Name: real time detection of in vitro tumor cell apoptosis induced by cd8+ t cells to study immune suppressive functions of tumor-infiltrating myeloid cells
Uploaded: 2019-01-29T12:30:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells at JoVE

Dit werk werd gesteund door subsidies van de Wellcome Trust (101067/Z/13/Z (JWP), 109657/Z/15/Z (TK), 615KIT/J22738 (TK), UK), en het MRC (heer/N022556/1 (JWP, TK), UK). NOC en DDS erkentelijk voor steun van de nationale fenotypische Screening centrum Phenomics ontdekking initiatief en Cancer Research UK (NOC)

<ol>
	<li>Barry, M., Bleackley, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+T+lymphocytes:+all+roads+lead+to+death.">Cytotoxic T lymphocytes: all roads lead to death.</a> Nature Reviews in Immunology. 2, 401-409 (2002).</li><li>Durgeau, A., Virk, Y., Corgnac, S., Mami-Chouaib, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+targeting+CD8+T-cell+immunity+for+more+effective+cancer+immunotherapy.+Frontiers+in+Immunology.">Recent advances in targeting CD8 T-cell immunity for more effective cancer immunotherapy. Frontiers in Immunology.</a> 9. , 14 (2018).</li><li>Tanaka, A., Sakaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cells+in+cancer+immunotherapy.">Regulatory T cells in cancer immunotherapy.</a> Cell Research. 27, 109-118 (2017).</li><li>Fleming, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+myeloid-derived+suppressor+cells+to+bypass+tumor-induced+immunosuppression.">Targeting myeloid-derived suppressor cells to bypass tumor-induced immunosuppression.</a> Frontiers in Immunology. 9, 398 (2018).</li><li>Cassetta, L., Kitamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+targeting:+opening+new+possibilities+for+cancer+immunotherapy.">Macrophage targeting: opening new possibilities for cancer immunotherapy.</a> Immunology. 155, 285-293 (2018).</li><li>Chahroudi, A., Silvestri, G., Feinberg, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+T+cell-mediated+cytotoxicity+using+fluorogenic+caspase+substrates.">Measuring T cell-mediated cytotoxicity using fluorogenic caspase substrates.</a> Methods. 31, 120-126 (2003).</li><li>Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+flow+cytometric+assays+for+monitoring+cell-mediated+cytotoxicity.">New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity.</a> Expert Review of Vaccines. 9, 601-616 (2010).</li><li>Azimi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification,+isolation,+and+functional+assay+of+regulatory+T+Cells.">Identification, isolation, and functional assay of regulatory T Cells.</a> Immunological Investigation. 45, 584-602 (2016).</li><li>Bruger, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+measure+the+immunosuppressive+activity+of+MDSC:+assays,+problems+and+potential+solutions.">How to measure the immunosuppressive activity of MDSC: assays, problems and potential solutions.</a> Cancer Immunology Immunotherapy. , (2018).</li><li>Qian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+macrophage+population+mediates+metastatic+breast+cancer+cell+extravasation,+establishment+and+growth.">A distinct macrophage population mediates metastatic breast cancer cell extravasation, establishment and growth.</a> PLoS One. 4, e6562 (2009).</li><li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytes+differentiate+to+immune+suppressive+precursors+of+metastasis-associated+macrophages+in+mouse+models+of+metastatic+breast+cancer.">Monocytes differentiate to immune suppressive precursors of metastasis-associated macrophages in mouse models of metastatic breast cancer.</a> Frontiers in Immunology. 8, 2004 (2018).</li><li>Bronte, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+myeloid-derived+suppressor+cell+nomenclature+and+characterization+standards.">Recommendations for myeloid-derived suppressor cell nomenclature and characterization standards.</a> Nature Communications. 7, 12150 (2016).</li><li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCL2-induced+chemokine+cascade+promotes+breast+cancer+metastasis+by+enhancing+retention+of+metastasis-associated+macrophages.">CCL2-induced chemokine cascade promotes breast cancer metastasis by enhancing retention of metastasis-associated macrophages.</a> Journal of Experimental Medicine. 212, 1043-1059 (2015).</li><li>Ewens, A., Mihich, E., Ehrke, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distant+metastasis+from+subcutaneously+grown+E0771+medullary+breast+adenocarcinoma.">Distant metastasis from subcutaneously grown E0771 medullary breast adenocarcinoma.</a> AnticancerResearch. 25, 3905-3915 (2005).</li><li>Choppa, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+PCR+for+the+detection+of+Mycoplasma+fermentans,+M.+hominisandM.+penetransin+cell+cultures+and+blood+samples+of+patients+with+chronic+fatigue+syndrome.">Multiplex PCR for the detection of Mycoplasma fermentans, M. hominisandM. penetransin cell cultures and blood samples of patients with chronic fatigue syndrome.</a> Molecular and Cellular Probes. 12, 301-308 (1998).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current protocols in immunology. , (2001).</li><li>Koyanagi, M., Kawakabe, S., Arimura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+colorimetric+cell+proliferation+assays+in+immune+cells.">A comparative study of colorimetric cell proliferation assays in immune cells.</a> Cytotechnology. 68, 1489-1498 (2016).</li><li>Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid-derived-suppressor+cells+as+regulators+of+the+immune+system.">Myeloid-derived-suppressor cells as regulators of the immune system.</a> Nature Reviews in Immunology. 9, 162-174 (2009).</li><li>Cassetta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+and+human+tumor-associated+macrophages.">Isolation of mouse and human tumor-associated macrophages.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 899. 899, 211-229 (2016).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Deze methode is gebaseerd op twee stappen van de afzonderlijke co cultuur: samen kweken CD8+ T cellen met potentiële suppressor cellen, en mede het kweken van de 'vooraf geconditioneerde' CD8+ T cellen met tumor doelcellen (Figuur 1). De eerste stap van de co cultuur is vrij gelijkaardig aan die voor CD8+ T cel proliferatie testen vaak gebruikt om te bepalen van het effect van de suppressor cellen op CD8+ T cel functie. T-celproliferatie is echter niet altijd met hun cytotoxiciteit correleren. Bijvoorbeeld, we hebben gevonden die mede cultuur met M-MDSCs of MAMs verhoogd in plaats van verminderde proliferatie van CD8+ T cellen in aanwezigheid van CD3/CD28 activeren van antilichamen (aanvullende figuur 3), overwegende dat deze vooraf geconditioneerd CD8+ T-cellen aangetoond verminderd cytotoxiciteit tegen kanker doelcellen (Figuur 4en Figuur 5, Figuur 6). Deze resultaten wijzen op het belang van de evaluatie van de functionele activiteit, blijkt uit doel kanker cel apoptosis, aangeboden door deze CD8+ T cel cytotoxiciteit assay.
