Name: real time detection of in vitro tumor cell apoptosis induced by cd8+ t cells to study immune suppressive functions of tumor-infiltrating myeloid cells
Uploaded: 2019-01-29T12:30:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells at JoVE

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra the Wellcome Trust (101067/Z/13/Z (JWP), 109657/Z/15/Z (TK), 615KIT/J22738 (TK), UK) og MRC (hr./N022556/1 (JWP, TK), UK). NOC og DDS anerkender støtte fra nationale fænotypiske Screening centrum Phenomics Discovery initiativ og Cancer Research UK (NOC)

<ol>
	<li>Barry, M., Bleackley, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+T+lymphocytes:+all+roads+lead+to+death.">Cytotoxic T lymphocytes: all roads lead to death.</a> Nature Reviews in Immunology. 2, 401-409 (2002).</li><li>Durgeau, A., Virk, Y., Corgnac, S., Mami-Chouaib, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+targeting+CD8+T-cell+immunity+for+more+effective+cancer+immunotherapy.+Frontiers+in+Immunology.">Recent advances in targeting CD8 T-cell immunity for more effective cancer immunotherapy. Frontiers in Immunology.</a> 9. , 14 (2018).</li><li>Tanaka, A., Sakaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cells+in+cancer+immunotherapy.">Regulatory T cells in cancer immunotherapy.</a> Cell Research. 27, 109-118 (2017).</li><li>Fleming, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+myeloid-derived+suppressor+cells+to+bypass+tumor-induced+immunosuppression.">Targeting myeloid-derived suppressor cells to bypass tumor-induced immunosuppression.</a> Frontiers in Immunology. 9, 398 (2018).</li><li>Cassetta, L., Kitamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+targeting:+opening+new+possibilities+for+cancer+immunotherapy.">Macrophage targeting: opening new possibilities for cancer immunotherapy.</a> Immunology. 155, 285-293 (2018).</li><li>Chahroudi, A., Silvestri, G., Feinberg, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+T+cell-mediated+cytotoxicity+using+fluorogenic+caspase+substrates.">Measuring T cell-mediated cytotoxicity using fluorogenic caspase substrates.</a> Methods. 31, 120-126 (2003).</li><li>Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+flow+cytometric+assays+for+monitoring+cell-mediated+cytotoxicity.">New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity.</a> Expert Review of Vaccines. 9, 601-616 (2010).</li><li>Azimi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification,+isolation,+and+functional+assay+of+regulatory+T+Cells.">Identification, isolation, and functional assay of regulatory T Cells.</a> Immunological Investigation. 45, 584-602 (2016).</li><li>Bruger, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+measure+the+immunosuppressive+activity+of+MDSC:+assays,+problems+and+potential+solutions.">How to measure the immunosuppressive activity of MDSC: assays, problems and potential solutions.</a> Cancer Immunology Immunotherapy. , (2018).</li><li>Qian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+macrophage+population+mediates+metastatic+breast+cancer+cell+extravasation,+establishment+and+growth.">A distinct macrophage population mediates metastatic breast cancer cell extravasation, establishment and growth.</a> PLoS One. 4, e6562 (2009).</li><li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytes+differentiate+to+immune+suppressive+precursors+of+metastasis-associated+macrophages+in+mouse+models+of+metastatic+breast+cancer.">Monocytes differentiate to immune suppressive precursors of metastasis-associated macrophages in mouse models of metastatic breast cancer.</a> Frontiers in Immunology. 8, 2004 (2018).</li><li>Bronte, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+myeloid-derived+suppressor+cell+nomenclature+and+characterization+standards.">Recommendations for myeloid-derived suppressor cell nomenclature and characterization standards.</a> Nature Communications. 7, 12150 (2016).</li><li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCL2-induced+chemokine+cascade+promotes+breast+cancer+metastasis+by+enhancing+retention+of+metastasis-associated+macrophages.">CCL2-induced chemokine cascade promotes breast cancer metastasis by enhancing retention of metastasis-associated macrophages.</a> Journal of Experimental Medicine. 212, 1043-1059 (2015).</li><li>Ewens, A., Mihich, E., Ehrke, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distant+metastasis+from+subcutaneously+grown+E0771+medullary+breast+adenocarcinoma.">Distant metastasis from subcutaneously grown E0771 medullary breast adenocarcinoma.</a> AnticancerResearch. 25, 3905-3915 (2005).</li><li>Choppa, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+PCR+for+the+detection+of+Mycoplasma+fermentans,+M.+hominisandM.+penetransin+cell+cultures+and+blood+samples+of+patients+with+chronic+fatigue+syndrome.">Multiplex PCR for the detection of Mycoplasma fermentans, M. hominisandM. penetransin cell cultures and blood samples of patients with chronic fatigue syndrome.</a> Molecular and Cellular Probes. 12, 301-308 (1998).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current protocols in immunology. , (2001).</li><li>Koyanagi, M., Kawakabe, S., Arimura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+colorimetric+cell+proliferation+assays+in+immune+cells.">A comparative study of colorimetric cell proliferation assays in immune cells.</a> Cytotechnology. 68, 1489-1498 (2016).</li><li>Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid-derived-suppressor+cells+as+regulators+of+the+immune+system.">Myeloid-derived-suppressor cells as regulators of the immune system.</a> Nature Reviews in Immunology. 9, 162-174 (2009).</li><li>Cassetta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+and+human+tumor-associated+macrophages.">Isolation of mouse and human tumor-associated macrophages.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 899. 