Name: real time detection of in vitro tumor cell apoptosis induced by cd8+ t cells to study immune suppressive functions of tumor-infiltrating myeloid cells
Uploaded: 2019-01-29T12:30:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells at JoVE

Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation Wellcome Trust (101067/Z/13/Z (GTM), 109657/Z/15/Z (TK), 615KIT/J22738 (TK), UK) et le MRC (MR/N022556/1 (GTM, TK), UK). CNP et DDS souligner le soutien de l’Initiative nationale de phénotypique Screening Centre Phenomics découverte et Cancer Research UK (CNP)

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Cette méthode repose sur deux étapes distinctes de co-culture : co-culture CD8+ T de cellules avec des cellules suppressives potentiels, et co-culture le CD8 « pré-conditionnés »+ T cells avec cellules tumorales de cible (Figure 1). La première étape de co-culture est tout à fait similaire à celle des CD8+ T cell tests de prolifération habituellement utilisées pour déterminer l’effet des cellules suppressives sur CD8+ la fonction des cellules T. Toutefois, la prolifération des cellules T n’est pas toujours corrélée avec leur cytotoxicité. Par exemple, nous avons trouvé cette culture mixte avec M-MDSCs ou SMMA a augmenté plutôt que réduit la prolifération des CD8+ T cellules en présence de CD3/CD28, activation des anticorps (supplémentaire Figure 3), tandis que ceux-ci pré-conditionnés CD8+ T cells a démontré réduit cytotoxicité contre les cellules cancéreuses de cible (Figure 4, Figure 5, Figure 6). Ces résultats soulignent l’importance de l’évaluation de l’activité fonctionnelle, témoigne de l’apoptose cellulaire du cancer cible, offert par cette CD8+ test de cytotoxicité des lymphocytes T.
Dans ce test, nous avons identifié que CD8+ T des cellules nécessite environ 15 h de culture mixte afin d’induire l’apoptose maximale des cellules de tumeurs mammaires de souris E0771-LG (Figure 5). Ce retard pourrait s’expliquer par le décalage entre le premier contact des cellules effectrices avec cibles et accompagnent la formation des synapses immunitaire, ainsi que temps nécessaire pour induire des signaux apoptotic dans des cibles tel que mesuré par l’activation de la caspase-3 (supplémentaire Movie 1 ). Nous avons également identifié que le nombre de cellules tumorales apoptotiques atteint un plateau après 24 h, ce qui est probablement dû à l’élimination des cibles par les cellules T et/ou une perte de signal fluorescent des cellules mortes. Cette capacité à identifier l’heure de pointe l’apoptose est un avantage majeur de ce test car la détermination d’un point temporel optimal est importante pour des comparaisons appropriées entre les différentes conditions. Dans notre cas, par exemple, la différence de cytotoxicité entre contrôle CD8+ T cellules et CD8 MDSC/MAM-instruits+ T cellules était beaucoup plus grande à 15-18 h par rapport à 72 h (Figure 5), et donc un point de terminaison expérimenter en utilisant une période d’incubation de 72 h produirait des résultats trompeurs.
Cette méthode permet aussi la visualisation de l’interaction en temps réel de cellules effectrices à l’objectif, qui fournirait les mieux informés sur le mécanisme sous-jacent de cytotoxicité limitée de CD8+ T cellules préalablement incubées avec cellules suppressives. Par exemple, nous avons constaté que CD8+ T cellules préalablement incubées avec M-MDSCs ou SMMA rencontrées et interagissent avec les cellules de tumeur de cibles mais n’a pas toujours induit l’apoptose (supplémentaire film 4 et 5 de film supplémentaire, supplémentaires film 6). Bien que nous n’ont pas quantifié cet événement, il serait faisable et intéressant de quantifier et de comparer la proportion de rencontres et de leur temps d’interaction en corrélation avec l’induction de l’apoptose. Un autre avantage majeur est que cette méthode nécessite un petit nombre de cellules (par exemple, 1 x 103 de la cible) et 4 x 103 des cellules effectrices par puits. En fait, ce protocole peut être davantage miniaturisé pour le format de plaque 384 puits si vous le souhaitez. Par conséquent, ce dosage est approprié pour les expériences et le criblage à haut débit où le nombre de cellules est limité telles que in vitro tests utilisant des cellules précieux dérivé d’in vivo ou ex vivo des échantillons.
En revanche, une limitation du test actuel est la présence d’un nombre important de cellules effectrices morts dans certaines conditions. Afin d’augmenter la précision en distinguant l’apoptose des cellules cancéreuses cible de celle des effecteurs CD8+ T cells, les noyaux de cellules sont étiquetés de cible et une restriction de taille (ce qui exclut les cellules effectrices) est appliquée pour l’analyse des données dans le présent des noyaux dosage (Figure 2). Cependant, il y a certains cas où les cellules de recouvrement au moyen d’agrégats d’apoptose (vert) CD8+ T sur non-apoptotique cibler les cellules cancéreuses, qui peuvent entraîner des résultats. Cette limitation pourrait être atténuée par l’utilisation d’une colonne de suppression des cellules mortes sur avant les cellules effectrices co-culture avec des cellules tumorales cible, en supposant qu’un nombre suffisant de cellules effectrices est disponible. Avec des systèmes plus complexes de microscopie, il est également possible de réduire le signal positif faux en les marquant l’effecteur CD8+ T les cellules avec un fluorophore distingue les noyaux de cellules de cible et de la caspase-3 un substrat fluorogène.
Jusqu’ici, ce protocole a été utilisé pour étudier l’activation de non spécifiques de l’antigène de CD8+ T des cellules. Bien que MDSCs et TAMs dans le microenvironnement tumoral suppriment les fonctions des lymphocytes T par l’intermédiaire de mécanismes non spécifiques de l’antigène, MDSCs dans les tissus lymphoïdes périphériques suppriment les lymphocytes T à un antigène spécifique de manière18. Pour étudier les fonctions suppresseurs immunitaires de ces types de cellules, un test de prolifération in vitro à l’aide de CD8+ T cells d’OT-1 souris transgéniques est couramment utilisé. Dans ce test, les cellules d’OT-1 T (exprimant le récepteur de cellules T spécifiques de l’ovalbumine (OVA)) sont conjointement cultivées avec suppresseur MDSCs en présence de peptides d’ovules, qui s’applique pour la première culture dans notre test de cytotoxicité (i.e., activation de T cells dans la présence ou l’absence de suppresseurs). Il est également possible de manipuler de cibler les cellules cancéreuses pour exprimer les ovules, ce qui peuvent induire la mort cellulaire du cancer spécifique de l’antigène par les cellules OT-1 T. Donc, le dosage permettra également aux enquêtes de la MAM/MDSC-mediated suppression d’activation des cellules T spécifiques de l’antigène. Il est également possible d’appliquer le test afin d’enquêter sur des cellules humaines, comme l’activation anticorps contre humain CD3 et CD28 sont disponibles dans le commerce, et un protocole d’isoler TAMs humaines provenant d’échantillons cliniques a été établi19.
Collectivement, ce dosage est très polyvalent et peut être utilisé pour examiner la cytotoxicité des autres types de cellules immunitaires. Actuellement, dans nos laboratoires, il est étendu afin d’examiner la cytotoxicité cellulaire dépendante de l’antigène dans diverses conditions et est également en cours d’élaboration pour un débit élevé de dépistage.

