Name: real time detection of in vitro tumor cell apoptosis induced by cd8+ t cells to study immune suppressive functions of tumor-infiltrating myeloid cells
Uploaded: 2019-01-29T12:30:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells at JoVE

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים טרסט (101067/Z/13/Z (JWP), 109657/Z/15/Z (TK), 615KIT/J22738 (TK), בריטניה), את MRC (מר/N022556/1 (JWP, TK), בריטניה). הסוכנים, DDS להכיר התמיכה הלאומית פנוטיפי הקרנת מרכז Phenomics גילוי יוזמה, סרטן מחקר בבריטניה (NOC)

<ol>
	<li>Barry, M., Bleackley, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+T+lymphocytes:+all+roads+lead+to+death.">Cytotoxic T lymphocytes: all roads lead to death.</a> Nature Reviews in Immunology. 2, 401-409 (2002).</li><li>Durgeau, A., Virk, Y., Corgnac, S., Mami-Chouaib, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+targeting+CD8+T-cell+immunity+for+more+effective+cancer+immunotherapy.+Frontiers+in+Immunology.">Recent advances in targeting CD8 T-cell immunity for more effective cancer immunotherapy. Frontiers in Immunology.</a> 9. , 14 (2018).</li><li>Tanaka, A., Sakaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cells+in+cancer+immunotherapy.">Regulatory T cells in cancer immunotherapy.</a> Cell Research. 27, 109-118 (2017).</li><li>Fleming, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+myeloid-derived+suppressor+cells+to+bypass+tumor-induced+immunosuppression.">Targeting myeloid-derived suppressor cells to bypass tumor-induced immunosuppression.</a> Frontiers in Immunology. 9, 398 (2018).</li><li>Cassetta, L., Kitamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+targeting:+opening+new+possibilities+for+cancer+immunotherapy.">Macrophage targeting: opening new possibilities for cancer immunotherapy.</a> Immunology. 155, 285-293 (2018).</li><li>Chahroudi, A., Silvestri, G., Feinberg, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+T+cell-mediated+cytotoxicity+using+fluorogenic+caspase+substrates.">Measuring T cell-mediated cytotoxicity using fluorogenic caspase substrates.</a> Methods. 31, 120-126 (2003).</li><li>Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+flow+cytometric+assays+for+monitoring+cell-mediated+cytotoxicity.">New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity.</a> Expert Review of Vaccines. 9, 601-616 (2010).</li><li>Azimi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification,+isolation,+and+functional+assay+of+regulatory+T+Cells.">Identification, isolation, and functional assay of regulatory T Cells.</a> Immunological Investigation. 45, 584-602 (2016).</li><li>Bruger, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+measure+the+immunosuppressive+activity+of+MDSC:+assays,+problems+and+potential+solutions.">How to measure the immunosuppressive activity of MDSC: assays, problems and potential solutions.</a> Cancer Immunology Immunotherapy. , (2018).</li><li>Qian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+macrophage+population+mediates+metastatic+breast+cancer+cell+extravasation,+establishment+and+growth.">A distinct macrophage population mediates metastatic breast cancer cell extravasation, establishment and growth.</a> PLoS One. 4, e6562 (2009).</li><li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytes+differentiate+to+immune+suppressive+precursors+of+metastasis-associated+macrophages+in+mouse+models+of+metastatic+breast+cancer.">Monocytes differentiate to immune suppressive precursors of metastasis-associated macrophages in mouse models of metastatic breast cancer.</a> Frontiers in Immunology. 8, 2004 (2018).</li><li>Bronte, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+myeloid-derived+suppressor+cell+nomenclature+and+characterization+standards.">Recommendations for myeloid-derived suppressor cell nomenclature and characterization standards.