899, 211-229 (2016).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Denne metode er baseret på to separate Co kultur trin: Co dyrkning CD8+ T celler med potentielle suppressor celler, og co dyrkning 'konditionerede' CD8+ T celler med mål tumorceller (figur 1). Det første skridt i fælles kultur er meget lig at for CD8+ T celle spredning assays almindeligt anvendt til at bestemme virkningen af suppressor celler på CD8+ T-cellefunktion. Men T celleproliferation, ikke altid er korrelerer med deres cytotoksicitet. For eksempel, har vi fundet at co kultur med M-MDSCs eller MAMs steg i stedet for reduceret spredning af CD8+ T-celler i overværelse af CD3/CD28 aktivering antistoffer (supplerende figur 3), boer disse præ aircondition CD8+ T-celler viste reduceret cytotoksicitet mod målrette kræftceller (figur 4, figur 5, figur 6). Disse resultater fremhæve betydningen af evalueringen af funktionelle aktivitet, fremgår af target kræft celle apoptose, der tilbydes af denne CD8+ T-celle cytotoksicitet assay.
I denne analyse har vi identificeret at CD8+ T celler kræver ca 15 h af fælles kultur for at fremkalde maksimal apoptose af E0771-LG mus brystkirtler tumorceller (figur 5). Denne forsinkelse kan skyldes forsinkelse mellem første kontakt af effektor celler med mål samt ledsagende immun synapse dannelse og tidsforbruget til at inducere apoptotisk signaler i mål som målt ved aktivering af caspase-3 (supplerende film 1 ). Vi har også identificeret som antallet af apoptotiske tumorceller nået et plateau efter 24 h, som er sandsynligvis på grund af afskaffelsen af mål af T-celler og/eller tab af fluorescerende signal fra døde celler. Denne evne til at identificere tidspunktet for peak apoptose er en væsentlig fordel ved denne analyse, da fastsættelse af et optimalt tidspunkt er vigtigt for passende sammenligninger mellem forskellige betingelser. I vores tilfælde f.eks forskellen i cytotoksicitet mellem kontrol CD8+ T celler og MDSC/MAM-uddannet CD8+ T celler var meget større på 15-18 h i forhold til 72 h (figur 5), og dermed et slutpunkt eksperiment ved hjælp af en 72 h inkubationstiden ville give misvisende resultater.
Denne metode giver også mulighed for visualisering af real-time effektor til målcellen interaktion, som ville give større indsigt i den mekanisme, der ligger til grund for begrænset cytotoksicitet af CD8+ T celler pre inkuberes med suppressor celler. For eksempel, vi bemærkede, at CD8+ T celler pre inkuberes med M-MDSCs eller MAMs stødt og kommunikerede med mål tumorceller men ikke altid inducerer apoptose (supplerende film 4, supplerende film 5, supplerende film 6). Selvom vi ikke sætte tal på denne begivenhed, vil det være muligt og interessant at måle og sammenligne andelen af møder og deres interaktion tid i sammenhæng med apoptose induktion. En anden stor fordel er, at denne metode kræver et lille antal celler (f.eks., 1 x 103 mål) og effektor celler pr. brønd 4 x 10,3 . I virkeligheden, kan denne protokol være yderligere miniaturized til 384-godt plade-format, hvis det ønskes. Denne analyse er derfor velegnet til high throughput screening og eksperimenter hvor celle tal er begrænset, såsom in vitro- test ved hjælp af precious celler stammer fra in vivo eller ex vivo prøver.
På den anden side er en begrænsning af den nuværende assay tilstedeværelsen af betydelige antal døde effektor celler i nogle betingelser. For at øge nøjagtigheden i skelne apoptose af målrette kræftceller fra af effektor CD8+ T celler, kerner af target celler er mærket og en kerner størrelse begrænsning (der udelukker effektor celler) anvendes til dataanalyse i dette assay (figur 2). Der er dog visse tilfælde hvor overlejring af aggregater af (grøn) apoptotiske CD8+ T celler på ikke-apoptotiske målrette kræftceller, som kan forvirre resultaterne. Denne begrænsning kan afbødes ved hjælp af en død celle fjernelse kolonne på effektor celler før Co kultur med mål tumorceller, under forudsætning af tilstrækkelig antal effektorceller celler er tilgængelige. Med mere komplekse mikroskopi systemer, kan det også være muligt at reducere de falsk positive signal ved mærkning effektor CD8+ T celler med en fluorophore adskilt fra target cellekerner og fluorogenic caspase-3 substrat.
Hidtil har denne protokol er blevet udnyttet til at undersøge antigen non-specifik aktivering af CD8+ T celler. Selv om MDSCs og TAMs i tumor mikromiljø undertrykke T-cellefunktioner gennem antigen uspecifikke mekanismer, undertrykke MDSCs i de perifere lymfevæv T-celle respons i en antigen specifikke måde18. For at undersøge immun suppressiv funktioner af disse celletyper, en in vitro-spredning analyse ved hjælp af CD8+ T celler fra OT-1 Transgene mus er almindeligt anvendt. I denne analyse, OT-1 T-celler (udtrykker ægalbumin (æg) specifikke T-celle receptoren) er co kulturperler med suppressor MDSCs i nærværelse af æg peptider, som er gældende for den første kultur i vores cytotoksicitet assay (dvs.., aktiveringen af T-celler i tilstedeværelse eller fravær af undertrykkerne). Det er også muligt at manipulere målrette kræftceller til at udtrykke æg, som kan fremkalde antigen-specifikke kræft celle drab af OT-1 T-celler. Derfor vil analysen også aktivere undersøgelse af MAM/MDSC-medieret undertrykkelse af antigen-specifikke T-celle aktivering. Det er også muligt at anvende analyse for at undersøge menneskelige celler, som aktivering antistoffer mod CD3 og CD28 er kommercielt tilgængelige, og en protokol til at isolere menneskelige TAMs fra kliniske prøver er blevet etableret19.
Kollektivt, denne analyse er meget alsidig og kan bruges til at undersøge cytotoksicitet af andre immun celletyper. I øjeblikket, i vores laboratorier, det er også for at undersøge antigen-afhængige celle cytotoksicitet under forskellige forhold og er også ved at blive udviklet for høj overførselshastighed screening.