Il est connu que CD8+ T cellules peuvent d’éliminer les cellules tumorales lorsqu’elles exercent leur cytotoxicité complet. Après l’activation du récepteur des lymphocytes T (TCR), CD8+ T les cellules prolifèrent et se différencient en cellules effectrices cytotoxiques. Le CD8 activés et élargie+ T cellules sécrètent des granules cytotoxiques, y compris la perforine et granzymes, qui sont transférés dans des cellules cibles et initient diverses voies lytiques comme caspase-3 médiée par apoptose1. CD8+ T cellules peuvent également induire l’apoptose des cellules tumorales en activant les récepteurs sur les cellules cibles, tels que les récepteurs de facteur de nécrose tumorale-α (TNF-α), premiers apoptosis signal ligand (FasL) ou TNF-related induisant l’apoptose ligand (TRAIL). En outre, les CD8 activés+ T cellules sécrètent l’interféron-γ (IFN-γ) qui peut supprimer la prolifération des cellules tumorales et accroître la sensibilité des cellules tumorales aux CD8+ T des cellules via la régulation de FasL récepteur1. Vu le potentiel de CD8+ T capacité de mise à mort de tumeur, plusieurs stratégies pour stimuler leur cytotoxicité (p. ex., inhibiteurs de point de contrôle, la vaccination du cancer et transfert adoptif du récepteur de l’antigène chimérique (voiture) exprimant des lymphocytes T) ont été établis et illustré d’important effets thérapeutique sur certains types de cancer2. Cependant, accumulant les preuves suggère qu’immunitaires infiltrant-tumeur des cellules comme les lymphocytes T régulateurs, suppresseur myéloïde dérivées des cellules (MDSCs) et macrophages associées à la tumeur (EAPV) peuvent supprimer CD8+ T fonctions des cellules et limitent l’efficacité des immunothérapies3,4,5. Pour améliorer ces immunothérapies, il est important de comprendre la limite de cellules immunitaires comment suppresseurs CD8+ la cytotoxicité des lymphocytes T. L’identification des CD8+ des lymphocytes T des mécanismes de répression ainsi que des cibles thérapeutiques pour la surmonter, il faudra le développement et l’utilisation des essais in vitro.
La méthode de l’étalon-or de mesure CD8+ la cytotoxicité des lymphocytes T est le test de libération de chrome dans lequel la sortie de la sonde radioactive (51Cr), de la cible des cellules qui sont lysées par CD8+ T des cellules, est déterminée6. Cependant, ce dosage a plusieurs inconvénients, notamment une sensibilité relativement faible, ambiants, incapacité à détecter les événements apoptotiques précoces, problèmes d’élimination dangereux et compatibilité limitée avec la manipulation de liquides automatique et détection de soutenir applications de débit plus élevées. Une autre méthode commune est analyses de cytométrie de flux des flux dans lequel l’apoptose des cellules tumorales cible est détectée par annexine V liaison7. Dans ce test, il est possible de détecter d’autres paramètres tels que la mort des cellules cibles à l’aide de l’iodure de propidium (PI) ou 7-aminoactinomycine D (7-AAD) et activation des cellules effectrices indiqué par l’expression CD107a ou CD69, en plus de l’apoptose dans les cellules cibles7 . Toutefois, ce test nécessite un grand nombre de cellules suppressives par rapport à l’essai de version de Chrome. Il exige également le détachement et la ventilation des cellules cibles adhérentes et cela peut fausser les résultats. En effet, le chrome version test ou test de cytométrie en flux ne sont pas couramment utilisés pour étudier les effets sur les cellules sur des fonctions des lymphocytes T suppresseurs. Au lieu de cela, la mesure de la prolifération des lymphocytes T indiquée par dilution d’un colorant fluorescent (p. ex., CFSE) pré-chargés dans les cellules T est fréquemment utilisée pour évaluer l’inhibition des CD8+ la fonction des cellules T par les cellules suppressives. Détection de la production d’IFN-γ provenant des cellules T est une autre méthode standard pour évaluer les effets des cellules suppressives sur l’activation de lymphocytes T8,9. Toutefois, les résultats de ces essais ne correspondent pas nécessairement à la cellule cible, tuant la capacité des CD8+ T des cellules.
Nous présentons ici un autre test fonctionnel afin d’évaluer les effets des cellules suppressives, notamment les macrophages dans les tumeurs métastatiques, sur la cytotoxicité des CD8+ T des cellules. Cette méthode détermine la cytotoxicité des CD8+ T, préalablement cultivées avec ou sans les cellules suppressives en présence d’anticorps anti-CD3/CD28 activation par détection de l’apoptose des cellules tumorales, les cellules indiquent par fluorescence d’un fluorogène caspase-3 substrat à l’aide de6 automatisé time-lapse microscopie (Figure 1). Ce protocole a plusieurs avantages par rapport aux autres méthodes ; Il nécessite seulement un petit nombre de cellules, permet de détecter la mort des cellules tumorales adhérentes à haute sensibilité, peut l’image interaction effecteurs-cible en temps réel et se prête au criblage à haut débit.
Dans ce protocole, métastases associées aux macrophages (SMMA) et leurs ancêtre monocytaire-MDSCs (M-MDSCs) isolés de tumeurs métastatiques chez les souris sont utilisées comme cellules suppressives. Dans des modèles murins de cancer du sein métastatique, une population distincte des macrophages caractérisé comme F4/80hauteLy6G–CD11bhauteLy6Cfaible s’accumule dans le poumon contenant des tumeurs métastatiques. Cette population de macrophage est rarement trouvée dans le poumon normal et donc appelée macrophages associées aux métastases (SMMA)10. Dans ces modèles de souris, un autre myéloïde cellule population, définie aussi F4/80hauteLy6G–CD11bhauteLy6Chaute, aussi s’accumule surtout dans le poumon métastatique où elle donne naissance à SMMA11. Selon leurs caractéristiques, les CD11bhauteLy6Chaute MAM cellules progénitrices pourraient représenter M-MDSCs12.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin EDTA (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Freiner Bio-One</td>
			<td>665-180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL Plystyrene Round-Bottom Tube</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Cell Culture Plate (Round Bottom )</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3799</td>
			<td>Co-culture of CD8+T cells with sorted myeloid cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate (Flat bottom)</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>165305</td>
			<td>Co-culture of CD8+T cells with target cells for cytotoxicity assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF647 anti-mouse F4/80 Antibody</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>MCA497A647</td>
			<td>Clone: CIA3-1, Lot#: 1707, 2 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor700 anti-mouse CD8 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100730</td>
			<td>Clone: 53-6.7, Lot#: B205738, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD28 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102111</td>
			<td>Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 37.51, Lot#: B256340</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD3e Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100314</td>
			<td>Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 145-2C11, Lot#: B233720</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD3 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100236</td>
			<td>Clone: 17A2, Lot#: B198730, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cy7 anti-mouse Ly6C Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>128026</td>
			<td>Clone: HK1.4, Lot#: B248351, 1 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albmin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1470-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer (100&#956;m Nylon)</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352360</td>
			<td>To smash the spleen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer (40&#956;m Nylon)</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352340</td>
			<td>To filter the lung digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>422801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8242;s Modified Eagle&#8242;s Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>19853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse CD4 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100406</td>
			<td>Clone: GK1.5, Lot#: B179194, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex Ready-to-Use</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1596-01</td>
			<td>Coating the 96-well plates for cytotoxicity assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte NucLight Red Lentivirus Reagent</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>4476</td>
			<td>Lenti viral particules encoding mKate2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte ZOOM</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td></td>
			<td>Detector (fluorescence microscope)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte ZOOM 2018A</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td></td>
			<td>Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2916801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lung Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-095-927</td>
			<td>Preparation of single cell suspension from the tumor-bearing lung</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MycoAlert Mycoplasma Detection Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>LT07-318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acid (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucView488</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>10403</td>
			<td>Fluoregenic caspase-3 substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse Ly6G Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>127607</td>
			<td>Clone: 1A8, Lot#: B258704, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 anti-mouse CD11b Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101216</td>
			<td>Clone: M1/70, Lot#: B249268, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Penicillin Streptomycin for primary culture of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103132</td>
			<td>Clone: 30-F11, Lot#: B249564, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene (Hexadimethrine bromide)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis Buffer (10X)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine IL-2</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>212-12</td>
			<td>Activation of isolated CD8+ T cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruStain fcX (anti-mouse CD16/32) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>&#160;: Nikon 10X objective (resolution 1.22 &#181;m) 
			&#160;: Green channel excitation: 440 - 480 nm 
			&#160;: Green channel emission: 504 - 544 nm 
			&#160;: Red channel excitation: 565-605 nm 
			&#160;: Red channel emission: 625 - 705 nm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real time detection of in vitro tumor cell apoptosis induced by cd8+ t cells to study immune suppressive functions of tumor-infiltrating myeloid cells