In deze test, hebben we vastgesteld dat CD8+ T cellen ongeveer 15 h van co cultuur nodig induceren maximale apoptosis van E0771-LG muis borstklier tumorcellen (Figuur 5). Deze vertraging zou kunnen te wijten zijn aan de lag tussen eerste contact effector cellen met de doelstellingen en de begeleidende immuun synaps formatie, evenals de tijd die nodig is voor het opwekken van apoptotic signalen in doelstellingen zoals gemeten door activering van caspase-3 (aanvullende film 1 ). Wij ook vastgesteld dat het aantal apoptotic tumorcellen bereikt een plateau na 24 h, die waarschijnlijk te wijten aan de eliminatie van doelstellingen door T cellen en/of verlies van fluorescent signaal uit dode cellen is. Dit vermogen om te identificeren van de tijd van piek apoptosis is een groot voordeel van deze test sinds bepaling van een optimale tijdstip belangrijk voor de juiste vergelijkingen tussen verschillende omstandigheden is. In ons geval bijvoorbeeld het verschil in cytotoxiciteit tussen controle CD8+ T cellen en MDSC/MAM-opgeleid CD8+ T cellen was veel groter bij 15-18 h ten opzichte van 72 h (Figuur 5), en dus een eindpunt experimenteren met behulp van een incubatietijd van 72 h misleidende resultaten zou opleveren.
Met deze methode kan ook visualisatie van real-time effector-to-target cel interactie, die zou zorgen voor meer inzicht in het mechanisme dat ten grondslag liggen aan de beperkte cytotoxiciteit van CD8+ T cellen vooraf geïncubeerd met suppressor cellen. Bijvoorbeeld, we merkten op dat CD8+ T cellen vooraf geïncubeerd met M-MDSCs of MAMs ondervonden en interactie met de doelgroep tumorcellen maar nog altijd geen apoptosis (aanvullende film 4, aanvullende film 5, aanvullende film 6) deed veroorzaken. Hoewel we dit evenement niet kwantificeren hebben, zou het haalbaar en interessant zijn om te kwantificeren en het aandeel van ontmoetingen en hun interactie tijd in correlatie met apoptose inductie te vergelijken. Een ander groot voordeel is dat deze methode een klein aantal cellen (bijvoorbeeld 1 x 103 van doel) en 4 x 10,3 effector cellen per putje vereist. In feite, kan dit protocol worden verder verkleind voor de indeling van 384-well plaat indien gewenst. Daarom is deze test geschikt voor hoge throughput screening en experimenten waar cel nummers zijn beperkt, zoals in vitro testen met behulp van kostbare cellen afkomstig van in vivo of ex vivo monsters.
Aan de andere kant, is een beperking van de huidige bepaling de aanwezigheid van aanzienlijke aantallen dode effector cellen in sommige omstandigheden. Teneinde de nauwkeurigheid in apoptosis van doel kankercellen onderscheiden van die van effector CD8+ T cellen, de kernen van target cellen worden aangeduid en een beperking van de grootte (dat uitsluit effector cellen) wordt toegepast voor de analyse van de gegevens in deze kernen assay (Figuur 2). Er zijn echter enkele gevallen waar de overlay van aggregaten van (groen) apoptotic CD8+ T cellen op niet-apoptotic doel kankercellen, die de resultaten kunnen verwarren. Deze beperking kan worden verzacht door gebruik van een kolom van de verwijdering dode cel in effector cellen voorafgaand aan samen cultuur met doelcellen van tumor, uitgaande van voldoende aantallen effector cellen beschikbaar zijn. Met meer complexe systemen, microscopie, het ook mogelijk om de valse positieve signaal door het labelen van de effector CD8+ T cellen met een verschillend van de celkernen van het doel en het substraat fluorogenic caspase-3 fluorophore.
Tot nu toe, dit protocol is gebruikt voor het onderzoek naar de antigeen aspecifieke activatie van CD8+ T cellen. Hoewel MDSCs en TAMs in de tumor communicatie T cel functies door middel van antigeen aspecifieke mechanismen onderdrukken, onderdrukken MDSCs in de perifere lymfoïde weefsels T cel reacties in een antigeen specifieke wijze18. Om te onderzoeken immuun onderdrukkende functies van dergelijke celtypes, een proliferatie van in vitro-assay met behulp van CD8+ T cellen van OT-1 transgene muizen wordt vaak gebruikt. In deze test, de OT-1 T-cellen (ovoalbumine (OVA) specifieke T cel receptor uitdrukken) worden mede gekweekt met suppressor MDSCs in aanwezigheid van eicellen peptides, die geldt voor de eerste cultuur in onze cytotoxiciteit assay (dwz., activering van T cellen in de aanwezigheid of afwezigheid van suppressors). Het is ook mogelijk om te manipuleren van de kankercellen van de doelstelling om uit te drukken van eicellen, die ertoe van antigeen-specifieke kanker cel doden door OT-1 T-cellen bewegen kunnen. De bepaling kan dus ook onderzoek naar de MAM/MDSC-gemedieerde onderdrukking van antigeen-specifieke T cel activatie. Het is ook mogelijk om te passen de assay voor het onderzoek naar menselijke cellen, zoals activering antilichamen tegen menselijke CD3 en CD28 commercieel beschikbaar zijn, en een protocol bij het isoleren van de menselijke TAMs van klinische monsters gevestigde19.
Collectief, deze test is zeer veelzijdig en kan worden gebruikt voor het onderzoeken van de cytotoxiciteit van andere immuun celtypes. Op dit moment in onze laboratoria, het te onderzoeken antigeen-afhankelijke cel cytotoxiciteit onder verschillende omstandigheden wordt uitgebreid en is ook ontwikkeld voor hoge doorvoer screening.