Det er kendt at CD8+ T celler kan fjerne tumorceller, når de udøver deres fulde cytotoksicitet. Efter aktivering af T-celle receptoren (TCR), CD8+ T celler formere sig og differentiere sig til cytotoksiske effektor celler. Den udvidede og aktiverede CD8+ T celler udskiller cytotoksiske granulat, herunder perforin og granzymes, der overføres til target-cellerne og indlede forskellige lytisk veje såsom caspase-3 medieret apoptose1. CD8+ T celler kan også inducere tumor celle apoptose ved aktivering receptorer på target-cellerne, såsom receptorer for tumor nekrose faktor-α (TNF-α), første apoptose signal ligand (FasL) eller TNF-relaterede apoptose-inducerende ligand (spor). Desuden aktiveres CD8+ T celler udskiller interferon-γ (IFN-γ), der kan undertrykke tumor celleproliferation og øge følsomheden af tumorceller til CD8+ T-celler via op-regulering af FasL receptor1. I lyset af potentialet for CD8+ T tumor drab evne, flere strategier til at øge deres cytotoksicitet (f.eks. checkpoint hæmmere, kræft vaccination og adoptiv overførsel af kimære antigen receptor (bil) udtrykker T-celler) er blevet etableret og vist betydelige terapeutiske virkninger på visse typer af kræft2. Dog, akkumulere beviser tyder på, at tumor infiltrerer immun celler som regulerende T-celler, myeloid-afledte suppressor celler (MDSCs), og tumor-associerede makrofager (TAMs) kan undertrykke CD8+ T celle funktioner og begrænse effekten immunoterapi3,4,5. For at forbedre sådanne immunoterapi, det er vigtigt at forstå, hvordan immun suppressor celler grænse CD8+ T-celle cytotoksicitet. Identifikation af CD8+ T-celle undertrykkelse mekanismer samt druggable mål at overvinde det, vil kræve udvikling og udnyttelse af in vitro-assays.
Guld standard metode til måling af CD8+ T-celle cytotoksicitet er chrom release analysen, hvor frigivelsen af den radioaktive sonde (51Cr), fra target celler der er mængden af CD8+ T-celler, er fast besluttet på6. Denne analyse har dog flere ulemper, herunder relativt lav følsomhed, høj baggrund, manglende evne til at opdage tidlige apoptotiske hændelser, farlige bortskaffelse problemer og begrænset kompatibilitet med automatiseret flydende håndtering og registrering for at støtte højere overførselshastighed applikationer. En anden fælles metode er flow cytometric analyser, hvor apoptose af mål tumorceller registreres af annexin V bindende7. I denne analyse er det muligt at opdage andre parametre såsom target celledød ved hjælp af propidium Iodid (PI) eller 7-aminoactinomycin D (7-AAD) og effektor celle aktivering angivet ved CD107a eller CD69 udtryk, ud over apoptose i målcellerne7 . Denne analyse kræver imidlertid stort antal suppressor celler i forhold til chrom release assay. Det kræver også detachment og opdeling af vedhængende målcellerne og dette kan bias resultaterne. Faktisk, chrom frigive assay eller flow cytometric analyse ikke er almindeligt anvendt til at undersøge suppressor celle effekter på T-cellefunktioner. I stedet, måling af T-celle spredning angivet ved fortynding af et fluorescerende farvestof (f.eks. CFSE) pre-loaded ind i T-celler er ofte bruges til at evaluere hæmning af CD8+ T-cellefunktion af suppressor celler. Påvisning af IFN-γ produktion fra kulturperler T celler er en anden standard metode til at vurdere virkningerne af suppressor celler på T-celle aktivering8,9. Men resultaterne fra disse assays ikke nødvendigvis korrelerer til målcellen drab evne af CD8+ T celler.
Vi præsenterer her en alternativ funktionel analyse for at evaluere virkningerne af suppressor celler, især makrofager i metastatisk tumorer, på cytotoksicitet af CD8+ T celler. Denne metode bestemmer cytotoksicitet af CD8+ T celler, pre kulturperler med eller uden suppressor celler i overværelse af anti-CD3/CD28 aktiverende antistoffer, ved at opdage tumor celle apoptose, anført af fluorescens fra en fluorogenic caspase-3 substrat6 ved hjælp af automatiseret time-lapse mikroskopi (figur 1). Denne protokol har flere fordele sammenlignet med andre metoder; Det kræver kun et lille antal celler, giver mulighed for påvisning af vedhængende tumor celledød med høj følsomhed, kan billedet real-time effektor-til-målet interaktion og er modtagelig for high throughput screening.
I denne protokol bruges metastase-associerede makrofager (MAMs) og deres stamfader monocytic-MDSCs (M-MDSCs) isoleret fra metastatisk tumorer i mus som suppressor celler. I musemodeller af metastatisk brystkræft, en særskilt population af makrofager karakteriseret som F4/80højeLy6G-CD11bhøjLy6Clav ophobes i lungerne som indeholder metastatisk tumorer. Denne makrofag befolkning er sjældent fundet i den normale lunge og dermed kaldes metastase-associerede makrofager (MAMs)10. I disse musemodeller, en anden myeloide celler befolkning, defineret som F4/80højeLy6G-CD11bhøjLy6Chøj, også ophobes overvejende i metastatisk lunge hvor det giver anledning til MAMs11. Baseret på deres egenskaber, kan CD11bhøjLy6Chøj MAM stamfader celler repræsentere M-MDSCs12.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin EDTA (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Freiner Bio-One</td>
			<td>665-180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL Plystyrene Round-Bottom Tube</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Cell Culture Plate (Round Bottom )</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3799</td>
			<td>Co-culture of CD8+T cells with sorted myeloid cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate (Flat bottom)</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>165305</td>
			<td>Co-culture of CD8+T cells with target cells for cytotoxicity assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF647 anti-mouse F4/80 Antibody</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>MCA497A647</td>
			<td>Clone: CIA3-1, Lot#: 1707, 2 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor700 anti-mouse CD8 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100730</td>
			<td>Clone: 53-6.7, Lot#: B205738, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD28 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102111</td>
			<td>Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 37.51, Lot#: B256340</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD3e Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100314</td>
			<td>Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 145-2C11, Lot#: B233720</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD3 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100236</td>
			<td>Clone: 17A2, Lot#: B198730, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cy7 anti-mouse Ly6C Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>128026</td>
			<td>Clone: HK1.4, Lot#: B248351, 1 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albmin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1470-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer (100&#956;m Nylon)</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352360</td>
			<td>To smash the spleen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer (40&#956;m Nylon)</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352340</td>
			<td>To filter the lung digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>422801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8242;s Modified Eagle&#8242;s Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>19853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse CD4 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100406</td>
			<td>Clone: GK1.5, Lot#: B179194, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex Ready-to-Use</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1596-01</td>
			<td>Coating the 96-well plates for cytotoxicity assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte NucLight Red Lentivirus Reagent</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>4476</td>
			<td>Lenti viral particules encoding mKate2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte ZOOM</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td></td>
			<td>Detector (fluorescence microscope)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte ZOOM 2018A</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td></td>
			<td>Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2916801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lung Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-095-927</td>
			<td>Preparation of single cell suspension from the tumor-bearing lung</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MycoAlert Mycoplasma Detection Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>LT07-318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acid (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucView488</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>10403</td>
			<td>Fluoregenic caspase-3 substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse Ly6G Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>127607</td>
			<td>Clone: 1A8, Lot#: B258704, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 anti-mouse CD11b Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101216</td>
			<td>Clone: M1/70, Lot#: B249268, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Penicillin Streptomycin for primary culture of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103132</td>
			<td>Clone: 30-F11, Lot#: B249564, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene (Hexadimethrine bromide)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis Buffer (10X)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine IL-2</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>212-12</td>
			<td>Activation of isolated CD8+ T cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruStain fcX (anti-mouse CD16/32) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>&#160;: Nikon 10X objective (resolution 1.22 &#181;m) 
			&#160;: Green channel excitation: 440 - 480 nm 
			&#160;: Green channel emission: 504 - 544 nm 
			&#160;: Red channel excitation: 565-605 nm 
			&#160;: Red channel emission: 625 - 705 nm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real time detection of in vitro tumor cell apoptosis induced by cd8+ t cells to study immune suppressive functions of tumor-infiltrating myeloid cells

