتحديد تأثير الخلايا القامع على CD8+ الدالة T الخلية. ومع ذلك، انتشار الخلايا T لا يرتبط دائماً مع ما سيتوتوكسيسيتي. على سبيل المثال، نجد أن ثقافة المشارك مع M-مدسكس أو MAMs زادت بدلاً من انخفاض انتشار CD8+ تي الخلايا حضور CD3/CD28 تنشيط الأجسام المضادة (تكميلية الشكل 3)، بينما هذه مشروطة مسبقاً CD8+ خلايا تي أظهرت انخفاض سيتوتوكسيسيتي ضد الخلايا السرطانية المستهدفة (الشكل 4، رقم 5، رقم 6). هذه النتائج الضوء على أهمية تقييم النشاط الوظيفي، يدل على ذلك الهدف سرطان الخلية المبرمج، يقدمها هذا CD8+ الإنزيم سيتوتوكسيسيتي خلية تي.
لقد حددنا في هذا التحليل، أن CD8+ تي الخلايا يتطلب حوالي 15 ح ثقافة التعاون من أجل حمل أقصى المبرمج للخلايا السرطانية الثديية الماوس E0771-جي (الشكل 5). قد يكون هذا التأخير بسبب الفارق بين الاتصال الأولى من خلايا المستجيب مع الأهداف وتشكيل المشبك المناعية المصاحبة لها، فضلا عن الوقت اللازم لحمل إشارات apoptotic في أهداف مقاسة بتفعيل caspase-3 (التكميلية الفيلم 1 ). كما حددنا التي بلغ عدد الخلايا السرطانية apoptotic هضبة بعد 24 ساعة، الذي على الأرجح بسبب القضاء على الأهداف من قبل خلايا تي و/أو فقدان إشارة الفلورسنت من الخلايا الميتة. هذه القدرة على تحديد وقت الذروة المبرمج هو واحد الميزة الرئيسية لهذا التحليل منذ تحديد نقطة الوقت الأمثل هام لمناسبة إجراء المقارنات بين الأوضاع المختلفة. في حالتنا هذه على سبيل المثال، الاختلاف في سيتوتوكسيسيتي بين التحكم CD8+ T وخلايا CD8 ببوركينا/مام-تعليما+ ر كان أكبر بكثير في 15-18 ح ح 72 (الشكل 5) بالمقارنة مع الخلايا، وهكذا نقطة نهاية تجربة استخدام فترة حضانة ح 72 سيؤدي إلى نتائج مضللة.
هذا الأسلوب يمكن أيضا تصور تفاعل الخلية المستجيب للهدف في الوقت الحقيقي، مما يتيح زيادة ثاقبة الآلية الكامنة وراء سيتوتوكسيسيتي محدودة من CD8+ تي الخلايا المحتضنة مسبقاً مع خلايا القامع. على سبيل المثال، لاحظنا أن CD8+ تي الخلايا المحتضنة مسبقاً مع M-مدسكس أو MAMs مصادفة وتتفاعل مع الخلايا السرطانية الهدف لكن ليس الحث المبرمج (التكميلية الفيلم 4، 5 فيلم التكميلية، التكميلية الفيلم 6) على الدوام. على الرغم من أننا عدم التحديد الكمي لهذا الحدث، سيكون ممكناً ومثيرة للاهتمام قياس ومقارنة نسبة لقاءات ووقتهم التفاعل في ترابط مع التعريفي المبرمج. ميزة رئيسية أخرى أن هذا الأسلوب يتطلب عدد صغير من الخلايا (مثلاً، 1 × 103 الهدف) و 4 × 103 خلايا المستجيب للبئر الواحد. في الواقع، هذا البروتوكول يمكن أن يكون كذلك المنمنمة لتنسيق لوحة 384، حسنا إذا رغبت في ذلك. ولذلك، هذا التحليل مناسبة لفحص إنتاجية عالية وتجارب حيث تقتصر أرقام الخلية مثل الاختبار في المختبر باستخدام خلايا الثمينة المستمدة من المجراة في أو السابقين فيفو العينات.
من ناحية أخرى، حد من التحليل الحالي هو وجود إعداد كبيرة من الخلايا الميت المستجيب في بعض الظروف. من أجل زيادة الدقة في التمييز بين المبرمج للخلايا السرطانية المستهدفة من المستجيب CD8+ تي الخلايا، نواة المسماة الخلايا المستهدفة، ونواة تقييد حجم (باستثناء خلايا المستجيب) هو تطبيق لتحليل البيانات في هذا الفحص (الشكل 2). ومع ذلك، هناك بعض الحالات حيث تراكب مجاميع (الأخضر) أبوبتوتيك CD8+ تي الخلايا على الخلايا السرطانية المستهدفة غير أبوبتوتيك، الذي قد يتيه النتائج. يمكن تخفيف هذا القيد باستخدام عمود إزالة خلية ميتة على المستجيب الخلايا قبل ثقافة التعاون مع الخلايا السرطانية المستهدفة، مع افتراض تتوفر إعداد كافية من الخلايا المستجيب. مع نظم الفحص المجهري أكثر تعقيداً، قد أيضا يكون من الممكن خفض إشارة إيجابية زائفة بوسم المستجيب CD8 الخلايا+ ر مع فلوروفوري متميزة من نواة الخلية المستهدفة والركيزة caspase-3 فلوروجينيك.
حتى الآن، وقد استخدمت هذا البروتوكول للتحقيق في التفعيل غير محددة مستضد CD8+ تي الخلايا. على الرغم من أن مدسكس وتامس في ورم المكروية قمع وظائف الخلية T من خلال آليات غير محددة مستضد، مدسكس في الأنسجة اللمفاوية المحيطية قمع ردود الخلية T في طريقة محددة مستضد18. للتحقيق في وظائف المناعة القمعية لهذه الأنواع من الخلية، مقايسة انتشار في المختبر استخدام CD8 الخلايا+ ر من 1 بعد التمديد ويشيع استخدام الفئران المعدلة وراثيا. في هذا التحليل، الخلايا T OT-1 (التعبير عن مستقبلات خلية تي معينة أوفالبومين (OVA)) شارك تستزرع مع مدسكس القامع حضور الببتيدات البويضات، وهو المطبق للثقافة الأولى في أعمالنا بالانزيم سيتوتوكسيسيتي (أي.، خلايا تنشيط تي في وجود أو عدم وجود المكثفات). كما أنه من الممكن التلاعب بالخلايا السرطانية المستهدفة للتعبير عن البويضات، مما يمكن أن يؤدي إلى قتل الخلية السرطان حدة مستضد خلايا "تي" 1 بعد التمديد. ولذلك، المقايسة سيمكن أيضا التحقيق في قمع مام/ببوركينا-بوساطة محددة مستضد تي خلية التنشيط. من الممكن أيضا تطبيق الفحص للتحقيق في الخلايا البشرية، وتنشيط الأجسام المضادة ضد البشرية CD3 و CD28 متوفرة تجارياً، كما تم وضع بروتوكول لعزل تامس البشرية من العينات السريرية المقررة19.
جماعياً، هذا التحليل هو تنوعاً تماما ويمكن استخدامها لدراسة سيتوتوكسيسيتي لأنواع أخرى من الخلايا المناعية. حاليا، في مختبراتنا، فإنه يجري توسيع لدراسة الخلية تعتمد على مستضد سيتوتوكسيسيتي تحت ظروف مختلفة وهو يجري أيضا وضع للإنتاجية العالية الفرز.