Het is bekend dat CD8+ T cellen kunnen elimineren van tumorcellen wanneer zij hun volledige cytotoxiciteit uitoefenen. Na activering van de T cel receptor (TCR), CD8+ T cellen vermenigvuldigen en differentiëren in cytotoxische effector cellen. De uitgebreide en geactiveerde CD8+ T cellen afscheiden cytotoxische korrels, met inbegrip van Perforine en granzymes, die worden overgebracht naar de doelcellen en initiëren van diverse lytische trajecten zoals caspase-3 gemedieerde apoptosis1. CD8+ T cellen kunnen ook veroorzaken tumor cel apoptosis door activering van receptoren op doelcellen, zoals receptoren voor Tumornecrosefactor-α (TNF-α), eerste apoptosis signaal ligand (FasL) of TNF-gerelateerde apoptose-inducerende ligand (TRAIL). Bovendien, de geactiveerde CD8+ T cellen afscheiden interferon-γ (IFN-γ) die kan onderdrukken tumor celproliferatie en verhogen van de gevoeligheid van de tumorcellen aan CD8+ T cellen via de up-verordening voor FasL receptor1. Gezien het potentieel voor CD8+ T tumor doden vermogen, verschillende strategieën ter bevordering van hun cytotoxiciteit (bv, checkpoint remmers, kanker vaccinatie en adoptief overdracht van chimeer antigeen receptor (auto) T cellen uiten) zijn vastgesteld en getoond aanzienlijke therapeutische effecten op bepaalde soorten kanker2. Echter accumuleren bewijs suggereert dat de tumor-infiltreren immuun zoals regulatoire T-cellen cellen, suppressor myeloïde-afgeleide cellen (MDSCs), en tumor-geassocieerde macrofagen (TAMs) CD8 onderdrukken kunnen+ T cel functies en werkzaamheid beperken van immuuntherapie3,4,5. Ter verbetering van dergelijke immuuntherapie, het is belangrijk om te begrijpen hoe immuun suppressor cellen limiet CD8+ T cel cytotoxiciteit. De identificatie van CD8+ T cel zowel onderdrukking mechanismen als druggable doelstellingen te overwinnen, vergt de ontwikkeling en het gebruik van in-vitrotests.
De methode van de gouden standaard voor het meten van CD8+ T cel cytotoxiciteit is de chroom release assay waarin het vrijkomen van de radioactieve sonde (51Cr), uit target cellen die zijn lysed door CD8+ T cellen, is vastbesloten6. Deze bepaling heeft echter verscheidene nadelen met inbegrip van de relatief lage gevoeligheid, hoge achtergrond, onvermogen om te detecteren vroege apoptotic gebeurtenissen, gevaarlijke verwijdering problemen en beperkte compatibiliteit met geautomatiseerde liquid handling en detectie te ondersteunen hogere doorvoer toepassingen. Een andere gemeenschappelijke methode is stroom cytometrische analyses waarin apoptosis van doelcellen tumor wordt gedetecteerd door Annexine V7bindend. In deze test is het mogelijk om op te sporen van andere parameters zoals doel de dood van de cel met behulp van propidium jodide (PI) of 7-aminoactinomycin D (7-AAD) en effector cel activatie aangegeven door expressie van het CD107a of CD69, naast de apoptosis in de doelcellen7 . Deze test vereist echter grote aantallen suppressor cellen ten opzichte van de chroom release assay. Het vereist ook de detachement en het aggregatieniveau van aanhangend doelcellen en dit kan vertekening van de resultaten. Inderdaad, het Chroom release assay of flow cytometrische bepaling zijn niet algemeen wordt gebruikt om te onderzoeken suppressor cel effecten op T cel functies. In plaats daarvan, de meting van T-cel proliferatie aangegeven door verdunning van een fluorescente kleurstof (bv CFSE) vooraf geladen in T cellen wordt vaak gebruikt voor het evalueren van de remming van CD8+ functie van de T cel door suppressor cellen. Detectie van IFN-γ productie van gekweekte T cellen is een andere standaard methode om te evalueren van de effecten van de suppressor cellen op T-cel activatie8,9. Nochtans, de resultaten van deze tests doen niet noodzakelijkerwijs correleren aan de doelcel doden vermogen van CD8+ T cellen.
Wij presenteren hier een alternatieve functionele test om effecten van suppressor cellen, met name de macrofagen in de gemetastaseerde tumoren, op de cytotoxiciteit van CD8+ T cellen. Deze methode bepaalt de cytotoxiciteit van CD8+ T cellen, vooraf gekweekt met of zonder de suppressor cellen in aanwezigheid van anti-CD3/CD28 activerend antilichamen, door het detecteren van tumor cel apoptosis, aangegeven door fluorescentie van een fluorogenic caspase-3 substraat met behulp van6 geautomatiseerd time-lapse microscopie (Figuur 1). Dit protocol heeft verschillende voordelen ten opzichte van andere methoden; het vereist slechts een klein aantal cellen, mogelijk maakt detectie van de dood van de cel van de aanhangend tumor met hoge gevoeligheid, real-time effector-tot-streefpad interactie kan beeld en is vatbaar voor hoge throughput screening.
In dit protocol worden metastase-geassocieerde macrofagen (MAMs) en hun voorvader monocytic-MDSCs (M-MDSCs) geïsoleerd van uitgezaaide tumoren in muizen gebruikt als suppressor cellen. In muismodellen van uitgezaaide borstkanker, een aparte populatie van macrofagen gekenmerkt als F4/80hoogLy6G-CD11bhogeLy6Clage hoopt zich op in de longen met uitgezaaide tumoren. Deze macrofaag-bevolking is zelden gevonden in de normale Long en dus geroepen metastase-geassocieerde macrofagen (MAMs)10. In deze muismodellen, andere myeloïde cel bevolking, gedefinieerd als F4/80hoogLy6G-CD11bhogeLy6Choge, ook accumuleert overwegend in de gemetastaseerde Long waar het leidt tot MAMs11. Op basis van hun kenmerken, kunnen de CD11bhogeLy6Choge MAM voorlopercellen M-MDSCs12vertegenwoordigen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin EDTA (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Freiner Bio-One</td>
			<td>665-180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL Plystyrene Round-Bottom Tube</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Cell Culture Plate (Round Bottom )</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3799</td>
			<td>Co-culture of CD8+T cells with sorted myeloid cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate (Flat bottom)</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>165305</td>
			<td>Co-culture of CD8+T cells with target cells for cytotoxicity assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF647 anti-mouse F4/80 Antibody</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>MCA497A647</td>
			<td>Clone: CIA3-1, Lot#: 1707, 2 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor700 anti-mouse CD8 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100730</td>
			<td>Clone: 53-6.7, Lot#: B205738, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD28 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102111</td>
			<td>Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 37.51, Lot#: B256340</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD3e Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100314</td>
			<td>Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 145-2C11, Lot#: B233720</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD3 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100236</td>
			<td>Clone: 17A2, Lot#: B198730, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cy7 anti-mouse Ly6C Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>128026</td>
			<td>Clone: HK1.4, Lot#: B248351, 1 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albmin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1470-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer (100&#956;m Nylon)</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352360</td>
			<td>To smash the spleen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer (40&#956;m Nylon)</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352340</td>
			<td>To filter the lung digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>422801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8242;s Modified Eagle&#8242;s Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>19853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse CD4 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100406</td>
			<td>Clone: GK1.5, Lot#: B179194, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex Ready-to-Use</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1596-01</td>
			<td>Coating the 96-well plates for cytotoxicity assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte NucLight Red Lentivirus Reagent</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>4476</td>
			<td>Lenti viral particules encoding mKate2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte ZOOM</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td></td>
			<td>Detector (fluorescence microscope)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte ZOOM 2018A</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td></td>
			<td>Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2916801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lung Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-095-927</td>
			<td>Preparation of single cell suspension from the tumor-bearing lung</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MycoAlert Mycoplasma Detection Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>LT07-318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acid (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucView488</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>10403</td>
			<td>Fluoregenic caspase-3 substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse Ly6G Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>127607</td>
			<td>Clone: 1A8, Lot#: B258704, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 anti-mouse CD11b Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101216</td>
			<td>Clone: M1/70, Lot#: B249268, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Penicillin Streptomycin for primary culture of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103132</td>
			<td>Clone: 30-F11, Lot#: B249564, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene (Hexadimethrine bromide)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis Buffer (10X)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine IL-2</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>212-12</td>
			<td>Activation of isolated CD8+ T cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruStain fcX (anti-mouse CD16/32) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>&#160;: Nikon 10X objective (resolution 1.22 &#181;m) 
			&#160;: Green channel excitation: 440 - 480 nm 
			&#160;: Green channel emission: 504 - 544 nm 
			&#160;: Red channel excitation: 565-605 nm 
			&#160;: Red channel emission: 625 - 705 nm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real time detection of in vitro tumor cell apoptosis induced by cd8+ t cells to study immune suppressive functions of tumor-infiltrating myeloid cells