Potentialisation de la capacité de tumeur-massacre des CD8+ T les cellules des tumeurs, ainsi que de leur infiltration tumorale efficace, est un élément clé du succès immunothérapies. Plusieurs études ont montré que les cellules myéloïdes infiltrantes de tumeur (par exemple, les cellules myéloïdes dérivés suppresseur (MDSCs) et macrophages associées à la tumeur (EAPV)) suppriment cytotoxicité des CD8+ T des cellules dans le microenvironnement tumoral et ce ciblage ces cellules myéloïdes réglementaires peuvent améliorer les immunothérapies. Nous présentons ici un système de test in vitro pour évaluer les effets suppressifs immunitaires monocytaire-MDSCs et TAMs sur la capacité de tumeur-massacre des CD8+ T des cellules. À cette fin, nous avons cultivé tout d’abord naïve splénique CD8+ T cellules avec les activant anticorps anti-CD3/CD28 en présence ou en absence de cellules suppressives et puis conjointement mis en culture les cellules T pré-activé avec cibler les cellules cancéreuses en présence d’un fluorogène substrat de caspase-3. Fluorescence du substrat dans les cellules cancéreuses a été détectée par microscopie de fluorescence en temps réel comme un indicateur de l’apoptose des cellules tumorales de lymphocytes induite. Dans cet essai, nous pouvons détecter avec succès l’augmentation de l’apoptose des cellules tumorales par CD8+ T les cellules et sa répression par pré-culture avec TAMs ou MDSCs. Cette analyse fonctionnelle est utile pour l’étude des CD8+ T cell des mécanismes de répression par des cellules myéloïdes réglementaires et identification de cibles thérapeutiques pour la surmonter par l’intermédiaire de criblage à haut débit.