Potensering af tumor-drab evne til CD8+ T celler i tumorer, sammen med deres effektive tumor infiltration, er et centralt element i vellykket immunoterapi. Flere undersøgelser har vist, at tumor infiltrerer myeloide celler (fx myeloid-afledte suppressor celler (MDSCs) og tumor-associerede makrofager (TAMs)) undertrykke cytotoksicitet af CD8+ T-celler i tumor mikromiljø, og at målrette disse lovgivningsmæssige myeloide celler kan forbedre immunoterapi. Vi præsenterer her, en in vitro assay system for at vurdere immun suppressiv virkninger af monocytic-MDSCs og TAMs på tumor-drab evne til CD8+ T celler. Til dette formål, vi først kulturperler naive milt CD8+ T-celler med anti-CD3/CD28 aktiverende antistoffer i tilstedeværelse eller fravær af suppressor celler, og derefter Co kulturperler pre-aktiveret T celler med målrette kræftceller i tilstedeværelse af en fluorogenic caspase-3 substrat. Fluorescens fra substrat i kræftceller blev opdaget af real-time Fluorescens mikroskopi som en indikator for T-celle induceret tumor celle apoptose. I denne analyse, kan vi med succes afsløre stigning af tumor celle apoptose af CD8+ T celler og dets undertrykkelse af pre kultur med TAMs eller MDSCs. Denne funktionelle analyse er nyttige for efterforskningen CD8+ T celle undertrykkelse mekanismer af regulerende myeloide celler og identificerer druggable mål at overvinde det via high throughput screening.