Potentiëring van het vermogen van de tumor-doden van CD8+ T cellen in tumoren, samen met hun efficiënte tumor infiltratie, is een essentieel element van succesvol immuuntherapie. Verschillende studies hebben aangegeven dat de tumor infiltreren myeloïde cellen (bijvoorbeeld suppressor myeloïde-afgeleide cellen (MDSCs) en tumor-geassocieerde macrofagen (TAMs)) de cytotoxiciteit van CD8 onderdrukken+ T cellen in de tumor-communicatie, en dat gericht op deze regelgeving myeloïde cellen kunnen immuuntherapie verbeteren. Hier presenteren we een systeem van in-vitro-assay om immuun onderdrukkende effecten van monocytic-MDSCs en TAMs op het vermogen van de tumor-doden van CD8+ T cellen. Te dien einde, we eerst gekweekt naïef milt CD8+ T cellen met anti-CD3/CD28 activerend antilichamen in de aanwezigheid of afwezigheid van suppressor cellen en vervolgens gekweekt mede de pre-geactiveerde T-cellen met kanker doelcellen in aanwezigheid van een fluorogenic caspase-3 substraat. Fluorescentie van het substraat in kankercellen werd ontdekt door real-time fluorescentie microscopie als een indicator van T-cel-geïnduceerde tumor cel apoptosis. In deze test, wij met succes kan detecteren van de stijging van de tumor cel apoptosis door CD8+ T cellen en de onderdrukking door pre cultuur met TAMs of MDSCs. Deze functionele test is nuttig voor het onderzoeken van CD8+ T cel mechanismen van onderdrukking door de regulatoire myeloïde cellen en identificeren druggable doelstellingen te overwinnen via hoge throughput screening.