فمن المعروف أن CD8+ تي الخلايا يمكن القضاء على الخلايا السرطانية عند أنها تمارس الكامل سيتوتوكسيسيتي. بعد تنشيط مستقبلات خلية تي (تكر)، CD8+ تي الخلايا تتكاثر وتفرق في خلايا المستجيب السامة للخلايا. CD8 توسيع وتنشيط+ تي الخلايا تفرز حبيبات السامة للخلايا، بما في ذلك بيرفورين وجرانزيميس، التي يتم نقلها إلى الخلايا المستهدفة وبدء مسارات الحال مختلفة مثل caspase-3 بوساطة المبرمج1. CD8+ تي الخلايا يمكن أيضا حمل ورم الخلايا المبرمج بتنشيط مستقبلات على الخلايا المستهدفة، مثل مستقبلات لعامل نخر الورم-α (تنف-α)، المبرمج أول إشارة يجند (فصل)، أو يجند الذي يحفز المبرمج تنف المتصلة (درب). وعلاوة على ذلك، CD8 المنشط+ تي الخلايا تفرز الانترفيرون γ (IFN-γ) التي يمكن قمع انتشار الخلايا السرطانية وزيادة حساسية الخلايا السرطانية إلى CD8+ تي الخلايا عن طريق المتابعة-التنظيم مستقبلات فصل1. نظراً لإمكانية CD8+ ر قدرة قتل الورم، عدة استراتيجيات لتعزيز سيتوتوكسيسيتي بهم (مثل مثبطات حاجز التطعيم ضد مرض السرطان، والتبني نقل مستضد تشيميريك مستقبلات (السيارات) معربا عن خلايا تي) قد أنشئت وتظهر الآثار العلاجية الهامة في أنواع معينة من السرطان2. مع ذلك، تتراكم الأدلة تشير إلى أن التسلل إلى الورم المناعي الخلايا مثل الخلايا التائية التنظيمية والقامع النقوي المستمدة من الخلايا (مدسكس)، والمرتبطة بورم الضامة (تامس) يمكن قمع CD8+ تي الخلية وظائفها وتحد من فعالية إيمونوثيرابيس3،،من45. لتحسين هذه إيمونوثيرابيس، فإنه من المهم أن نفهم القامع كيف مأمن حد الخلايا CD8+ سيتوتوكسيسيتي خلية تي. تحديد CD8+ خلية T آليات قمع فضلا عن أهداف دروجابل للتغلب على ذلك، سوف يتطلب تطوير واستخدام لفحوصات في المختبر.
الأسلوب المعيار الذهبي لقياس CD8+ سيتوتوكسيسيتي تي خلية هو فحص الإصدار الكروم فيها خلايا إطلاق المسبار المشعة (51Cr)، من المستهدف أن يتم تفكيك من CD8+ تي الخلايا، وهو مصمم6. بيد أن هذا التحليل له عدة عيوب منها حساسية منخفضة نسبيا، خلفية عالية، وعدم القدرة على كشف مبكر أبوبتوتيك الأحداث، ومشاكل التخلص الخطرة، ومحدودة التوافق مع معالجة السائل الآلي والكشف عن دعم تطبيقات إنتاجية أعلى. أسلوب شائع آخر هو تحليل تدفق سيتوميتريك فيها الكشف عن المبرمج للخلايا السرطانية المستهدفة بواسطة annexin V ملزمة7. في هذا التحليل، فمن الممكن للكشف عن معلمات أخرى مثل موت الخلية المستهدفة باستخدام يوديد propidium (PI) أو 7-أمينواكتينوميسين د (7-الإغراق) وتنشيط الخلية المستجيب وأشار إلى تعبير CD107a أو CD69، بالإضافة إلى المبرمج في الخلايا الهدف7 . بيد أن هذا التحليل يتطلب أعدادا كبيرة من الخلايا القامع مقارنة بفحص الإصدار الكروم. ويتطلب أيضا مفرزة وتصنيف الخلايا الهدف ملتصقة ويمكن هذا التحيز في النتائج. في الواقع، الكروم الإصدار المقايسة أو الإنزيم سيتوميتريك تدفق لا تستخدم عادة للتحقق من القامع خلية التأثيرات على وظائف الخلية T. بدلاً من ذلك، كثيرا ما يستخدم قياس انتشار تي خلية المؤشرة تمييع صبغة الفلورسنت (مثلاً، كفسي) محملة مسبقاً في الخلايا T لتقييم تثبيط CD8+ الدالة T الخلية من الخلايا القامع. الكشف عن إنتاج IFN-γ من خلايا تي مثقف أسلوب قياسي آخر لتقييم آثار القامع الخلايا في خلية تي التنشيط8،9. ومع ذلك، النتائج من هذه الاختبارات لا ترتبط بالضرورة بالخلية الهدف قتل قدرة CD8+ تي الخلايا.
نحن الحاضرين هنا تحليل وظيفية بديلة لتقييم آثار القامع الخلايا، لا سيما الضامة في أورام المنتشر، على سيتوتوكسيسيتي CD8+ تي الخلايا. يحدد هذا الأسلوب سيتوتوكسيسيتي CD8+ تي الخلايا، مثقف مسبقاً مع أو بدون الخلايا القامع حضور الأجسام المضادة-CD3/CD28 تفعيل، عن طريق الكشف عن ورم الخلايا المبرمج، يتبين من الأسفار من فلوروجينيك caspase-3 الركيزة6 استخدام الآلي الوقت الفاصل بين الفحص المجهري (الشكل 1). هذا البروتوكول له العديد من المزايا مقارنة بالأساليب الأخرى؛ أنه يتطلب سوى عدد صغير من الخلايا وتمكن من كشف موت الخلايا السرطانية ملتصقة بحساسية عالية، يمكن الصور في الوقت الحقيقي المستجيب بهدف التفاعل وقابلة للفحص عالية الإنتاجية.
في هذا البروتوكول، والمرتبطة بورم خبيث الضامة (MAMs) وعلى السلف مونوسيتيك-مدسكس (M-مدسكس) المعزولة من الأورام المنتشر في الفئران تستخدم كخلايا القامع. في نماذج الماوس من سرطان الثدي المنتشر، يتسم عدد متميز من الضامة F4/80عاليةLy6G–CD11bعاليةLy6Cمنخفضة تتراكم في الرئة تتضمن الأورام النقيلي. هذا السكان بلعم القليلة الموجودة في الرئة طبيعية وهكذا دعا الضامة المرتبطة بورم خبيث (MAMs)10. في هذه النماذج الماوس، آخر النقوي الخلية السكان، تعريفها F4/80عاليةLy6G–CD11bعاليةLy6Cعالية، كما يتراكم أساسا في الرئة المنتشر حيث أنها تثير MAMs11. استناداً إلى خصائصها، قد تمثل CD11bعاليةLy6Cعالية مام السلف الخلايا مدسكس م12.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin EDTA (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Freiner Bio-One</td>
			<td>665-180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL Plystyrene Round-Bottom Tube</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Cell Culture Plate (Round Bottom )</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3799</td>
			<td>Co-culture of CD8+T cells with sorted myeloid cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate (Flat bottom)</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>165305</td>
			<td>Co-culture of CD8+T cells with target cells for cytotoxicity assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF647 anti-mouse F4/80 Antibody</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>MCA497A647</td>
			<td>Clone: CIA3-1, Lot#: 1707, 2 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor700 anti-mouse CD8 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100730</td>
			<td>Clone: 53-6.7, Lot#: B205738, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD28 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102111</td>
			<td>Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 37.51, Lot#: B256340</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD3e Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100314</td>
			<td>Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 145-2C11, Lot#: B233720</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD3 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100236</td>
			<td>Clone: 17A2, Lot#: B198730, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cy7 anti-mouse Ly6C Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>128026</td>
			<td>Clone: HK1.4, Lot#: B248351, 1 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albmin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1470-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer (100&#956;m Nylon)</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352360</td>
			<td>To smash the spleen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer (40&#956;m Nylon)</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352340</td>
			<td>To filter the lung digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>422801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8242;s Modified Eagle&#8242;s Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>19853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse CD4 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100406</td>
			<td>Clone: GK1.5, Lot#: B179194, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex Ready-to-Use</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1596-01</td>
			<td>Coating the 96-well plates for cytotoxicity assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte NucLight Red Lentivirus Reagent</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>4476</td>
			<td>Lenti viral particules encoding mKate2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte ZOOM</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td></td>
			<td>Detector (fluorescence microscope)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte ZOOM 2018A</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td></td>
			<td>Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2916801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lung Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-095-927</td>
			<td>Preparation of single cell suspension from the tumor-bearing lung</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MycoAlert Mycoplasma Detection Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>LT07-318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acid (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucView488</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>10403</td>
			<td>Fluoregenic caspase-3 substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse Ly6G Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>127607</td>
			<td>Clone: 1A8, Lot#: B258704, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 anti-mouse CD11b Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101216</td>
			<td>Clone: M1/70, Lot#: B249268, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Penicillin Streptomycin for primary culture of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103132</td>
			<td>Clone: 30-F11, Lot#: B249564, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene (Hexadimethrine bromide)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis Buffer (10X)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine IL-2</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>212-12</td>
			<td>Activation of isolated CD8+ T cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruStain fcX (anti-mouse CD16/32) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>&#160;: Nikon 10X objective (resolution 1.22 &#181;m) 
			&#160;: Green channel excitation: 440 - 480 nm 
			&#160;: Green channel emission: 504 - 544 nm 
			&#160;: Red channel excitation: 565-605 nm 
			&#160;: Red channel emission: 625 - 705 nm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real time detection of in vitro tumor cell apoptosis induced by cd8+ t cells to study immune suppressive functions of tumor-infiltrating myeloid cells