Cette méthode est basée sur une co-culture simple de cibler les cellules cancéreuses avec effectrices CD8+ T des cellules qui ont été préalablement cultivées avec ou sans cellules suppressives en présence d’anticorps activation anti-CD3/CD28. Il détecte CD8+ cancer des lymphocytes T-induit l’apoptose des cellules au fil du temps suivant la co-culture, permettant ainsi l’évaluation des effets des cellules suppressives sur la cytotoxicité des CD8+ T des cellules.
Les cellules cancéreuses augmentent généralement, fluorescence vert dans leurs noyaux après l’activation d’un biocapteur de caspase ciblage nucléaire lorsque ces cellules entrer en contact avec CD8+ T des cellules qui sont préactivées par les anticorps en l’absence de suppresseur cellules ( Figure 3; Film supplémentaire 1). Une fluorescence verte du substrat de caspase était détectable pendant au moins 15 h après que l’apoptose a été lancé. Certains apoptose spontanée d’effecteur CD8+ T cellules a également été observée au fil du temps même si ces cellules sont cultivées isolément (Figure 4; Film supplémentaire 2). Cependant, les tailles de noyaux de CD8+ T cellules sont plus petites que celles des cellules cancéreuses et ainsi les cellules apoptotiques « effecteur » peuvent être exclues de l’apoptose des lymphocytes « cible » par une méthode d’analyse taille restriction image (Figure 2 et Figure 4). Bien que certains cibler les cellules cancéreuses montrent une petite forme arrondie sans fluorescence verte, cela n’affecte pas l’analyse que ces cellules subissent une mitose plutôt que l’apoptose (complémentaire Movie 3) et sont ainsi exclus apoptotiques « cible » les numérations par un masque rouge/vert chevauchement (complémentaire Figure 2). Apoptose spontanée de cibler les cellules cancéreuses se trouve parfois même dans la culture unique (3 de film supplémentaire). Toutefois, la co-culture de cancer cible cellules CD8 pré-activé+ T cellules à l’apoptose des cellules tumorales accrue au-dessus des niveaux d’apoptose spontanée en monoculture des cellules cancéreuses (Figure 4). En règle générale, lorsque vous utilisez un rapport optimal de cibler les cellules cancéreuses pour les cellules effectrices, un pic du nombre d’apoptotic cibler les cellules cancéreuses peut être observé (Figure 5 a). Ce pic est plus nette lorsque les données sont exprimées comme la fraction apoptotique de la population de cellules de cible (Figure 5 b). Dans cette expérience l’apoptose basale des cellules tumorales cible a culminé à 24h (avec fraction apoptotique = 0,08), mais CD8+ l’apoptose induite par des lymphocytes T atteint un niveau maximum à 17 h (avec fraction apoptotique = 0.66).
De plus, nous avons constaté que CD8+ T cellules préalablement incubées avec le SMMA ou M-MDSCs pourraient faire entrer en contact avec cibler les cellules cancéreuses, mais ce contact semblait résulter dans des cas moins de l’apoptose des cellules du cancer par rapport aux CD8+ T cellules pré-activé sans cellules suppressives (Figure 3 et Figure 4; Film supplémentaire 4 et film supplémentaire 5). Bien que le CD8+ T cellules préalablement incubées avec les cellules myéloïdes parfois induit l’apoptose des cellules du cancer, il y avait également une prolifération de cibler les cellules cancéreuses qui n’ont pas été stimulé à l’apoptose au cours de l’évolution temporelle de la expérience (6 de film supplémentaire). Conformément à ces conclusions, la fraction de la crête des cellules cancéreuses apoptotic cultivées avec CD8+ T cellules préalablement incubées avec cellules myéloïdes (fraction apoptotique = 0,38 à 23 h pour MDSC-E et 0,25 à 20 h pour MAM-E) était significativement plus faible que celle des cellules cancéreuses cultivées avec CD8+ T cells qui n’étaient pas préalablement incubées avec les cellules suppressives (Figure 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig1.jpg"> Figure 1 : un schéma montrant la procédure expérimentale. Naïve splénique CD8+ T les cellules sont cultivées avec des anticorps d’anti-CD3/CD28 activation, avec ou sans métastases associées aux macrophages (SMMA) ou suppresseur monocytaire myéloïde-dérivées de cellules (M-MDSCs). Après 4 jours, flottant CD8+ T les cellules sont recueillies et cultivées conjointement avec cibler les cellules cancéreuses en présence d’un substrat fluorogène caspase-3. Cellules cancéreuses apoptotiques sont détectés sous fluoroscopie en temps réel. Les images ont été acquises à l’aide d’une plate-forme d’imagerie cellulaire direct (voir Table des matières). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig2.jpg"> Figure 2 : Identification des cellules en apoptose cible distinctes de cellules effectrices apoptotic. Acquisition d’Image : rangée du haut dans le canal rouge permet l’identification des noyaux de cellules cibles par masque de détection de cible (masque d’analyse rose). Rangée du milieu : les Images acquises dans le canal vert indiquent apoptotique des cellules effectrices et cible. Asize restreint l’apoptose masque (masque analyse teal ; supérieur à 80 µm2) permet seul apoptotique des cellules effectrices à exclure de l’analyse. Rangée du bas : composite images fusionnée rouge et verts canaux avec image de contraste phase (à gauche) ou rouge/vert chevauchent masque (à droite). Identification de fluorescence verte co localisé, de taille restreinte avec fluorescence rouge (masque d’analyse jaune), permet une détection plus précise des apoptotic noyaux cibles (flèche jaune) en excluant les agrégats de cellules effectrices en apoptose (blanc pointes de flèche). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig3.jpg"> Figure 3 : Interaction entre CD8+ T les cellules et les cellules cancéreuses. Photos du représentant time-lapse films des cellules cibles E0771-LG_NLR (T) cultivées conjointement avec effectrices CD8+ T (E) des cellules au ratio 4:1 effecteur/cible. MDSC-E et MAM-E indiquent les cellules effectrices préalablement incubées avec M-MDSCs et SMMA respectivement. Image composite (y compris les images de chaînes de phase contrast, rouge et vert) sont affichées. Pointes de flèche sont suivi les mêmes cellules à travers les différents domaines et les points dans le temps. Jaune de pointes de flèches : une cible qui associe des effecteurs et subit des pointes de flèches de l’apoptose, blanc : une cible qui associe des effecteurs, mais ne subit pas l’apoptose. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig4.jpg"> Figure 4 : détection de cellules cancéreuses apoptotic. Champs représentant extraites de films de time-lapse à 18 h après l’imagerie. Des images composites (left ; canaux de phase contrast, rouge et vert) et du rouge canal sans (au milieu) ou avec chevauchement (à droite) rouge/vert masque (jaune) sont affichés. Points jaunes dans la colonne de droite représentent les cellules cancéreuses apoptotic. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig5.jpg"> Figure 5 : CD8+ cancer des lymphocytes T-induit l’apoptose des cellules. (A) nombre d’apoptotic cellules cancéreuses cultivées avec effecteur C8+ T cellules à différents effecteurs au ratio cible (E:T). (B) Apoptotic fraction de la population de cellules cibles. Les données sont moyen ± SD. moyenne surface sous la courbe (AUC) est également indiqué. Non appariés t-test avec correction de Welch a été utilisé pour analyser les AUC. * P < 0,0001 comparé à E:T = 0:1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig6.jpg"> Figure 6 : Effets des cellules myéloïdes-infiltration tumorale sur la cytotoxicité des CD8+ T des cellules. (A) nombre de cellules cancéreuses apoptotiques (cible : T) cultivé avec C8+ T cellules (effecteur : E) 4:1 de rapport de E:T. CD8+ T a pré cultivé des cellules en l’absence (cercle noir) ou la présence de cellules suppressives monocytaire myéloïde-dérivé (MDSC-E: blue circle) ou métastases associées aux macrophages (MAM-e : cercle rouge). Données sont moyen ± SD. (B) Apoptotic fraction de la population de cellules cibles. Les données sont moyen ± SD. signifie AUC est aussi indiquée. Non appariés t-test avec correction de Welch a été utilisé pour analyser les AUC. * P < 0,0001 par rapport à T, #P < 0,0001 comparé à E + T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig6large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
Supplémentaire Figure 1. Stratégie de blocage pour isoler les cellules suppressives du poumon métastatique. (A) point représentatif complote pour isoler les cellules monocytaire suppresseur d’origine myéloïde (M-MDSCs) et les macrophages associées aux métastases (SMMA). Le seuil de niveau de Ly6C pour distinguer la SMMA (Ly6Cbas) et M-MDSCs (Ly6Chaute) est basé sur celle des macrophages alvéolaires résidents (CCMR). Pureté (B) des M-MDSCs triés (CD45+Ly6G–CD11b +Ly6Chaute) et SMMA (CD45+Ly6G–CD11b +Ly6Cfaible). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/FigureS1_Rvd.pdf">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
Supplémentaires Figure 2. Images représentant des cellules cibles mitotique. Photos du représentant films time-lapse de mono-culture de cellules de cible E0771-LG_NLR. Haut : images composites, y compris les images de chaînes de phase contrast, rouge et vert. En bas : des images composites (canaux rouge et vert) avec masque rouge/vert chevauchement. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/FigureS2_Rvd.pdf">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
Supplémentaire Figure 3. Effets des cellules myéloïdes-infiltration tumorale sur la prolifération des CD8+ des cellules de T. (A) représentant histogrammes montrant la dilution de marquage fluorescent avec CFSE en CD8+ T des cellules. Naïve splénique CD8+ T les cellules ont été isolées comme décrit dans le protocole-3 et étiquetés avec 5 µM de CFSE à 37 ° C pendant 15 min. Les cellules T marquées ont été cultivées en présence de IL-2 et anti-CD3/CD28, activation des anticorps avec ou sans cellules myéloïdes comme décrit dans le protocole N° 4. Après 4 jours, une fluorescence verte dans les cellules T a été détectée par cytomètre en flux. (B) indice de Division de CD8+ T cellules calculé comme décrit précédemment17. Les données sont des moyens ± SEM. * P < 0,01 par rapport à contrôler, #P < 0,05 par rapport à αCD3/CD28 AB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/FigureS3_Rvd.pdf">s’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
Film supplémentaire 1. Film de Figures 3 et 4 ; E + T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS1.mp4">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
Film supplémentaire 2. Film de Figures 3 et 4 ; Effecteur (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS2.mp4">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
Film supplémentaire 3. Film de Figures 3 et 4 ; Cible (T). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS3.mp4">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
Film supplémentaire 4. Film de Figures 3 et 4 ; MDSC-E + T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS4.mp4">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
Film supplémentaire 5. Film de Figures 3 et 4 ; MAM-E + T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS5.mp4">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
Film supplémentaire 6. Film de Figures 3 et 4 ; MAM-E + T (prolifération). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS6.mp4">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>