Deze methode is gebaseerd op eenvoudige co cultuur van doel kankercellen met effector CD8+ T cellen die vooraf hebben zijn gekweekt met of zonder suppressor cellen in aanwezigheid van anti-CD3/CD28 activerend antilichamen. Het detecteert CD8+ T-cel-geïnduceerde kanker cel apoptosis na verloop van tijd na co cultuur, waardoor de evaluatie van de effecten van de suppressor cellen op de cytotoxiciteit van CD8+ T cellen.
Normaal gesproken kankercellen verhogen groene fluorescentie in hun kernen na activering van een nucleaire-targeting caspase biosensor wanneer deze cellen maken contact met CD8+ T cellen die vooraf worden geactiveerd door antilichamen bij gebrek aan suppressor cellen () Figuur 3; Aanvullende film 1). Groene fluorescentie van het caspase-substraat was aantoonbaar voor ten minste 15 h na apoptosis werd ingeleid. Sommige spontane apoptosis van effector CD8+ T cellen ook na verloop van tijd werd waargenomen, zelfs als deze cellen werden gekweekt in isolatie (Figuur 4; Aanvullende film 2). Echter kernen maten van CD8+ T cellen zijn kleiner dan die van kankercellen en dus apoptotic 'effector' cellen kunnen worden uitgesloten van apoptotic 'target' cel telt door een grootte beeld analyse beperkingsmethode (Figuur 2 en Figuur 4). Hoewel sommige kankercellen doel een kleine afgeronde vorm zonder groene fluorescentie tonen, dit heeft geen invloed op de analyse zoals deze cellen mitose in plaats van apoptosis (aanvullende film 3) ondergaan, en dus worden uitgesloten van apoptotic 'target' graven van de cel door een rood/groene overlapping masker (aanvullende figuur 2). Spontane apoptosis van doelcellen kanker komt af en toe ook in de interne cultuur (aanvullende film 3). Echter, de co cultuur van doel kanker cellen met pre-geactiveerde CD8+ T cellen verhoogde tumor cel apoptosis boven de niveaus van spontane apoptosis in monocultuur van kankercellen (Figuur 4). In het algemeen, als u met een optimale verhouding van doel kankercellen effector cellen, een piek in het aantal apoptotic doel kankercellen kan worden waargenomen (figuur 5A). Deze piek is duidelijker bij de gegevens is uitgedrukt in de apoptotic breuk van de doelpopulatie cel (figuur 5B). In dit experiment bedroeg de basale apoptosis van doelcellen van de tumor in 24 h (= 0,08 met apoptotic Fractie), maar CD8+ T-cel-veroorzaakte apoptosis bereikt een maximumgehalte om 17u (met apoptotic fractie = 0,66).
Verder vonden we dat CD8+ T cellen vooraf geïncubeerd met MAMs of M-MDSCs kon maken contact met target kankercellen maar deze contactpersoon leek te resulteren in minder gevallen van kanker cel apoptosis in vergelijking met CD8+ T cellen vooraf geactiveerd zonder suppressor cellen (Figuur 3 en Figuur 4; Aanvullende Movie 4 en aanvullende Movie 5). Hoewel de CD8+ T cellen vooraf geïncubeerd met de myeloïde cellen af en toe veroorzaakt kanker cel apoptosis, was er ook sommige verspreiding van de kankercellen van het doel, die niet hebben zijn gestimuleerd om te ondergaan van apoptosis in de tijdsverloop van de experiment (aanvullende film 6). In overeenstemming met deze bevindingen, de Fractie van de piek van apoptotic kankercellen gekweekt met CD8+ T cellen vooraf geïncubeerd met myeloïde cellen (apoptotic breuk = 0.38 om 23u voor MDSC-E en 0,25 om 20u voor MAM-E) was aanzienlijk lager dan die van kankercellen gekweekte met CD8+ T cellen die waren niet vooraf bebroede met de suppressor cellen (Figuur 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig1.jpg"> Figuur 1: een schema met de experimentele procedure. Naïef milt CD8+ T cellen worden gekweekt met anti-CD3/CD28 activerend antilichamen met of zonder metastase-geassocieerde macrofagen (MAMs) of suppressor monocytic-myeloïde-afgeleide cellen (M-MDSCs). Na 4 dagen, drijvende CD8+ T cellen worden verzameld en samen met kanker doelcellen in aanwezigheid van fluorogenic caspase-3 substraat gekweekt. Apoptotic kankercellen worden gedetecteerd onder real-time fluorescentie microscopie. Beelden getoond werden verkregen met behulp van een levende cel-imaging platform (Zie Tabel van materialen). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig2.jpg"> Figuur 2: identificatie van apoptotic doelcellen onderscheiden van apoptotic effector cellen. Bovenste rij: Beeldacquisitie in het rode kanaal maakt de identificatie van doel celkernen doordat detectie Doelmasker (roze analyse masker). Middelste rij: afbeeldingen die zijn verworven in het groene kanaal geven aan apoptotic effector en target cellen. Asize beperkt apoptosis masker (teal analyse maskeren; meer dan 80 µm2) kunnen enkel apoptotic effector cellen worden uitgesloten van de analyse. Onderste rij: samengestelde afbeeldingen samengevoegde rode en groene kanalen met fase contrast afbeelding (links) of rood/groen overlappen masker (rechts). Identificatie van mede gelokaliseerde, grootte-beperkte groene fluorescentie met rode fluorescentie (gele analyse masker), kunnen meer nauwkeurige detectie van apoptotic doel kernen (gele pijlpunt) met uitzondering van aggregaten van apoptotic effector cellen (wit pijlpunten). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig3.jpg"> Figuur 3: Interactie tussen CD8+ T cellen en kankercellen. Stills uit representatieve time-lapse films van E0771-LG_NLR doelcellen (T) mede gekweekt met effector CD8+ T cellen (E) bij effector/doel 4:1 verhouding. MDSC-E en MAM-E geven effector cellen vooraf geïncubeerd met M-MDSCs en MAMs respectievelijk. Samengestelde afbeeldingen (inclusief afbeeldingen uit fase contrast, rode en groene kanalen) worden weergegeven. Pijlpunten zijn het bijhouden van de dezelfde cellen via de verschillende velden en tijd punten. Gele pijlpunten: een doel dat koppelt met effectoren en ondergaat apoptosis, witte pijlpunten: een doel dat is gekoppeld aan de effectoren maar geen apoptosis ondergaan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig4.jpg"> Figuur 4: detectie van apoptotic kankercellen. Representatieve velden time-lapse films op 18 h na imaging is onttrokken. Samengestelde afbeeldingen (links; fase contrast, rode en groene kanalen) en beelden van de rode kanaal zonder (midden) of met (rechts) rood/groen overlapping masker (geel) worden weergegeven. Gele stippen in de rechterkolom vertegenwoordigen apoptotic kankercellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig5.jpg"> Figuur 5: CD8+ T-cel-geïnduceerde kanker cel apoptosis. (A) aantal apoptotic kankercellen gekweekte met effector C8+ T cellen op verschillende effector doel/ratio (E:T). de Apoptotic (B) breuk van cel doelpopulatie. Gegevens zijn middelen ± SD. Mean gebied onder de curve (AUC) wordt ook weergegeven. Ongepaarde t-test met Welch's correctie werd gebruikt voor het analyseren van de AUC. * P < 0,0001 in vergelijking met E:T = 0:1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig6.jpg"> Figuur 6: Effecten van tumor-infiltreren myeloïde cellen op de cytotoxiciteit van CD8+ T cellen. (A) aantal-apoptotic kankercellen (doel: T) gekweekt met C8+ T cellen (effector: E) bij 4:1 verhouding van de E:T. CD8+ T cellen waren vooraf gekweekt bij afwezigheid (zwarte cirkel) of aanwezigheid van suppressor monocytic-myeloïde-afgeleide cellen (MDSC-E: blauwe cirkel) of metastase-geassocieerde macrofagen (MAM-E: rode cirkel). Gegevens zijn middelen ± Apoptotic SD. (B) breuk van cel doelpopulatie. Gegevens zijn middelen ± SD. bedoel AUC ook blijkt. Ongepaarde t-test met Welch's correctie werd gebruikt voor het analyseren van de AUC. * P < 0,0001 t.o.v. T alleen, #P < 0,0001 in vergelijking met E + T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
Aanvullende figuur 1. Gating strategie te isoleren van de suppressor cellen uit de uitgezaaide longkanker. (A) representatieve dot percelen te isoleren monocytic myeloïde afkomstige suppressor cellen (M-MDSCs) en metastase-geassocieerde macrofagen (MAMs). De drempel van Ly6C niveau te onderscheiden van MAMs (Ly6Clage) en M-MDSCs (Ly6Choge) is gebaseerd op die van de ingezetene alveolaire macrofagen (RMAC). (B) zuiverheid van de gesorteerde M-MDSCs (CD45+Ly6G-CD11b+Ly6Choge) en MAMs (CD45+Ly6G-CD11b+Ly6Claag). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/FigureS1_Rvd.pdf">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende figuur 2. Beelden van de vertegenwoordiger van de mitotische doelcellen. Stills uit representatieve time-lapse films van mono-cultuur van de cel van target E0771-LG_NLR. Top: samengestelde afbeeldingen met inbegrip van beelden uit fase contrast, rode en groene kanalen. Bodem: samengestelde afbeeldingen (rode en groene kanalen) met rood/groene overlappen masker. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/FigureS2_Rvd.pdf">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende figuur 3. Effecten van tumor-infiltreren myeloïde cellen op de proliferatie van CD8+ T cellen. (A) representatieve histogrammen tonen verdunning van fluorescerende labelen met CFSE in CD8+ T cellen. Naïef milt CD8+ T cellen werden geïsoleerd zoals beschreven in het Protocol-3 en gemarkeerd met 5 µM van CFSE bij 37 ° C gedurende 15 minuten. De gelabelde T-cellen werden gekweekt in aanwezigheid van de IL-2 en anti-CD3/CD28 antilichamen met of zonder myeloïde cellen activeren, zoals wordt beschreven in het Protocol 4. Na 4 dagen, werd groene fluorescentie in T-cellen ontdekt door stroom cytometer. (B) divisie index van CD8+ T cellen berekend als eerder beschreven17. Gegevens zijn middelen ± SEM. * P < 0,01 in vergelijking tot controle, #P < 0.05 αCD3/CD28 Ab. t.o.v. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/FigureS3_Rvd.pdf">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende film 1. Film van de cijfers 3 en 4; E + T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS1.mp4">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende film 2. Film van de cijfers 3 en 4; Effector (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS2.mp4">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende film 3. Film van de cijfers 3 en 4; Doel (T). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS3.mp4">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende film 4. Film van de cijfers 3 en 4; MDSC-E + T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS4.mp4">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende film 5. Film van de cijfers 3 en 4; MAM-E + T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS5.mp4">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende film 6. Film van de cijfers 3 en 4; MAM-E + T (proliferatie). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS6.mp4">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells at JoVE