التقوية لقدرة الورم لقتل CD8+ تي الخلايا في الأورام، جنبا إلى جنب مع أي تسلل الورم فعالة، عنصر أساسي في نجاح إيمونوثيرابيس. أشارت عدة دراسات إلى أن خلايا الورم النقوي المتسللة (مثلاً، القامع النقوي المستمدة من الخلايا (مدسكس) والمرتبطة بورم الضامة (تامس)) قمع سيتوتوكسيسيتي CD8+ تي الخلايا في ورم المكروية، وأن استهداف ويمكن تحسين هذه الخلايا التنظيمية النقوي إيمونوثيرابيس. هنا، فإننا نقدم نظاما لفحص في المختبر لتقييم الآثار القمعية محصنة من مونوسيتيك مدسكس وتامس على قدرة الورم لقتل CD8+ تي الخلايا. وتحقيقا لهذه الغاية، نحن أولاً مثقف السذاجة CD8 الطحال+ تي الخلايا مع تفعيل الأجسام المضادة-CD3/CD28 في وجود أو عدم وجود خلايا القامع، وثم شارك مثقف الخلايا T مفعّلة مع الخلايا السرطانية الهدف حضور فلوروجينيك الركيزة caspase-3. تم الكشف عن الأسفار من الركازة في خلايا السرطان بالفحص المجهري fluorescence في الوقت الحقيقي كمؤشر تي خلية الناجم عن ورم الخلايا المبرمج. في هذا التحليل، يمكننا بنجاح الكشف عن الزيادة في ورم الخلايا المبرمج من CD8+ تي الخلايا وقمعه من قبل الثقافة مع تامس أو مدسكس. هذا التحليل الوظيفي مفيد للتحقيق CD8+ تي الخلية آليات قمع الخلايا النقوي التنظيمية وتحديد الأهداف دروجابل للتغلب عليه عن طريق فحص إنتاجية عالية.