</a> Nature Communications. 7, 12150 (2016).</li><li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCL2-induced+chemokine+cascade+promotes+breast+cancer+metastasis+by+enhancing+retention+of+metastasis-associated+macrophages.">CCL2-induced chemokine cascade promotes breast cancer metastasis by enhancing retention of metastasis-associated macrophages.</a> Journal of Experimental Medicine. 212, 1043-1059 (2015).</li><li>Ewens, A., Mihich, E., Ehrke, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distant+metastasis+from+subcutaneously+grown+E0771+medullary+breast+adenocarcinoma.">Distant metastasis from subcutaneously grown E0771 medullary breast adenocarcinoma.</a> AnticancerResearch. 25, 3905-3915 (2005).</li><li>Choppa, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+PCR+for+the+detection+of+Mycoplasma+fermentans,+M.+hominisandM.+penetransin+cell+cultures+and+blood+samples+of+patients+with+chronic+fatigue+syndrome.">Multiplex PCR for the detection of Mycoplasma fermentans, M. hominisandM. penetransin cell cultures and blood samples of patients with chronic fatigue syndrome.</a> Molecular and Cellular Probes. 12, 301-308 (1998).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current protocols in immunology. , (2001).</li><li>Koyanagi, M., Kawakabe, S., Arimura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+colorimetric+cell+proliferation+assays+in+immune+cells.">A comparative study of colorimetric cell proliferation assays in immune cells.</a> Cytotechnology. 68, 1489-1498 (2016).</li><li>Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid-derived-suppressor+cells+as+regulators+of+the+immune+system.">Myeloid-derived-suppressor cells as regulators of the immune system.</a> Nature Reviews in Immunology. 9, 162-174 (2009).</li><li>Cassetta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+and+human+tumor-associated+macrophages.">Isolation of mouse and human tumor-associated macrophages.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 899. 899, 211-229 (2016).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

שיטה זו מבוססת על שני שלבים נפרדים תרבות משותפת: שיתוף culturing CD8+ T תאים עם פוטנציאל תאים משתיק קול, שיתוף culturing CD8 'מיזוג מראש' של+ T תאים עם היעד תאים סרטניים (איור 1). השלב הראשון של תרבות משותפת הוא די דומה לזה של CD8+ T תא מבחני אי ההפצה הנפוץ כדי לקבוע את ההשפעה של תאים משתיק קול על CD8+ תא T פונקציה. עם זאת, תא T התפשטות לא תמיד לתאם עם cytotoxicity שלהם. לדוגמה, מצאנו את תרבות משותפת עם M-MDSCs או MAMs גדל ולא התפשטות מופחתת של CD8+ T תאים בנוכחות CD3/CD28 הפעלת נוגדנים (משלים איור 3), ואילו אלה מראש ממוזגים CD8+ תאי T הפגינו מופחת cytotoxicity נגד היעד תאים סרטניים (איור 4, איור 5, איור 6). תוצאות אלה להדגיש את חשיבות הערכת פעילות פונקציונלית, שמעידים היעד סרטן התא אפופטוזיס, המוצעים על ידי זה CD8+ assay cytotoxicity תא T.
ב הזה assay, זיהינו את CD8+ T תאים דורש כ 15 h של תרבות משותפת כדי לגרום אפופטוזיס המרבי של תאים סרטניים החלב E0771-LG העכבר (איור 5). עיכוב זה עשוי לנבוע ההשהיה בין הקשר הראשוני של תאים אפקטור עם מטרות הנלווה היווצרות סינפסה המערכת החיסונית, כמו גם משך הזמן הנדרש כדי לגרום מוות אותות שהמטרות כפי שנמדד על-ידי הפעלה של קספאז-3 (1 הסרט משלים ). גם זיהינו מספר תאים סרטניים אפופטוטיים להיפגע הגיעו מישור לאחר 24 שעות, אשר ככל הנראה בשל חיסול של מטרות על-ידי תאי T ו/או אובדן אות פלואורסצנט תאים מתים. יכולת זו כדי לזהות את שעת שיא אפופטוזיס הוא אחד היתרונות של זה וזמינותו מאז קביעת נקודת זמן אופטימלי חשוב להשוואות המתאים בין מצבים שונים. במקרה שלנו, לדוגמה, ההבדל cytotoxicity בין שליטה CD8+ T תאים ו CD8 MDSC/אמא-משכילים+ T תאים היה הרבה יותר גדול ב- 15-18 h לעומת 72 h (איור 5), ובכך נקודת קצה הניסוי באמצעות תקופת הדגירה 72 h יניב תוצאות מטעות.