Denne metode er baseret på enkle Co kultur af målrette kræftceller med effektor CD8+ T celler, der har været præ kulturperler, med eller uden suppressor celler i overværelse af anti-CD3/CD28 aktiverende antistoffer. Det registrerer CD8+ T-celle-induceret kræft celle apoptose over tid efter fælles kultur, således at evaluering af virkningerne af suppressor celler på cytotoksicitet af CD8+ T celler.
Typisk, kræftceller øge grøn fluorescens i deres kerner efter aktivering af en nuklear-targeting caspase biosensor når disse celler tage kontakt med CD8+ T celler der er pre-aktiveret af antistoffer i mangel af suppressor celler () Figur 3; Supplerende Movie 1). Grøn fluorescens fra caspase substratet var påvises for mindst 15 h efter apoptose blev indledt. Nogle spontane apoptose af effektor CD8+ T celler blev også observeret over tid, selv om disse celler blev kulturperler i isolation (figur 4; Supplerende Movie 2). Dog kerner størrelser af CD8+ T celler er mindre end de af kræftceller og dermed apoptotiske 'effektor' celler kan udelukkes fra apoptotiske 'target' celle tæller af en størrelse begrænsning billede analysemetode (figur 2 og figur 4). Selvom nogle målrette kræftceller viser en lille afrundet form uden grønne fluorescens, påvirker dette ikke analysen, som disse celler er under mitosen snarere end apoptose (supplerende film 3), og dermed er udelukket fra apoptotiske 'mål' celle tæller med en rød/grøn overlapning maske (tillægs figur 2). Spontan apoptose af målrette kræftceller er lejlighedsvis fundet selv i den fælles kultur (supplerende film 3). Men fælles kultur af target kræft celler med pre-aktiveret CD8+ T celler øget tumor celle apoptose over niveauerne af spontan apoptose i monokultur af kræftceller (figur 4). Generelt, når du bruger et optimalt forhold af målrette kræftceller til effektor celler, et højdepunkt i antallet af apoptotiske målrette kræftceller kan observeres (figur 5A). Denne peak er tydeligere, når dataene er udtrykt som den apoptotiske brøkdel af celle målgruppen (figur 5B). I dette eksperiment de basale apoptose af mål tumorceller toppede 24 h (med apoptotiske brøkdel = 0,08), men CD8+ T-celle-induceret apoptose nået et maksimalt niveau på 17 h (med apoptotiske brøkdel = 0.66).
Det fandt vi yderligere CD8+ T celler pre inkuberes med MAMs eller M-MDSCs kunne gøre kontakt med target kræftceller, men denne kontakt syntes at resultere i færre tilfælde af kræft celle apoptose i forhold til CD8+ T celler pre-aktiveret uden suppressor celler (figur 3 og figur 4; Supplerende Movie 4 og supplerende film 5). Selv om CD8+ T celler pre inkuberes med myeloide celler lejlighedsvis induceret kræft celle apoptose, der var også nogle spredning af target kræftceller, der ikke har været stimuleret til at gennemgå apoptose tid i løbet af de eksperiment (supplerende film 6). I overensstemmelse med disse resultater, peak brøkdel af apoptotiske kræftceller kulturperler med CD8+ T celler pre inkuberes med myeloide celler (apoptotiske brøkdel = 0,38 på 23 h for MDSC-E og 0,25 på 20 h for MAM-E) var betydeligt lavere end i kræftceller kulturperler med CD8+ T celler som ikke pre rugede med suppressor celler (figur 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig1.jpg"> Figur 1: en ordning viser forsøgsmetoden. Naive milt CD8+ T celler er kulturperler med anti-CD3/CD28 aktiverende antistoffer med eller uden metastaser-associerede makrofager (MAMs) eller monocytic-myeloid-afledt suppressor celler (M-MDSCs). Efter 4 dage, flydende CD8+ T celler er indsamlet og co kulturperler med målrette kræftceller i overværelse af fluorogenic caspase-3 substrat. Apoptotiske kræftceller er påvist under real-time Fluorescens mikroskopi. Billeder vist er anskaffet ved hjælp af en levende celle-imaging platform (Se Tabel af materialer). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig2.jpg"> Figur 2: identifikation af apoptotiske målceller adskiller sig fra apoptotiske effektor celler. Øverste række: Image erhvervelse i den røde kanal giver mulighed for identifikation af target cellekerner af target detection maske (pink analyse mask). Mellemste række: billeder erhvervet i den grønne kanal angive apoptotiske effektor og target-cellerne. Asize begrænset apoptose maske (krikand analyse maske; større end 80 µm2) tillader én apoptotic effektor celler skal udelukkes fra analysen. Nederste række: sammensatte billeder flettede røde og grønne kanaler med fase kontrast billede (til venstre) eller rød/grøn overlapper maske (til højre). Identifikation af co lokaliseret, størrelse-begrænset grønne fluorescens med røde fluorescens (gul analyse maske), tillader mere nøjagtig detektering af apoptotiske målet kerner (gul pilespids) ved at udelukke aggregater af apoptotiske effektor celler (hvid pilespidser). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig3.jpg"> Figur 3: Interaktion mellem CD8+ T celler og kræftceller. Stills fra repræsentative time-lapse film af E0771-LG_NLR målceller (T) Co kulturperler med effektor CD8+ T celler (E) på 4:1 effektor/target ratio. MDSC-E og MAM-E angiver effektor celler pre inkuberes med M-MDSCs og MAMs henholdsvis. Sammensatte billeder (herunder billeder fra fase kontrast, røde og grønne kanaler) er vist. Pilespidser sporer de samme celler gennem de forskellige områder og tidspunkter. Gul pilespidser: et mål, der knytter til effektorer og undergår apoptose, hvid pilespidser: et mål, der knytter til effektorer men ikke undergår apoptose. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig4.jpg"> Figur 4: påvisning af apoptotiske kræftceller. Repræsentative felter udvundet fra time-lapse film på 18 h efter billeddannelse. Sammensatte billeder (venstre, fase kontrast, røde og grønne kanaler) og billeder fra rød kanal uden (midten) eller (til højre) rød/grøn overlapning maske (gul) er vist. Gule prikker i højre kolonne repræsenterer apoptotiske kræftceller. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig5.jpg"> Figur 5: CD8+ T-celle-induceret kræft celle apoptose. (A) antallet af apoptotiske kræftceller kulturperler med effektor C8+ T-celler på forskellige effektor til target ratio (E:T). (B) apoptotiske brøkdel af målpopulationen celle. Data er middel ± SD. betyder arealet under kurven (AUC) er også vist. Parrede t-test med welchs korrektion blev brugt til at analysere AUC. * P < 0,0001 i forhold til E:T = 0:1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig5large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig6.jpg"> Figur 6: Virkninger af tumor infiltrerer myeloide celler på cytotoksicitet af CD8+ T celler. (A) antallet af apoptotiske kræftceller (mål: T) kulturperler med C8+ T celler (effektor: E) på 4:1 E:T ratio. CD8+ T celler var pre kulturperler i fravær (sort cirkel) eller tilstedeværelsen af monocytic-myeloid-afledt suppressor celler (MDSC-E: blå cirkel) eller metastase-associerede makrofager (MAM-E: rød cirkel). Data er middel ± SD. (B) apoptotiske brøkdel af målpopulationen celle. Data er middel ± SD. betyde AUC er også vist. Parrede t-test med welchs korrektion blev brugt til at analysere AUC. * P < 0,0001 i forhold til T, #P < 0,0001 sammenlignet med E + T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig6large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Tillægs figur 1. Gating strategi at isolere suppressor celler fra metastatisk lunge. (A) repræsentative dot grunde til at isolere monocytic myeloid-afledte suppressor celler (M-MDSCs) og metastaser-associerede makrofager (MAMs). Tærsklen på Ly6C plan at skelne MAMs (Ly6Clav) og M-MDSCs (Ly6Chøj) er baseret på bopæl alveolær makrofager (RMAC). (B) renhed af de sorterede M-MDSCs (CD45+Ly6G-CD11b+Ly6Chøj) og MAMs (CD45+Ly6G-CD11b+Ly6Clav). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/FigureS1_Rvd.pdf">Venligst klik her for at downloade denne fil.</a>
Tillægs figur 2. Repræsentative billeder af mitotiske target-cellerne. Stills fra repræsentative time-lapse film af mål E0771-LG_NLR celle mono-kultur. Top: sammensatte billeder herunder billeder fra fase kontrast, røde og grønne kanaler. Bund: sammensatte billeder (røde og grønne kanaler) med rød/grøn overlapper maske. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/FigureS2_Rvd.pdf">Venligst klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende figur 3. Virkningerne af tumor infiltrerer myeloide celler om spredning af CD8+ T-celler. (A) repræsentative histogrammer viser fortynding af fluorescerende mærkning med CFSE i CD8+ T celler. Naive milt CD8+ T celler blev isoleret som beskrevet i protokollen-3 og mærket med 5 µM af CFSE ved 37 ° C i 15 min. Mærket T celler var kulturperler i overværelse af IL-2 og anti-CD3/CD28 aktivering antistoffer med eller uden myeloide celler som beskrevet i protokol 4. Efter 4 dage, blev grønne fluorescens i T-celler opdaget af flow Flowcytometret. (B) Division indeks af CD8+ T celler beregnet som tidligere beskrevet17. Data er middel ± SEM. * P < 0,01 i forhold til at styre, #P < 0,05 i forhold til αCD3/CD28 Ab. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/FigureS3_Rvd.pdf">venligst klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende Movie 1. Film i figur 3 og 4; E + T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS1.mp4">Venligst klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende Movie 2. Film i figur 3 og 4; Effektor (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS2.mp4">Venligst klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende film 3. Film i figur 3 og 4; Mål (T). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS3.mp4">Venligst klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende Movie 4. Film i figur 3 og 4; MDSC-E + T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS4.mp4">Venligst klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende film 5. Film i figur 3 og 4; MAM-E + T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS5.mp4">Venligst klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende film 6. Film i figur 3 og 4; MAM-E + T (spredning). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS6.mp4">Venligst klik her for at downloade denne fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells at JoVE