هذا الأسلوب يستند إلى ثقافة المشارك بسيطة من الخلايا السرطانية المستهدفة مع المستجيب CD8+ تي الخلايا التي تم مثقف مسبقاً مع أو بدون خلايا القامع حضور الأجسام المضادة-CD3/CD28 تفعيل. يكشف CD8+ المستحثة تي خلية سرطان الخلية المبرمج على مر الزمن بعد ثقافة المشارك، مما يمكن من تقييم آثار الخلايا القامع على سيتوتوكسيسيتي CD8+ تي الخلايا.
عادة، زيادة الخلايا السرطانية الفلورية الخضراء في نويات بهم عقب تفعيل بيوسينسور كاسباسي النووية تستهدف عند هذه الخلايا تجعل الاتصال مع CD8+ تي الخلايا التي تكون مفعّلة بالأجسام المضادة في غياب القامع الخلايا ( الشكل 3؛ فيلم تكميلي 1). كان من الممكن اكتشاف على الأقل 15 ح الفلورية الخضراء من الركازة caspase بعد أن بدأ المبرمج. بعض المبرمج العفوية للمستجيب CD8+ تي الخلايا لوحظ أيضا مع مرور الوقت حتى ولو كان مثقف هذه الخلايا بمعزل عن (الشكل 4؛ فيلم تكميلي 2). ومع ذلك، أحجام نوى CD8+ تي الخلايا أصغر من تلك الخلايا السرطانية، وهكذا يمكن استبعاد الخلايا apoptotic 'المستجيب' من أبوبتوتيك حساب الخلية 'استهداف' بصورة حجم تقييد أسلوب تحليل (الشكل 2 و الشكل 4). على الرغم من أن بعض الخلايا السرطانية الهدف إظهار شكل مدورة صغيرة دون الفلورية الخضراء، وهذا لا يؤثر التحليل هذه الخلايا يخضعون للانقسام بدلاً من المبرمج (تكميلية الفيلم 3)، وهكذا تستثني من أبوبتوتيك 'الهدف' حساب الخلية بقناع تداخل الأحمر/الأخضر (تكميلية الشكل 2). أحياناً يتم العثور على عفوية المبرمج للخلايا السرطانية المستهدفة حتى في ثقافة واحدة (3 فيلم التكميلية). ومع ذلك، الخلايا ثقافة المشارك من السرطان المستهدفة مع CD8 مفعّلة+ تي الخلايا المبرمج خلية الورم زيادة أعلى مستويات المبرمج عفوية في زراعة الخلايا السرطانية (الشكل 4). ذروة في عدد الخلايا السرطانية apoptotic الهدف عند استخدام نسبة الخلايا السرطانية الهدف أمثل لخلايا المستجيب، عموما، يمكن ملاحظة (الشكل 5A). ذروة هذا أكثر وضوحاً عندما يعبر عن البيانات الكسر apoptotic السكان الخلية المستهدفة (الشكل 5 (ب)). في هذه التجربة المبرمج القاعدية للخلايا السرطانية المستهدفة التي بلغت ذروتها في 24 ساعة (مع كسر apoptotic = 0.08)، لكن CD8+ المبرمج المستحثة بخلية T بلغت مستوى الحد أقصى في ح 17 (مع كسر apoptotic = 0.66).
كذلك وجدنا أن CD8+ تي يمكن أن تجعل الخلايا المحتضنة مسبقاً مع MAMs أو M-مدسكس الاتصال مع الخلايا السرطانية الهدف لكن هذا الاتصال يبدو أنه يؤدي إلى حالات أقل من سرطان الخلية المبرمج مقارنة ب CD8+ تي خلايا مفعّلة دون خلايا القامع (رقم 3 و رقم 4؛ فيلم التكميلية 4 وفيلم التكميلية 5.) على الرغم من أن CD8+ تي الخلايا المحتضنة مسبقاً مع الخلايا النقوي أحياناً التي يسببها سرطان الخلية المبرمج، وكان هناك أيضا بعض انتشار الخلايا السرطانية المستهدفة التي حفزت على عدم الخضوع للمبرمج أثناء الوقت التجربة (6 فيلم التكميلية). يتسق مع هذه النتائج، الكسر ذروة الخلايا السرطانية apoptotic مثقف مع CD8+ تي الخلايا المحتضنة مسبقاً مع خلايا النقوي (كسر apoptotic = 0.38 في ح 23 ببوركينا-ه و 0.25 في 20 ح مام ه) كان أقل بكثير من أن الخلايا السرطانية مثقف مع CD8+ تي الخلايا التي لم تكن قبل المحتضنة مع الخلايا القامع (الشكل 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig1.jpg"> رقم 1: مخطط يظهر الإجراء التجريبي. CD8 الطحال السذاجة+ تي تستزرع خلايا مع الأجسام المضادة-CD3/CD28 تفعيل مع أو بدون المرتبطة بورم خبيث الضامة (MAMs) أو القامع مونوسيتيك النقوي-المستمدة من الخلايا (م-مدسكس). بعد 4 أيام، العائمة CD8+ تي وخلايا تم جمعها ومثقف يشترك مع الخلايا السرطانية الهدف حضور الركيزة caspase-3 فلوروجينيك. يتم الكشف عن الخلايا السرطانية Apoptotic تحت مجهر الأسفار في الوقت الحقيقي. الصور تظهر تم الحصول عليها باستخدام منصة تصوير الخلية حية (الرجوع إلى الجدول للمواد). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig2.jpg"> رقم 2: تحديد الخلايا الهدف apoptotic متميزة من خلايا المستجيب أبوبتوتيك. الحصول على الصف العلوي: الصور في القناة الحمراء يسمح تحديد نواة الخلية المستهدفة بهدف الكشف عن قناع (قناع تحليل الوردي). الصف الأوسط: الصور التي اكتسبها في قناة الأخضر تشير إلى الخلايا apoptotic المستجيب والهدف. قناع المبرمج مقيد عزيز (تحليل أزرق مخضر قناع؛ أكبر من 80 ميكرومتر2) يسمح apoptotic واحد خلايا المستجيب استبعادها من التحليل. الصف السفلي: مركب الصور المدمجة الأحمر وتداخل قنوات الأخضر مع المرحلة تباين الصورة (يسار) أو أحمر/أخضر قناع (يمين). تحديد هوية المشترك المترجمة، وتقييد حجم الأسفار الأخضر مع الأحمر الفلورية (قناع تحليل الصفراء)، يتيح الكشف عن أكثر دقة من apoptotic نوى المستهدفة (السهم الأصفر) باستثناء المجاميع apoptotic المستجيب الخلايا (أبيض رؤوس الأسهم). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig3.jpg"> الشكل 3: التفاعل بين CD8+ تي الخلايا والخلايا السرطانية. اللقطات من أفلام الوقت الفاصل بين الممثل للخلايا الهدف E0771-LG_NLR (T) شارك مثقف مع المستجيب CD8+ تي الخلايا (ه) نسبة 4:1 المستجيب/الهدف. ببوركينا-ه وه مام تشير إلى خلايا المستجيب المحتضنة مسبقاً مع M-مدسكس و MAMs على التوالي. تظهر الصور المركبة (بما في ذلك الصور من قنوات مرحلة التباين والأحمر والأخضر). رؤوس الأسهم وتتبع نفس الخلايا عبر مختلف المجالات والنقاط الزمنية. الأصفر رؤوس الأسهم: هو هدف المستجيبة، ويخضع للمبرمج، بيضاء رؤوس الأسهم: هدف أن يربط مع المستجيبة ولكنها لا تخضع للمبرمج. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig4.jpg"> الشكل 4: الكشف عن الخلايا السرطانية أبوبتوتيك. حقول الممثل المستخرجة من الوقت الفاصل بين الأفلام في ح 18 وبعد التصوير. الصور والصور المركبة (اليسار؛ قنوات مرحلة التباين والأحمر والأخضر) من الأحمر قناة دون (الأوسط) أو مع تداخل الأحمر/الأخضر (يمين) يتم عرض قناع (أصفر). وتمثل النقاط الصفراء في العمود الأيمن الخلايا السرطانية أبوبتوتيك. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig5.jpg"> الشكل 5: CD8+ المستحثة تي خلية سرطان الخلية المبرمج. (أ) عدد الخلايا السرطانية apoptotic مثقف مع المستجيب C8+ تي الخلايا في مختلف المستجيب للنسبة المستهدفة (E:T)-أبوبتوتيك (ب) جزء من سكان الخلية المستهدفة. وتعد البيانات يعني ± التنمية المستدامة. يعني المنطقة تحت المنحنى (AUC) ويرد أيضا. مزاوج تي-الاختبار مع التصحيح وولش استخدمت لتحليل/أوك/. * ف < 0.0001 بالمقارنة إلى E:T = 0:1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig6.jpg"> الشكل 6: آثار تسلل الورم النقوي الخلايا على سيتوتوكسيسيتي CD8+ تي الخلايا. (أ) عدد الخلايا السرطانية أبوبتوتيك (الهدف: T) مثقف مع C8+ تي الخلايا (المستجيب: ه) في 4:1 نسبة E:T. CD8+ تي الخلايا كانت مثقف مسبقاً في غياب (دائرة سوداء) أو وجود خلايا مونوسيتيك النقوي-المستمدة من القامع (ببوركينا-هاء: دائرة زرقاء) أو المرتبطة بورم خبيث الضامة (مام-هاء: دائرة حمراء). البيانات وسائل ± Apoptotic التنمية المستدامة. (ب) جزء من سكان الخلية المستهدفة. البيانات هي وسائل ± "أوك يعني التنمية المستدامة." ويرد أيضا. مزاوج تي-الاختبار مع التصحيح وولش استخدمت لتحليل/أوك/. * ف < 0.0001 مقارنة مع تي فقط، #ف < 0.0001 مقابل ه + ت. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig6large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
التكميلية الرقم 1. استراتيجية النابضة لعزل الخلايا القامع من الرئة المنتشر. نقطة (A) الممثل المؤامرات لعزل الخلايا مونوسيتيك القامع المستمدة من النقوي (م-مدسكس) والمرتبطة بورم خبيث الضامة (MAMs). هو أساس عتبة مستوى Ly6C لتمييز MAMs (Ly6Cمنخفضة) و M-مدسكس (Ly6Cعالية) من المقيمين البلاعم السنخية (رماك). نقاء (ب) تم فرزها M-مدسكس (CD45+Ly6G–CD11b+Ly6Cعالية) و MAMs (CD45+Ly6G–CD11b+Ly6Cمنخفضة). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/FigureS1_Rvd.pdf">اضغط هنا لتحميل هذا الملف.</a>
التكميلية الرقم 2. صور الممثل للخلايا الهدف الانقسامية. اللقطات من أفلام الوقت الفاصل بين الممثل من مونو-ثقافة الخلية الهدف E0771-LG_NLR. أعلى: الصور المركبة بما في ذلك الصور من قنوات مرحلة التباين والأحمر والأخضر. أسفل: تتداخل الصور المركبة (قنوات الأحمر والأخضر) مع أحمر/أخضر قناع. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/FigureS2_Rvd.pdf">اضغط هنا لتحميل هذا الملف.</a>
التكميلية الرقم 3. آثار تسلل الورم النقوي الخلايا على انتشار CD8+ خلايا تي- (أ) ممثل عرض تمييع وسم الفلورسنت مع كفسي في CD8 المدرج الإحصائي+ تي الخلايا. CD8 الطحال السذاجة+ تي الخلايا كانت معزولة كما هو موضح في البروتوكول الثالث والمسمى مع 5 ميكرون من كفسي في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. وكانت الخلايا T المسمى مثقف حضور إيل-2 ومكافحة-CD3/CD28 تنشيط الأجسام المضادة مع أو بدون خلايا النقوي كما هو موضح في 4 البروتوكول. بعد 4 أيام، اكتشفت الفلورية الخضراء في خلايا تي بتدفق سيتوميتير. (ب) شعبة مؤشر CD8+ تي الخلايا المحسوبة كما هو موضح سابقا17. البيانات هي وسائل ± sem. * ف < 0.01 بالمقارنة مع التحكم، #ف < 0.05 بالمقارنة مع αCD3/CD28 ab. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/FigureS3_Rvd.pdf">اضغط هنا لتحميل هذا الملف.</a>
التكميلية الفيلم 1. فيلم الشكلان 3 و 4؛ E + ت. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS1.mp4">اضغط هنا لتحميل هذا الملف.</a>
التكميلية الفيلم 2. فيلم الشكلان 3 و 4؛ المستجيب (ه). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS2.mp4">اضغط هنا لتحميل هذا الملف.</a>
التكميلية الفيلم 3. فيلم الشكلان 3 و 4؛ الهدف (T). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS3.mp4">اضغط هنا لتحميل هذا الملف.</a>
التكميلية الفيلم 4. فيلم الشكلان 3 و 4؛ ببوركينا-E + ت. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS4.mp4">اضغط هنا لتحميل هذا الملف.</a>
التكميلية الفيلم 5. فيلم الشكلان 3 و 4؛ مام ه + ت. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS5.mp4">اضغط هنا لتحميل هذا الملف.</a>
التكميلية الفيلم 6. فيلم الشكلان 3 و 4؛ ه مام + T (انتشار). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS6.mp4">اضغط هنا لتحميل هذا الملف.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells at JoVE