בנוסף, שיטה זו מאפשרת הדמיה של אינטראקציה בזמן אמת תא אפקטור-כדי-היעד, אשר יספק תובנות המנגנון שבבסיס cytotoxicity מוגבלת של CD8+ T תאים טרום מודגרות עם משתיק קול תאים. לדוגמה, הבחנו כי CD8+ T תאים מודגרות מראש עם M-MDSCs או MAMs נתקל, לבוא במגע עם היעד תאים סרטניים אך לא תמיד לגרום אפופטוזיס (משלים סרט 4, השלמה 5 סרט, 6 הסרט משלים). אמנם אנחנו לא לכמת את האירוע הזה, זה יהיה ריאלי ומעניין לכמת ולהשוות את הפרופורציה של מפגשים וזמן האינטראקציה שלהם מתאם עם אפופטוזיס. יתרון מרכזי נוסף הוא כי שיטה זו דורשת מספר קטן של תאים (למשל, עונה 1 פרק 103 של יעד) ו- 4 x 103 תאים אפקטור לכל טוב. למעשה, פרוטוקול זה יכול להיות עוד יותר מיניאטורי עבור התבנית צלחת 384-ובכן אם רצונך בכך. לכן, וזמינותו הזה מתאים תפוקה גבוהה ההקרנה וניסויים איפה מספרי הטלפון הנייד מוגבלים כגון במבחנה בדיקה באמצעות תאים יקר נגזר מויוו או ex-vivo דגימות.
מצד שני, מגבלה של וזמינותו הנוכחית היא הנוכחות של מספר משמעותי של תאים אפקטור מת, בתנאים מסוימים. על מנת להגביר את הדיוק בהבחנה אפופטוזיס של היעד תאים סרטניים מזו של אפקטור CD8+ T תאים, את הגרעינים של היעד תאים מסומנים ו של גרעין האטום. הגבלת גודל (שתואמות אפקטור תאים) מוחל לניתוח נתונים זה assay (איור 2). עם זאת, קיימים בכמה מקרים שבהם כיסוי של אגרגטים של מוות (ירוק) CD8+ T תאים אל הלא-מוות היעד תאים סרטניים, אשר עשויים לבלבל את התוצאות. מגבלה זו יכולה להיות חמאני השימוש עמודה להסרת תאים מתים על אפקטור תאים לפני תרבות משותפת עם היעד תאים סרטניים, בהנחה מספר מספיק של תאים אפקטור הינם זמינים. עם מערכות מיקרוסקופ מורכב יותר, ייתכן גם שתהיה אפשרות להפחית את הסימן חיובי כוזב על-ידי תיוג של אפקטור CD8+ T תאים עם נבדל האטום תא היעד לבין המצע קספאז-3 fluorogenic fluorophore.
עד כה, פרוטוקול זה יש כבר מנוצל כדי לחקור את ההפעלה שאינם ספציפיים אנטיגן של CD8+ T תאים. למרות MDSCs, תאמי ב microenvironment הגידול לדכא את תא T פונקציות באמצעות מנגנונים שאינם ספציפיים אנטיגן, MDSCs הלימפה ברקמות היקפיים לדכא את תא T תגובות באופן ספציפי אנטיגן18. לחקור פונקציות החיסונית המדכא של סוגי תאים כאלה, וזמינותו התפשטות במבחנה באמצעות CD8+ T תאים מחלון OT-1 העכברים הטרנסגניים הוא נפוץ. ב הזה assay, תאי T OT-1 (לבטא אובלבומין (פשוט) תא T ספציפי קולטן) שיתוף מתורבתים עם משתיק קול MDSCs בנוכחות ביצית פפטידים, אשר ישימה עבור התרבות הראשונה ב- assay cytotoxicity שלנו (כלומר., הפעלה של T תאים ב נוכחות או היעדרות של מדכאי). . זה גם ריאלי לתמרן היעד תאים סרטניים לבטא ביצית, אשר יכול לגרום סרטן אנטיגן ספציפי הרג תא על-ידי תאי T OT-1. לכן, וזמינותו יאפשר גם חקירה של הדיכוי אמא/MDSC-מתווכת של הפעלת תא T אנטיגן ספציפי. . זה גם ניתן להחיל וזמינותו לחקור תאים אנושיים, כמו הפעלת נוגדנים נגד CD3 ואנושי CD28 זמינים מסחרית, פרוטוקול כדי לבודד תאמי האנושי מדגימות קליניים כבר הוקמה19...