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Vi beskriver her en protokol for at undersøge cytotoksicitet af pre-aktiveret CD8+ T celler mod kræftceller ved at afsløre apoptotiske kræft celler via real-time mikroskopi. Denne protokol kan undersøge mekanismerne bag myeloide celler-induceret T celle undertrykkelse og evaluere forbindelser sigter efterfyldning T celler via blokade af immun suppressiv myeloide celler.

Realtid påvisning af i Vitro Tumor celle apoptose induceret af CD8+ T-celler til at studere immun suppressiv funktioner af Tumor infiltrerer myeloide celler

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Vores protokol vurderer virkningerne af myeloid-afledte suppressor celler og tumor-associerede makrofager i T-celle-induceret tumorcelle apoptose. Sideløbende med undersøgelsen af de underliggende mekanismer for potentielle terapeutiske indgreb. Denne protokol evaluerer direkte T-celle-induceret tumorcelle apoptose med høj følsomhed og muliggør langsgående analyse og billeddannelse af celle-til-celle interaktioner.Effekten af checkpoint-hæmmer er bedst ses på af tumor-infiltrerende myeloid celler i visse tumortyper. Denne teknik kan føre til identifikation af nye behandlinger for disse tumorer. Denne metode kunne ikke kun fremme kræft immunologi forskning, men kunne potentielt også give indsigt i immundefekt og autoimmune sygdomme.Til aktivering og udvidelse af miltisolerede CD8-positive T-celler skal først tages i brug én gange 10 til den femte CD8-positive T-celler i 50 mikroliter E-DMEM i individuelle brønde i en 96-brønd U-bundplade. Dernæst tilsættes en gange 10 til den femte suppressor celler i 50 mikroliter af E-DMEM, eller 50 mikroliter af E-DMEM alene, i hver brønd af T-celler. Derefter tilsættes 50 mikroliter frisklavet aktiveringsmedium og 50 mikroliter af E-DMEM, med eller uden de relevante testagenser, til de relevante brønde.Og placere pladen i en 37-graders-Celsius og 5% kuldioxid inkubator med 95% fugtighed i fire dage. For at oprette en pre-aktiveret CD8-positiv T-celle målcelle co-kultur, først tilføje 30 mikroliter af 1-til-100-fortyndet vækst-faktor-reduceret opløselige kælder membran matrix til de relevante brønde af en 96-godt flad bund plade, egnet til mikroskopi. Ryst pladen for at sprede matrixen jævnt, og placer pladen i cellekulturkubatoren i mindst en time.Mens pladen er ligevægt, forberede målcellerne. Aspirere mediet, vask med PBS, og tilsæt en milliliter 05%Trypsin-EDTA ved stuetemperatur i et minut. Der tilsættes ni milliliter DMEM suppleret med føtalt kvægserum ved skånsom pipettering, og de dissocierede celler overføres til rør.Efter centrifugering af cellerne, resuspend pallen i 500 mikroliter af E-DMEM. Filtrer de resuspenderede celler gennem en celles si, og tæl de levende celler. Juster derefter tætheden til fire gange 10 til de fjerde målceller pr. milliliter i frisk E-DMEM på is.Dernæst pipette de foraktiverede CD8-positive T-celler et par gange for at resuspendre cellerne i en enkelt celle suspension, og overføre de flydende T-celler i en 1,5-milliliter rør per tilstand. Opsaml eventuelle resterende celler med 200 mikroliter PBS pr. brønd, overfør vaskene til de relevante 1,5 milliliterrør og centrifuge. Aspirer mediet og tilsæt en milliliter E-DMEM til hvert rør til centrifugering.Efter centrifugering opsuspenrede pellets i 100 mikroliter af frisk E-DMEM pr. rør. Efter optælling justeres cellerne i hvert rør til en massetæthed på 1,6 gange 10 til de femte foraktiverede CD8-positive T-celler pr. milliliter medium, og cellerne anbringes på is. Når cellerne er klar, aspirere kælderen membran matrix fra hver brønd af 96-brønd mikroskopi plade, og tilsæt 50 mikroliter af målceller til individuelle brønde i de indre 60 brønde af pladen med blanding.Der tilsættes 25 mikroliter E-DMEM suppleret med fire gange 10 til de tredje enheder pr. milliliter IL2 og 10 mikromolar fluorogen caspase-3-substrat til de relevante brønde. Derefter tilsættes 25 mikroliter af foraktiverede CD8-positive T-celler til de relevante brønde. Og endelig, tilføje E-DMEM til de relevante brønde til at gøre en samlet volumen på op til 100 mikroliter.Tilsæt 200 mikroliter PBS eller sterilt vand i alle de tomme brønde. Ryst pladen, og lad pladen være på en flad overflade i 10 minutter. Hvis du vil afbilde cellerne, skal du indstille mikroskopet til at hente billeder i fasekontrast.Samt fluorescenskanaler, der er egnede til det nukleart begrænsede fluorescerende protein, og de fluorogenaktiverede caspase-3-substratfluorofe, der anvendes i forsøget. Derefter tage billeder af hver eksperimentel brønd i fase kontrast og de to fluorescens kanaler hver en til tre timer i mindst 72 timer. Hvis du vil analysere de optagne billeder, skal du åbne et billede fra et kontrolelement, der kun indeholder målceller og medium uden caspase-3-underlag i fluorescenskanalen, der bruges til substratsignal.Vær opmærksom på, om der udsendes et uhensigtsmæssigt fluorescenssignal af kernerne. Hvis substratsignalet er synligt i kernerne, skal du bruge spektrale ubblanding for at øge procentdelen af substratsignal, der fjernes fra kernesignalet, indtil substratsignalet forsvinder. Dernæst se en kontrol brønd, der kun indeholder kerner umærket effektor celler i medium uden caspase-3 substrat i de to fluorescens kanaler individuelt.Vær opmærksom på, om der udsendes et signal af kernerne. Hvis der ikke er noget signal i de enkelte kanaler, er det ikke nødvendigt at foretage spektral ubblanding. Hvis du vil løse fluorescerende objekterne i begge fluorescenskanaler, skal du bruge en fluorescensbaggrundsundertræktningsmetode med relevante parametre for prøven og de relevante parametre for kantspaltning.Brug billeder af målcelle monokultur til at etablere parametre for målcelle nuklear fluorescens. Brug billeder af effektor celle monokultur til at etablere parametre for substrat-induceret apoptotisk nuklear fluorescens. Brug billeder af co-kultur til at kontrollere eller forfine parametre for substrat-induceret apoptotisk nuklear fluorescens i målceller.For at bestemme minimumsstørrelsen af målkernerne skal du bruge billeder i kernesignalkanalen fra brøndene, der kun indeholder målceller med caspase-underlag. For at bestemme den gennemsnitlige størrelse af apoptota effektor kerner, bruge billeder i substrat signalkanal fra brønde, der kun indeholder effektor celler med caspase substrat. Hvis du vil tælle antallet af fluorescensmålcellekerner, skal du oprette en analyseprocedure ved hjælp af en passende minimumstørrelsesbegrænsning.Ved hjælp af effektor celle monokultur billeder, oprette en anden analyse procedure for at tælle antallet af apoptotiske kerner, der er større end den gennemsnitlige størrelse af apoptota effektor kerner. Derefter oprettes en tredje analyseprocedure for at tælle antallet af apoptotiske målceller ved at tælle antallet af kerner, hvor kernesignalet og det størrelsesbegrænsede substratsignal er betydeligt samlokaliseret. Typisk, kræftceller øge fluorescens signal i deres kerner efter aktivering af en nuklear-målretning caspase biosensor, når cellerne kommer i kontakt med CD8-positive T-celler pre-aktiveret af antistoffer i mangel af suppressor celler.Kernen størrelser af CD8-positive T-celler er mindre end kræftceller. Således kan apoptota effektorceller udelukkes fra apoptotiske målcelletal ved hjælp af en billedanalysemetode for størrelsesbegrænsning. Selv om nogle mål kræftceller udviser en lille afrundet form uden substrat fluorescens, dette påvirker ikke analysen.Da disse celler gennemgår mitose snarere end apoptose og dermed er udelukket fra apoptotiske målcelletal ved en nuklear substrat signal overlapper maske. Den co-kultur af målkræftceller med pre-aktiveret CD8-positive T-celler øger tumorcelle apoptose over niveauet af spontan apoptose i kræft celle monokulturer. Generelt, når du bruger et optimalt forhold mellem målkræftceller til effektor celler, et højdepunkt i antallet af apoptotiske mål kræftceller kan observeres.Denne top bliver mere tydelig, når dataene udtrykkes som den apoptotiske del af målcellepopulationen. Det vigtigste at huske, når du forsøger denne protokol er at oprette monokulturer af målceller og monokulturer af effektorceller til brug i udviklingen af analysen masker. Denne metode kan give indsigt i varigheden og hyppigheden af T-celle til kræft celle interaktioner, og de betingelser, der er forbundet med gen-afhængige cytotoksicitet i både menneskelige og museceller.Vi er i øjeblikket ved at udvikle denne analyse til en høj-throughput skærm ved hjælp af menneskelige celler til at identificere forbindelser, der hæmmer myeloid celle-medieret immunsuppression og dermed øge checkpoint hæmmer effekt.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Billeddannelse af hjemmehørende CD8 T-lymfocytter i menneskelige lunge Tumor skiver bruger konfokalmikroskopi