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

يصف لنا هنا بروتوكولا للتحقيق في سيتوتوكسيسيتي CD8 مفعّلة+ تي خلايا ضد الخلايا السرطانية عن طريق الكشف عن خلايا السرطان عن طريق المجهري في الوقت الحقيقي أبوبتوتيك. هذا البروتوكول يمكن التحقيق في الآليات وراء قمع النقوي المستحثة بخلية T الخلية وتقييم المركبات تهدف إلى تجديد خلايا T عن طريق الحصار المفروض من الخلايا المناعية النقوي القمعية.

الكشف عن الوقت الحقيقي في المختبر ورم الخلايا المبرمج الناجمة عن CD8+ تي الخلايا لدراسة وظائف المناعة القمعية من التسلل إلى ورم الخلايا النقوي

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

يقوم بروتوكولنا بتقييم آثار الخلايا القامع المشتقة من النخاعي والضامة المرتبطة بالورم في الخلايا السرطانية التي تسببها الخلايا التائية. جنبا إلى جنب مع التحقيق في الآليات الأساسية للتدخلات العلاجية المحتملة. هذا البروتوكول يقيم مباشرة الخلايا الورم المبرمج الخلايا السرطانية التي تسببها الخلايا مع حساسية عالية، وتمكن من التحليل الطولي وتصوير التفاعلات من خلية إلى خلية.أفضل نظر فعالية مثبطات نقطة التفتيش من خلال الخلايا النخاعية التي تتسلل إلى الورم في أنواع معينة من الأورام. هذه التقنية يمكن أن تؤدي إلى تحديد العلاجات الجديدة لهذه الأورام. هذه الطريقة لا يمكن أن تقدم فقط أبحاث مناعة السرطان، ولكن يمكن أيضا أن توفر نظرة ثاقبة في نقص المناعة وأمراض المناعة الذاتية.لتفعيل وتوسيع خلايا CD8-إيجابية CD8-إيجابية الطحال، أول aliquot مرة واحدة مرات 10 إلى الخامس CD8 إيجابية الخلايا التائية في 50 ميكرولترات من E-DMEM في آبار فردية من 96 بئر U-القاع لوحة. بعد ذلك، إضافة مرة واحدة 10 إلى الخلايا القامع الخامس في 50 ميكرولترات من E-DMEM، أو 50 ميكرولترات من E-DMEM وحدها، في كل بئر من الخلايا التائية. ثم إضافة 50 ميكرولترات من المتوسط التنشيط الطازجة وإعداد 50 ميكرولترات من E-DMEM، مع أو بدون الكواشف اختبار الفائدة، إلى الآبار المناسبة.ووضع لوحة في 37 درجة مئوية وحاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪ مع رطوبة 95٪لمدة أربعة أيام. لإعداد خلية مستهدفة مدمجة مدمجة مدمجة مدمجة مسبقًا ، أضف أولاً 30 ميكرولترات من 1 إلى 100 مخففة من عوامل النمو القابلة للذوبان في الطابق السفلي إلى الآبار المناسبة لصفيحة مسطحة القاع 96 بئرًا ، مناسبة للمجهر. يهز لوحة لنشر المصفوفة بالتساوي، ووضع لوحة في الحاضنة ثقافة الخلية لمدة ساعة واحدة على الأقل.بينما اللوحة هي توازن، وإعداد الخلايا المستهدفة. استلهم الوسط، واغسله مع برنامج تلفزيوني، وأضيف ملليلتر واحد من 05٪ لتربسين-EDTA في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة. إضافة تسعة ملليلتر من DMEM تكملها مصل البقرة الجنينية عن طريق الأنابيب لطيف، ونقل الخلايا المتفككة في أنابيب.بعد الطرد المركزي للخلايا، إعادة تعليق البليت في 500 ميكرولترات من E-DMEM. تصفية الخلايا التي تم إعادة فرضها من خلال مصفاة الخلايا، ثم عد الخلايا الحية. ثم ضبط كثافة إلى أربعة أضعاف 10 إلى الخلايا الهدف الرابع لكل ملليلتر في طازج E-DMEM على الجليد.بعد ذلك ، الماصات الخلايا T-POSITIVE CD8-positive مسبقًا عدة مرات لإعادة تعليق الخلايا في تعليق خلية واحدة، ونقل الخلايا التائية العائمة إلى أنبوب واحد 1.5 ملليلتر لكل حالة. جمع أي الخلايا المتبقية مع 200 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني في البئر، ونقل يغسل في أنابيب 1.5 ملليلتر المناسبة، والطرد المركزي. استلهم الوسط وأضف ملليلترًا واحدًا من E-DMEM إلى كل أنبوب للطرد المركزي.بعد الطرد المركزي، resuspend الكريات في 100 ميكرولترات من الطازجة E-DMEM لكل أنبوب. بعد العد، وضبط الخلايا في كل أنبوب إلى كثافة 1.6 مرات 10 إلى الخامس قبل تنشيط CD8 إيجابية الخلايا التائية لكل ملليلتر من المتوسطة، ووضع الخلايا على الجليد. عندما تكون الخلايا جاهزة ، تتبخر مصفوفة الغشاء السفلي من كل بئر من لوحة المجهر 96 بئرًا ، وإضافة 50 ميكرولترات من الخلايا المستهدفة إلى الآبار الفردية داخل 60 بئرًا داخلية من اللوحة مع الاختلاط.إضافة 25 ميكرولتر من E-DMEM تستكمل مع أربعة أضعاف 10 إلى الوحدات الثالثة لكل ملليلتر من IL2، و 10- ميكرومولر فلورية الفلورا فلورية- 3 الركيزة إلى الآبار المناسبة. ثم إضافة 25 ميكرولترات من خلايا T-إيجابية CD8 مسبقًا إلى الآبار المناسبة. وأخيرا، إضافة E-DMEM إلى الآبار المناسبة لجعل حجم إجمالي يصل إلى 100 ميكرولتر.