באופן קולקטיבי, assay הזה הוא תכליתי מאוד והוא יכול לשמש כדי לבחון את cytotoxicity של סוגי תאים חיסוניים אחרים. כיום, במעבדות שלנו, זה להיות מורחב לבחון תלויי-אנטיגן תא cytotoxicity בתנאים שונים, הוא גם מפותח עבור תפוקה גבוהה ההקרנה.

זה ידוע כי CD8+ T תאים יכול לחסל תאים סרטניים כאשר הם מפעילים את cytotoxicity המלא שלהם. לאחר ההפעלה של הקולטן תא T (TCR), CD8+ T תאים להתרבות, להבדיל לתוך תאים אפקטור ציטוטוקסיות. התרחב, הופעל CD8+ T תאים מפרישים בגרגרים ציטוטוקסיות, כולל perforin ו- granzymes, אשר מועברים לתוך תאי היעד וליזום מסלולים lytic שונים כגון קספאז-3 מתווכת אפופטוזיס1. CD8+ T תאים יכול גם לגרום אפופטוזיס תאים סרטניים על ידי הפעלת רצפטורים על התאים היעד, כגון קולטני הגידול נקרוזה מקדם-α (TNF-α), אפופטוזיס הראשון אות ליגנד (FasL) או הקשורים ל- TNF ליגנד בתדר אפופטוזיס (שובל). יתר על כן, הופעל CD8+ T תאים מפרישים אינטרפרון-γ (IFN-γ) שיכול לדכא את התפשטות תאים סרטניים ולהגביר את רמת הרגישות של גידול התאים CD8+ T תאים באמצעות למעלה-ברגולציה של קולטן FasL1. נתון את הפוטנציאל עבור CD8+ T הגידול הרג היכולת, מספר אסטרטגיות כדי להגביר את cytotoxicity שלהם (למשל, מחסום מעכבי חיסון סרטן, העברת המאמצת של chimeric אנטיגן קולטן (מכונית) המבטאת תאי T) הוקמו שמוצג אפקטים טיפוליים משמעותיים על סוגים מסוימים של סרטן2. עם זאת, לצבירת ראיות מרמז כי החיסון גידולים הסתננות התאים כגון תאי T רגולטוריים, משתיק קול, נגזר מיאלואידית תאים (MDSCs), הקשורים מקרופאגים (תאמי) יכול לדכא CD8+ T תא פונקציות ולהגביל את היעילות immunotherapies3,4,5. כדי לשפר את immunotherapies כל כך, חשוב להבין איך המערכת החיסונית משתיק קול תאים מגבלת CD8+ cytotoxicity תא T. הזיהוי של CD8+ תא T מנגנוני דיכוי, כמו גם מטרות druggable להתגבר על זה, יחייב את פיתוח וניצול מיטבי של מבחני במבחנה.
השיטה תקן הזהב של מדידת CD8+ cytotoxicity תא T הוא lysed הם וזמינותו שחרור כרום אשר שחרורו של החללית רדיואקטיבי (51Cr), היעד תאים זה על ידי CD8+ T תאים, הוא נחוש6. אולם, assay הזה יש מספר חסרונות כולל רגישות נמוכה יחסית, רקע, חוסר יכולת לאתר אירועי מוות מוקדם, בעיות סילוק מסוכנים ותאימות מוגבלת עם טיפול בנוזלים אוטומטי וזיהוי לתמוך יישומי תפוקה גבוהה יותר. שיטה נפוצה נוספת היא זרימה cytometric ניתוחים שבהם אפופטוזיס של תאים סרטניים היעד הוא זוהה על ידי annexin V מחייב7. זה assay, זה אפשרי לגילוי פרמטרים אחרים כגון מוות תאי היעד באמצעות propidium יודיד (PI) או 7-aminoactinomycin D (7-מ) והפעלה אפקטור התא שצוין על-ידי ביטוי CD107a או CD69, בנוסף אפופטוזיס בתאים היעד7 . עם זאת, זה וזמינותו מחייבת מספר גדול של תאים משתיק קול לעומת וזמינותו שחרור כרום. זה גם דורש את הניתוק ואת disaggregation של התאים היעד חסיד, זה יכול הטיה את התוצאות. אכן, בגלל הכרומיום לשחרר assay או זרימה cytometric assay לא משמשות כדי לחקור השפעות תא משתיק קול על פונקציות תא T. במקום זאת, המדד של תא T התפשטות שצוין על-ידי דילול של הפלורסנט (למשל, CFSE) שהוטענו מראש בתאי T נעשה שימוש תכוף כדי להעריך את עיכוב של CD8+ תא T פונקציה על ידי תאים משתיק קול. זיהוי של IFN-γ ייצור מתאי T תרבותי היא שיטה סטנדרטית נוספת כדי להעריך את ההשפעות של תאים משתיק קול על תא T הפעלה8,9. עם זאת, התוצאות של מבחני אלה לא בהכרח מתאימות לתא היעד להרוג את היכולת של CD8+ T תאים.