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Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Nous décrivons ici un protocole afin d’étudier la cytotoxicité des CD8 pré-activé+ T les cellules contre les cellules cancéreuses en détectant l’apoptose cancer cellules via en temps réel la microscopie. Ce protocole peut enquêter sur les mécanismes à l’origine myéloïde cellulaire induite par des lymphocytes T suppression et évaluer composés visant à reconstituer T cellules via blocus des cellules myéloïdes suppresseurs immunitaires.

Détection en temps réel de dans l’apoptose des cellules tumorales in Vitro induite par CD8+ T Cells pour étudier les fonctions immunitaires de suppresseurs de tumeur-infiltration de cellules myéloïdes

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Notre protocole évalue les effets des cellules suppressrices myéloïdes-dérivées et des macrophages tumeur-associés dans l’apoptose de cellule de tumeur T-cellule-induite. Parallèlement à l’étude des mécanismes sous-jacents des interventions thérapeutiques potentielles. Ce protocole évalue directement l’apoptose de cellules tumorales induites par les cellules T avec une sensibilité élevée et permet l’analyse longitudinale et l’imagerie des interactions cellule à cellule.L’efficacité de l’inhibiteur de point de contrôle est mieux examinée par les cellules myéloïdes tumeur-infiltration dans certains types de tumeur. Cette technique pourrait conduire à l’identification de nouvelles thérapies pour ces tumeurs. Cette méthode pourrait non seulement faire progresser la recherche en immunologie du cancer, mais pourrait également fournir un aperçu de l’immunodéficience et des maladies auto-immunes.Pour l’activation et l’expansion des lymphocytes T CD8-positifs isolés de la rate, d’abord aliquot une fois 10 à la cinquième T-cells CD8-positives dans 50 microlitres d’E-DMEM dans les puits individuels d’une plaque u-bottom de 96 puits. Ensuite, ajoutez une fois 10 aux cinquièmes cellules suppressrices dans 50 microlitres d’E-DMEM, ou 50 microlitres d’E-DMEM seulement, dans chaque puits de T-cellules. Ajoutez ensuite 50 microlitres de milieu d’activation fraîchement préparé et 50 microlitres d’E-DMEM, avec ou sans les réhabilités d’essai d’intérêt, aux puits appropriés.Et placez la plaque dans un incubateur de 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone avec 95% d’humidité pendant quatre jours. Pour mettre en place une co-culture préactivée des cellules cibles à cellule T CD8-positives, ajoutez d’abord 30 microlitres de matrice de membrane soluble à fond plat diluée de 1 à 100 à 100,100, à la matrice de membrane soluble réduite par facteur de croissance aux puits appropriés d’une plaque à fond plat de 96 puits, adaptée à la microscopie. Secouez la plaque pour répartir la matrice uniformément, et placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant au moins une heure.Pendant que la plaque est en équilibre, préparez les cellules cibles. Aspirer le milieu, laver avec PBS, et ajouter un millilitre de 05%Trypsin-EDTA à température ambiante pendant une minute. Ajouter neuf millilitres de DMEM complétés par du sérum bovin fœtal par pipetting doux, et transférer les cellules dissociées dans des tubes.Après avoir centrifugé les cellules, réutiliser la palette en 500 microlitres d’E-DMEM. Filtrer les cellules résuspendus à travers une passoire cellulaire, et compter les cellules vivantes. Ajustez ensuite la densité à quatre fois 10 à la quatrième cellule cible par millilitre dans l’E-DMEM frais sur la glace.Ensuite, pipette les lymphocytes T CD8 pré-activés à quelques reprises pour résuspendre les cellules dans une seule suspension cellulaire, et transférer les lymphocytes T flottants dans un tube de 1,5 millilitre par condition. Recueillir les cellules restantes avec 200 microlitres de PBS par puits, transférer les lavages dans les tubes appropriés de 1,5 millilitre, et centrifugeuse. Aspirer le milieu et ajouter un millilitre d’E-DMEM à chaque tube pour la centrifugation.Après centrifugation, réutiliser les granulés dans 100 microlitres d’E-DMEM frais par tube. Après comptage, réglez les cellules de chaque tube à une densité de 1,6 fois 10 à la cinquième cellule T CD8-positive préactivée par millilitre de milieu, et placez les cellules sur la glace. Lorsque les cellules sont prêtes, aspirez la matrice membranaire du sous-sol de chaque puits de la plaque de microscopie de 96 puits et ajoutez 50 microlitres de cellules cibles à des puits individuels dans les 60 puits intérieurs de la plaque avec mélange.Ajouter 25 microlitres d’E-DMEM complétés par quatre fois 10 aux troisièmes unités par millilitre d’IL2, et 10 micromolaires de substrat fluorogène caspase-3 aux puits appropriés. Ajoutez ensuite 25 microlitres de lymphocytes T CD8 positifs pré-activés aux puits appropriés. Enfin, ajoutez e-DMEM aux puits appropriés pour faire un volume total de jusqu’à 100 microlitres.Ajouter 200 microlitres de PBS ou d’eau stérile dans tous les puits vides. Secouez la plaque et laissez la plaque sur une surface plane pendant 10 minutes. Pour imager les cellules, réglez le microscope pour acquérir des images en contraste de phase.Ainsi que les canaux de fluorescence adaptés à la protéine fluorescente à restriction