إضافة 200 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني أو الماء العقيم في جميع الآبار الفارغة. يهز لوحة، وترك لوحة على سطح مستو لمدة 10 دقائق. لتصوير الخلايا، قم بتعيين المجهر للحصول على الصور في مرحلة التباين.فضلا عن قنوات الفلوريسنس مناسبة للبروتين الفلورسنت المقيدة نوويا، والفلوروجينيك المنشط الفلوريوفلورور الركيزة 3 المستخدمة في التجربة. ثم التقاط صور لكل بئر تجريبية في المرحلة النقيض وقنوات الفلوريسنس كل واحد إلى ثلاث ساعات لمدة 72 ساعة على الأقل. لتحليل الصور الملتقطة، افتح صورة من عنصر تحكم يحتوي على خلايا مستهدفة فقط ومتوسطة دون الركيزة من caspase-3 في قناة الفلوريسكين المستخدمة في إشارة الركيزة.لاحظ ما إذا كانت إشارة الفلورس غير الملائمة تنبعث من النوى. إذا كانت إشارة الركيزة واضحة داخل النوى، استخدم التكبيك الطيفي لزيادة النسبة المئوية للإشارة الركيزة التي تم إزالتها من إشارة النوى، حتى تختفي إشارة الركيزة. بعد ذلك، عرض جيدا السيطرة التي تحتوي على الخلايا غير موسومة فقط nuclei تأثير في المتوسط دون الركيزة caspase-3 في القنوات الفلورية اثنين بشكل فردي.مراقبة ما إذا كان يتم إصدار إشارة من النوى. إذا لم تظهر إشارة في القنوات الفردية، لا يلزم فك التكبيك الطيفي. لحل الكائنات الفلورية في كل من قنوات الفلوريسين، استخدم أسلوب الطرح الخلفية الفلورية مع معلمات ذات صلة للعينة والمعلمات المناسبة لتقسيم الحافة.استخدام صور من الخلية المستهدفة أحادية الزراعة لتحديد المعلمات لخلايا الفلورس النووية المستهدفة. استخدام صور من أحادية الخلية المفعول لوضع المعلمات للفلوروس النووي الناجم عن الركيزة. استخدام صور الثقافة المشتركة للتحقق من أو صقل المعلمات للفلوروس النووي المستحث بالركيزة الذرية في الخلايا المستهدفة.لتحديد الحد الأدنى لحجم النوى المستهدفة، استخدم الصور في قناة إشارة النوى من الآبار التي تحتوي على الخلايا المستهدفة فقط مع الركيزة البرميلية. لتحديد متوسط حجم نوى الأثر المبرمج، استخدم الصور في قناة إشارة الركيزة من الآبار التي تحتوي على خلايا المفعول فقط مع الركيزة caspase. لحساب عدد من النوى الخلية المستهدفة fluorescence، إعداد إجراء تحليل باستخدام الحد الأدنى المناسب من حجم القيد.باستخدام صور أحادية الثقافة الخلية، قم بإعداد إجراء تحليل ثاني لحساب عدد النوى المبرمجة التي هي أكبر من متوسط حجم نوى المفعول المبرمج. ثم قم بإعداد إجراء تحليل ثالث لحساب عدد الخلايا المستهدفة المبرمجة عن طريق عد عدد النوى التي تشارك فيها إشارة النواة وإشارة الركيزة المقيدة بالحجم بشكل كبير في التوطين. عادة، تزيد الخلايا السرطانية من إشارة الفلوريسنس في نواتها بعد تنشيط جهاز استشعار حيوي لكاسباس المستهدَف نووياً عندما تتصل الخلايا بالخلايا التائية الإيجابية CD8 التي تم تنشيطها مسبقًا بواسطة الأجسام المضادة في غياب الخلايا الخافعة.أحجام نواة الخلايا التائية إيجابية CD8 أصغر من تلك الخلايا السرطانية. وهكذا، يمكن استبعاد الخلايا المُفعِّل المبرمج من عد الخلايا الهدف المبرمج بواسطة طريقة تحليل صور تقييد الحجم. على الرغم من أن بعض الخلايا السرطانية المستهدفة تظهر شكلًا دائريًا صغيرًا بدون الفلورالزية الركيزة ، إلا أن هذا لا يؤثر على التحليل.كما تخضع هذه الخلايا الانقسام بدلا من المبرمج وبالتالي يتم استبعادها من تعداد الخلايا المستهدفة المبرمج بقناع تداخل إشارة الركيزة النووية. الثقافة المشتركة للخلايا السرطانية المستهدفة مع الخلايا التائية الإيجابية CD8 التي تم تنشيطها مسبقًا تزيد من موت الخلايا السرطانية فوق مستويات المبرمج التلقائي في الخلايا السرطانية أحادية الخلايا. عموما، عند استخدام النسبة المثلى من الخلايا السرطانية الهدف إلى الخلايا التي تحقق effector، يمكن ملاحظة ذروة في عدد الخلايا السرطانية الهدف المبرمج.وتصبح هذه الذروة أكثر تميزاً عندما يتم التعبير عن البيانات باعتبارها الجزء المبرمج من مجموعة الخلايا المستهدفة. أهم شيء أن نتذكر عند محاولة هذا البروتوكول هو إعداد أحادية من الخلايا المستهدفة وزراعة أحادية من الخلايا المُفعِّل لاستخدامها في تطوير أقنعة التحليل. يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة على مدة وتواتر الخلايا التائية لتفاعلات الخلايا السرطانية ، والحالات المرتبطة بالسمية الخلوية المعتمدة على الجينات في كل من خلايا الإنسان والفأر.نحن حاليا تطوير هذا الفحص في شاشة عالية الإنتاجية باستخدام الخلايا البشرية لتحديد المركبات التي تمنع من كبت المناعة بوساطة الخلية النخاعية وبالتالي تعزيز فعالية مثبطات نقطة التفتيش.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