אנו מציגים כאן assay פונקציונלי חלופי כדי להעריך את ההשפעות של תאים משתיק קול, במיוחד מקרופאגים, גידולים גרורות, על cytotoxicity של CD8+ T תאים. שיטה זו קובעת cytotoxicity של CD8+ T תאים, מראש תרבותי עם או בלי התאים משתיק קול בנוכחות נוגדנים anti-CD3/CD28 הפעלת, על ידי גילוי הגידול תא אפופטוזיס, המצוין על-ידי קרינה פלואורסצנטית מ fluorogenic קספאז-3 המצע6 שימוש אוטומטי זמן לשגות מיקרוסקופ (איור 1). פרוטוקול זה יש כמה יתרונות לעומת שיטות אחרות; זה דורש רק מספר קטן של תאים, מאפשרת גילוי של מוות תאי הגידול חסיד עם רגישות גבוהה, יכולים ליצור תמונות מערכת אינטראקציה אפקטור-כדי-יעד בזמן אמת והוא נוטה ההקרנה תפוקה גבוהה.
פרוטוקול זה, macrophages הקשורים גרורות (MAMs), שלהם קדמון monocytic-MDSCs (M-MDSCs) מבודד גידולים גרורות עכברים משמשים כתאים משתיק קול. העכבר דגמים של סרטן שד גרורתי, מאופיין אוכלוסיה שונות של מקרופאגים כמו F4/80גבוההLy6G–CD11bגבוההLy6Cנמוכה שמצטבר הריאה המכיל גידולים גרורות. אוכלוסייה זו מקרופאג לעתים רחוקות נמצא בכבד נורמלי, לפיכך נקרא גרורות-הקשורים מקרופאגים (MAMs)10. במודלים אלה העכבר, אחרת מיאלואידית תא אוכלוסייה, המוגדר בתור F4/80גבוההLy6G–CD11bגבוהLy6Cגבוה, גם שמצטבר בעיקר ריאות גרורתי איפה זה מעורר MAMs11. בהתבסס על המאפיינים שלהם, CD11bגבוההLy6Cגבוהה אמא ובתאים עשוי לייצג M-MDSCs12.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin EDTA (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Freiner Bio-One</td>
			<td>665-180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL Plystyrene Round-Bottom Tube</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Cell Culture Plate (Round Bottom )</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3799</td>
			<td>Co-culture of CD8+T cells with sorted myeloid cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate (Flat bottom)</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>165305</td>
			<td>Co-culture of CD8+T cells with target cells for cytotoxicity assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF647 anti-mouse F4/80 Antibody</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>MCA497A647</td>
			<td>Clone: CIA3-1, Lot#: 1707, 2 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor700 anti-mouse CD8 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100730</td>
			<td>Clone: 53-6.7, Lot#: B205738, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD28 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102111</td>
			<td>Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 37.51, Lot#: B256340</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD3e Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100314</td>
			<td>Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 145-2C11, Lot#: B233720</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD3 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100236</td>
			<td>Clone: 17A2, Lot#: B198730, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cy7 anti-mouse Ly6C Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>128026</td>
			<td>Clone: HK1.4, Lot#: B248351, 1 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albmin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1470-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer (100&#956;m Nylon)</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352360</td>
			<td>To smash the spleen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer (40&#956;m Nylon)</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352340</td>
			<td>To filter the lung digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>422801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8242;s Modified Eagle&#8242;s Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>19853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse CD4 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100406</td>
			<td>Clone: GK1.5, Lot#: B179194, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex Ready-to-Use</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1596-01</td>