nucléaire, et les fluorogéniques activés caspase-3 substrat fluorophores utilisés dans l’expérience. Capturez ensuite des images de chaque puits expérimental en contraste de phase et des deux canaux de fluorescence toutes les une à trois heures pendant au moins 72 heures. Pour analyser les images capturées, ouvrez une image à partir d’un puits de contrôle contenant uniquement des cellules cibles et un milieu sans substrat caspase-3 dans le canal de fluorescence utilisé pour le signal du substrat.Observez si un signal de fluorescence inapproprié est émis par les noyaux. Si le signal du substrat est apparent à l’intérieur des noyaux, utilisez un mélange spectral pour augmenter le pourcentage de signal de substrat retiré du signal des noyaux, jusqu’à ce que le signal du substrat disparaisse. Ensuite, voir un puits de contrôle contenant uniquement des noyaux non étiquetés cellules effectrices dans le milieu sans substrat caspase-3 dans les deux canaux de fluorescence individuellement.Observez si un signal est émis par les noyaux. Si aucun signal n’est apparent dans les différents canaux, aucun démixage spectral n’est nécessaire. Pour résoudre les objets fluorescents dans les deux canaux de fluorescence, utilisez une méthode de soustraction de fond de fluorescence avec des paramètres pertinents pour l’échantillon et les paramètres appropriés pour le fractionnement des bords.Utilisez des images de la monoculture cellulaire cible pour établir des paramètres pour la fluorescence nucléaire des cellules cibles. Utilisez des images de la monoculture des cellules effectrices pour établir des paramètres pour la fluorescence nucléaire apoptotique induite par le substrat. Utilisez des images de co-culture pour vérifier ou affiner les paramètres de fluorescence nucléaire apoptotique induite par le substrat dans les cellules cibles.Pour déterminer la taille minimale des noyaux cibles, utilisez des images dans le canal de signal des noyaux à partir des puits contenant uniquement des cellules cibles avec substrat de caspase. Pour déterminer la taille moyenne des noyaux effecteurs apoptotiques, utilisez des images dans le canal de signal du substrat à partir des puits contenant uniquement des cellules effectrices avec substrat de caspase. Pour compter le nombre de noyaux cellulaires cibles de fluorescence, mettre en place une procédure d’analyse à l’aide d’une restriction de taille minimale appropriée.À l’aide d’images de monoculture de cellules effectrices, mettre en place une deuxième procédure d’analyse pour compter le nombre de noyaux apoptotiques qui sont plus grands que la taille moyenne des noyaux effecteur apoptotique. Ensuite, mettre en place une troisième procédure d’analyse pour compter le nombre de cellules cibles apoptotiques en comptant le nombre de noyaux dans lesquels le signal du noyau et le signal de substrat limité par la taille co-localisent significativement. Typiquement, les cellules cancéreuses augmentent le signal de fluorescence dans leurs noyaux suivant l’activation d’un biocapteur de caspase de ciblage nucléaire quand les cellules prennent contact avec des lymphocytes T CD8-positifs pré-activés par des anticorps en l’absence des cellules suppressrices.La taille du noyau des lymphocytes T CD8 positifs est plus petite que celle des cellules cancéreuses. Ainsi, les cellules effectrices apoptotiques peuvent être exclues du nombre de cellules cibles apoptotiques par une méthode d’analyse d’image de restriction de taille. Bien que certaines cellules cancéreuses cibles présentent une petite forme arrondie sans fluorescence du substrat, cela n’affecte pas l’analyse.Comme ces cellules subissent une mitose plutôt qu’une apoptose et sont donc exclues du nombre de cellules cibles apoptotiques par un masque de chevauchement du signal du substrat nucléaire. La co-culture des cellules cancéreuses cibles avec des lymphocytes T CD8 positifs pré-activés augmente l’apoptose cellulaire tumorale au-dessus des niveaux d’apoptose spontanée dans les monocultures de cellules cancéreuses. Généralement, lors de l’utilisation d’un rapport optimal des cellules cancéreuses cibles aux cellules effectrices, un pic dans le nombre de cellules cancéreuses cibles apoptotiques peut être observé.Ce pic devient plus distinct lorsque les données sont exprimées comme la fraction apoptotique de la population cellulaire cible. La chose la plus importante à retenir lors de la tentative de ce protocole est de mettre en place des monocultures de cellules cibles et des monocultures de cellules effectrices pour une utilisation dans le développement des masques d’analyse. Cette méthode peut fournir un aperçu de la durée et de la fréquence des interactions des lymphocytes T aux cellules cancéreuses, et des conditions associées à la cytotoxicité dépendante des gènes dans les cellules humaines et souris.Nous développons actuellement cette analyse dans un écran à haut débit utilisant des cellules humaines pour identifier les composés qui inhibent l’immunosuppression myéloïde à base de cellules et améliorent ainsi l’efficacité des inhibiteurs des points de contrôle.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imagerie des Lymphocytes T CD8 résident dans des tumeurs du poumon humain tranches à l’aide de la microscopie confocale