السابقين فيفو تصوير لمفاوية T CD8 المقيم في ورم الرئة البشرية شرائح باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل]

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

الكشف عن إمكانات غشاء الميتوكوندريا لدراسة CLIC4 HN4 المستحثة بضربه قاضية الخلية المبرمج في المختبر

Depletion of the mitochondrial membrane potential (MMP, &#916;&#936;m) is considered the earliest event in the apoptotic cascade. It even occurs ahead of ...

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

بروتوكول عزل الخلايا الجذعية المشتقة من الوحيدات الماوس ومن تفعيل اللاحقة في المختبر مع مجمعات محصنة ضد الورم

Dendritic cells (DC) are heterogeneous cell populations that differ in their cell membrane markers, migration patterns and distribution, and in their ...

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

تدفق سيتوميتريك الكشف عن خلايا شبيهة بالخلايا الجذعية سرطان الثدي التي شكلت حديثا بعد عكس المبرمج

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

Intramucosal Inoculation of Squamous Cell Carcinoma Cells in Mice for Tumor Immune Profiling and Treatment Response Assessment

إينتراموكوسال تلقيح خلايا الخلايا الحرشفية في الفئران للورم التنميط المناعي وتقييم استجابة العلاج

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is a debilitating and deadly disease with a high prevalence of recurrence and treatment failure. To develop ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

في ريتشالينجي خلية الورم المختبر للتقييم التنبؤي من مستضد تشيميريك مستقبلات خلية تي انتيتومور الدالة

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

في المختبر الاختبار لدراسة التفاعل الورم الضامة

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

باستخدام الإنسان المستحثة الخلايا الجذعية مستحث لتوليد خلايا T الأورام مستضد محدده

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

توليد أورام البنكرياس التقويمية وتوصيف الجسم السابق للخلايا التي تتسلل إلى الخلايا T

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

قياس الاستجابة للمخدرات في الوقت الحقيقي في شرائح أنسجة الورم Organotypic

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...