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

We beschrijven hier een protocol om te onderzoeken van de cytotoxiciteit van pre-geactiveerde CD8+ T cellen tegen kankercellen door het detecteren van apoptotic kanker cellen via real-time microscopie. Dit protocol kan mechanismen achter myeloïde cel-geïnduceerde T cel onderdrukking onderzoeken en evalueren van de verbindingen die zijn gericht op het aanvullen van T cellen via blokkade van onderdrukkende myeloïde immuuncellen.

Real-time detectie van In Vitro Tumor cel Apoptosis geïnduceerd door CD8+ T cellen te bestuderen immuun onderdrukkende functies van Tumor-infiltreren myeloïde cellen

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Ons protocol beoordeelt de effecten van myeloïde-afgeleide suppressor cellen en de tumor-geassocieerde macrofagen in T-cel-geïnduceerde tumorcel apoptose. Naast onderzoek naar de onderliggende mechanismen van potentiële therapeutische interventies. Dit protocol evalueert direct T-cel-geïnduceerde tumorcelapoptose met hoge gevoeligheid en maakt longitudinale analyse en beeldvorming van cel-naar-cel interacties mogelijk.De werkzaamheid van checkpointremmer kan het best worden bekeken door tumor-infiltreren myeloïde cellen in bepaalde tumortypes. Deze techniek zou kunnen leiden tot de identificatie van nieuwe therapieën voor deze tumoren. Deze methode kan niet alleen kanker immunologie onderzoek bevorderen, maar kan mogelijk ook inzicht geven in de immunodeficiëntie en auto-immuunziekten.Voor de activering en uitbreiding van milt-geïsoleerde CD8-positieve T-cellen, eerste aliquot een keer 10 tot de vijfde CD8-positieve T-cellen in 50 microliters van E-DMEM in individuele putten van een 96-well U-bodem plaat. Voeg vervolgens een keer 10 toe aan de vijfde suppressorcellen in 50 microliter van E-DMEM, of 50 microliter van E-DMEM alleen, in elke put van T-cellen. Voeg vervolgens 50 microliter vers bereid activeringsmedium en 50 microliter van E-DMEM, met of zonder de testreagentia van belang, toe aan de juiste putten.En plaats de plaat in een 37-graden-Celsius en 5%kooldioxide incubator met 95% vochtigheid voor vier dagen. Om een vooraf geactiveerde CD8-positieve T-cel doelcel co-cultuur op te zetten, voeg eerst 30 microliters van 1-tot-100-verdunde groeifactor-verminderde oplosbare keldermembraanmatrix aan de aangewezen putten van een 96-goed vlakke bodemplaat toe, geschikt voor microscopie. Schud de plaat om de matrix gelijkmatig te verspreiden, en plaats de plaat in de celcultuur incubator voor ten minste een uur.Terwijl de plaat is evenwicht, bereiden de doelcellen. Aspirate het medium, wassen met PBS, en voeg een milliliter van 05% Trypsin-EDTA bij kamertemperatuur gedurende een minuut. Voeg negen milliliter DMEM aangevuld met foetaal runderserum toe door zachte pipetting en breng de gescheiden cellen over in buizen.Na het centrifugeren van de cellen, resuspend de pallet in 500 microliters van E-DMEM. Filter de geresuspendeerde cellen door een celzeef en tel de levende cellen. Pas vervolgens de dichtheid aan op vier keer 10 naar de vierde doelcellen per milliliter in verse E-DMEM op ijs.Vervolgens pipette de vooraf geactiveerde CD8-positieve T-cellen een paar keer om de cellen opnieuw op te zetten in een enkele cel suspensie, en de overdracht van de drijvende T-cellen in een 1,5-milliliter buis per aandoening. Verzamel de resterende cellen met 200 microliter PBS per put, breng de wasbeurten over in de juiste buizen van 1,5 milliliter en centrifuge. Aspirate het medium en voeg een milliliter E-DMEM aan elke buis voor centrifugatie.Na centrifugatie, resuspend de pellets in 100 microliter van verse E-DMEM per buis. Pas na het tellen de cellen in elke buis aan op een dichtheid van 1,6 keer 10 tot de vijfde voorgeactiveerde CD8-positieve T-cellen per milliliter medium en plaats de cellen op ijs. Wanneer de cellen klaar zijn, aspirate de kelder membraan matrix van elke put van de 96-well microscopie plaat, en voeg 50 microliter van doelcellen aan individuele putten binnen de binnenste 60 putten van de plaat met mengen.Voeg 25 microliter E-DMEM toe, aangevuld met vier keer 10 aan de derde eenheden per milliliter IL2, en 10-micromolar fluorogenic caspase-3 substraat aan de juiste putten. Voeg vervolgens 25 microliter vooraf geactiveerde CD8-positieve T-cellen toe aan de juiste putten. En voeg ten slotte E-DMEM toe aan de juiste putten om een totaal volume van maximaal 100 microliter te maken.Voeg 200 microliter PBS of steriel water toe aan alle lege putten. Schud de plaat en laat de plaat 10 minuten op een vlak oppervlak liggen. Als u de cellen wilt beelden, stelt u de microscoop in om beelden in fasecontrast te verkrijgen.Evenals fluorescentiekanalen die geschikt zijn voor het nucleair beperkte fluorescerende eiwit, en de fluorogene geactiveerde caspase-3 substraatfluoroforen die in het experiment worden gebruikt. Leg vervolgens beelden vast van elke experimentele put in fasecontrast en de twee fluorescentiekanalen om de één tot drie uur gedurende ten minste 72 uur. Om de vastgelegde beelden te analyseren, opent u een beeld van een controleput die alleen doelcellen en medium bevat zonder caspase-3-substraat in het fluorescentiekanaal dat wordt gebruikt voor substraatsignaal.Let op of een ongepast fluorescentiesignaal wordt uitgezonden door de kernen. Als het substraatsignaal zichtbaar is in de kernen, gebruikt u spectrale niet-mengen om het percentage substraatsignaal dat uit het kernsignaal wordt verwijderd te verhogen, totdat het substraatsignaal verdwijnt. Bekijk vervolgens een controleput met alleen kernen zonder gelabelde effectorcellen in medium zonder caspase-3-substraat in de twee fluorescentiekanalen afzonderlijk.Let op of een signaal wordt uitgezonden door de kernen. Als er geen signaal zichtbaar is in de afzonderlijke kanalen, is geen spectrale unmixing nodig. Als u de fluorescerende objecten in beide fluorescentiekanalen wilt oplossen, gebruikt u een stroomaftrekkingsmethode voor fluorescentieachtergrond met relevante parameters voor het monster en de juiste parameters voor randsplitsing.Gebruik afbeeldingen van doelcelmonocultuur om parameters vast te stellen voor doelcelnaire fluorescentie. Gebruik afbeeldingen van effectorcelmonocultuur om parameters vast te stellen voor substraat-geïnduceerde apoptotische nucleaire fluorescentie. Gebruik afbeeldingen van co-cultuur om parameters voor substraat-geïnduceerde apoptotische nucleaire fluorescentie in doelcellen te verifiëren of te verfijnen.Gebruik afbeeldingen in de kernen van de putten die alleen doelcellen met caspase-substraat bevatten om de minimumgrootte van de doelkernen te bepalen. Gebruik afbeeldingen in het substraatsignaalkanaal van de putten die alleen effectorcellen met caspase-substraat bevatten om de gemiddelde grootte van apoptotische effectorkery's te bepalen. Als u het aantal fluorescentiedoelkernen wilt tellen, stelt u een analyseprocedure in met behulp van een passende beperking van de minimumgrootte.Stel met behulp van effectorcelmonocultuurbeelden een tweede analyseprocedure in om het aantal apoptotische kernen te tellen dat groter is dan de gemiddelde grootte van de apoptotische effectorkerkerunen. Stel vervolgens een derde analyseprocedure in om het aantal apoptotische doelcellen te tellen door het aantal kernen te tellen waarin het nucleussignaal en het met grootte beperkte substraatsignaal aanzienlijk co-localiseren. Meestal verhogen kankercellen het fluorescentiesignaal in hun kernen na de activering van een nucleaire caspase biosensor wanneer de cellen in contact komen met CD8-positieve T-cellen die vooraf worden geactiveerd door antilichamen bij afwezigheid van suppressorcellen.De kerngroottes van CD8-positieve T-cellen zijn kleiner dan die van kankercellen. Zo kunnen apoptotische effectorcellen worden uitgesloten van apoptotische doelceltellingen door een beeldanalysemethode voor groottebeperking. Hoewel sommige doelkankercellen een kleine afgeronde vorm vertonen zonder substraatfluorescentie, heeft dit geen invloed op de analyse.Aangezien deze cellen mitose ondergaan in plaats van apoptose en dus worden uitgesloten van apoptotische doelceltellingen door een nucleair substraatsignaal overlappend masker. De co-cultuur van doelkankercellen met vooraf geactiveerde CD8-positieve T-cellen verhoogt tumorcel apoptose boven de niveaus van spontane apoptose in kankercelmonoculturen. Over het algemeen kan bij het gebruik van een optimale verhouding van doelkankercellen tot effectorcellen een piek in het aantal apoptotische doelkankercellen worden waargenomen.Deze piek wordt duidelijker wanneer de gegevens worden uitgedrukt als de apoptotische fractie van de doelcelpopulatie. Het belangrijkste om te onthouden bij een poging dit protocol is het opzetten van monoculturen van doelcellen en monoculturen van effector cellen voor gebruik in de ontwikkeling van de analyse maskers. Deze methode kan inzicht geven in de duur en frequentie van T-cel naar kankercelinteracties, en de voorwaarden die gepaard gaan met genafhankelijke cytotoxiciteit in zowel menselijke als muiscellen.We ontwikkelen deze test momenteel tot een scherm met hoge doorvoer met menselijke cellen om verbindingen te identificeren die myeloïde celgemedieerde immunosuppressie remmen en daarmee de werking van de controlepuntremmers verbeteren.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Beeldvorming van Resident CD8 T lymfocyten in menselijke longen Tumor plakjes met behulp van confocale microscopie