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

Détection de potentiel de Membrane des mitochondries pour étudier CLIC4 HN4 induite par le Knockdown cellule Apoptosis In Vitro

Depletion of the mitochondrial membrane potential (MMP, &#916;&#936;m) is considered the earliest event in the apoptotic cascade. It even occurs ahead of ...

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Protocole d’isolement de cellules dendritiques macrophages dérivés de monocytes de souris et leur Activation ultérieure In Vitro avec tumeur Complexes immuns

Dendritic cells (DC) are heterogeneous cell populations that differ in their cell membrane markers, migration patterns and distribution, and in their ...

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

Débit par cytométrie en flux détection de cellules de cellules souches-comme pour le Cancer du sein nouvellement formé après le renversement de l’apoptose

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

Intramucosal Inoculation of Squamous Cell Carcinoma Cells in Mice for Tumor Immune Profiling and Treatment Response Assessment

Inoculation de cellules de carcinome épidermoïde chez les souris pour tumeur immunitaire profilage et évaluation de réponse traitement suffit

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is a debilitating and deadly disease with a high prevalence of recurrence and treatment failure. To develop ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

En reprise cellule tumorale in Vitro pour l’évaluation prédictive de l’antigène chimérique fonction antitumorale des récepteurs des lymphocytes T

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction (en)

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Utilisation de cellules souches pluripotentes induites par l'homme pour la génération de lymphocytes T spécifiques à l'antigène tumoral

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Génération de tumeurs pancréatiques orthopiques et caractérisation ex vivo de la cytotoxicité des cellules T infiltrantes

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

Mesurer la réponse en temps réel des médicaments dans les tranches de tissu tumoral organotypique

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...