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

Påvisning af mitokondrier membran potentiale til at studere CLIC4 Knockdown-induceret HN4 celle apoptose In Vitro

Depletion of the mitochondrial membrane potential (MMP, &#916;&#936;m) is considered the earliest event in the apoptotic cascade. It even occurs ahead of ...

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Isolation protokol af musen monocyt-afledte dendritiske celler og deres efterfølgende In Vitro aktivering med Tumor immunkomplekser

Dendritic cells (DC) are heterogeneous cell populations that differ in their cell membrane markers, migration patterns and distribution, and in their ...

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

Flow Cytometric påvisning af nydannede brystkræft stamceller-lignende celler efter apoptose tilbageførsel

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

Intramucosal Inoculation of Squamous Cell Carcinoma Cells in Mice for Tumor Immune Profiling and Treatment Response Assessment

Intramucosal podning af pladecellekræft celler i mus til Tumor immun profilering og behandling svar vurdering

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is a debilitating and deadly disease with a high prevalence of recurrence and treatment failure. To develop ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

I Vitro Tumor celle Rechallenge For intelligent evaluering af kimære Antigen Receptor T-celle Antitumor funktion

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

In vitro-analyse for at studere tumor-makrofag interaktion

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Anvendelse af menneskeskabte pluripotente stamceller til generering af tumor antigen-specifikke T-celler

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation af Ortotopiske tumorer i bugspytkirtlen og ex vivo karakterisering af tumor Infiltrerende T-celle cytotoksicitet

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

Måling Real-time Drug Response i organotypic tumorvæv skiver

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...