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

Detectie van Mitochondria membraanpotentiaal CLIC4 Knockdown-geïnduceerde HN4 cel Apoptosis om te studeren In Vitro

Depletion of the mitochondrial membrane potential (MMP, &#916;&#936;m) is considered the earliest event in the apoptotic cascade. It even occurs ahead of ...

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Protocol van de isolatie van muis monocyt-afgeleide dendritische cellen en hun latere In Vitro activatie met Tumor immuuncomplexen

Dendritic cells (DC) are heterogeneous cell populations that differ in their cell membrane markers, migration patterns and distribution, and in their ...

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

Stroom cytometrische detectie van nieuwgevormde stamcel-achtige borstkankercellen na Apoptosis omkering

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

Intramucosal Inoculation of Squamous Cell Carcinoma Cells in Mice for Tumor Immune Profiling and Treatment Response Assessment

Intramucosal enten van plaveiselcelcarcinoom cellen in muizen voor Tumor immuun profileren en evaluatie van de reactie van de behandeling

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is a debilitating and deadly disease with a high prevalence of recurrence and treatment failure. To develop ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

In Vitro Tumor cel Rechallenge voor voorspellende evaluatie van chimeer antigeen Receptor T cel antitumorale functie

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

In vitro assay om tumor-macrofaag interactie te bestuderen

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Met behulp van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen voor het genereren van tumor-antigeen-specifieke T-cellen

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generatie van Orthotopic alvleesklier tumoren en ex vivo karakterisering van tumor-Infiltrerende T cel cytotoxiciteit

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

Het meten van real-time drug respons in organotypic Tumor Tissue Slices

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...