			<td>Coating the 96-well plates for cytotoxicity assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte NucLight Red Lentivirus Reagent</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>4476</td>
			<td>Lenti viral particules encoding mKate2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte ZOOM</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td></td>
			<td>Detector (fluorescence microscope)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte ZOOM 2018A</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td></td>
			<td>Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2916801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lung Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-095-927</td>
			<td>Preparation of single cell suspension from the tumor-bearing lung</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MycoAlert Mycoplasma Detection Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>LT07-318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acid (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucView488</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>10403</td>
			<td>Fluoregenic caspase-3 substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse Ly6G Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>127607</td>
			<td>Clone: 1A8, Lot#: B258704, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 anti-mouse CD11b Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101216</td>
			<td>Clone: M1/70, Lot#: B249268, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Penicillin Streptomycin for primary culture of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103132</td>
			<td>Clone: 30-F11, Lot#: B249564, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene (Hexadimethrine bromide)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis Buffer (10X)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine IL-2</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>212-12</td>
			<td>Activation of isolated CD8+ T cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruStain fcX (anti-mouse CD16/32) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>&#160;: Nikon 10X objective (resolution 1.22 &#181;m) 
			&#160;: Green channel excitation: 440 - 480 nm 
			&#160;: Green channel emission: 504 - 544 nm 
			&#160;: Red channel excitation: 565-605 nm 
			&#160;: Red channel emission: 625 - 705 nm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real time detection of in vitro tumor cell apoptosis induced by cd8+ t cells to study immune suppressive functions of tumor-infiltrating myeloid cells

Potentiation ליכולת הגידול הרג של CD8+ T התאים בגידולים, יחד עם חדירה יעיל הגידול שלהם, היא מרכיב מרכזי של immunotherapies מוצלח. מספר מחקרים הראו כי הגידול הסתננות התאים מיאלואידית (למשל, התאים מיאלואידית נגזר משתיק קול (MDSCs) וסרטניים הקשורים מקרופאגים (תאמי)) לדכא את cytotoxicity של CD8+ T תאים microenvironment את הגידול, את המיקוד אלה בתאי מיאלואידית הרגולציה יכול לשפר את immunotherapies. כאן, אנו מציגים את מערכת assay במבחנה כדי להעריך את ההשפעות מדכא מערכת החיסון של monocytic-MDSCs תאמי ביכולת הגידול הרג של CD8+ T תאים. לשם כך, אנו קודם תרבותי תמים CD8 הטחול+ T תאי עם הפעלת נוגדנים anti-CD3/CD28 נוכחות או היעדרות של תאים משתיק קול, ואז תרבותי משותף תאי T מופעל מראש עם היעד תאים סרטניים בנוכחות fluorogenic המצע קספאז-3. קרינה פלואורסצנטית מן המצע בתאים סרטניים זוהה על-ידי קרינה פלואורסצנטית בזמן אמת מיקרוסקופ כמחוון של T-cell המושרה גידול התא אפופטוזיס. ב- assay זו, אנו יכולים להבחין בהצלחה העלייה ואפופטוזיס תאים סרטניים על ידי CD8+ T תאים, את הדיכוי התרבות מראש עם תאמי או MDSCs. Assay תפקודית זו שימושית עבור חוקרים CD8+ T תא מנגנוני דיכוי על ידי התאים מיאלואידית רגולטוריות ומטרות druggable מזהים להתגבר באמצעות הקרנה תפוקה גבוהה.

שיטה זו מבוססת על תרבות משותפת פשוטה של היעד תאים סרטניים עם אפקטור CD8+ T תאים, כי יש כבר מראש תרבותי עם או בלי משתיק קול תאים בנוכחות נוגדנים הפעלת אנטי-CD3/CD28. הוא מזהה CD8+ סרטן תא T-induced אפופטוזיס תא לאורך זמן בעקבות תרבות משותפת, ובכך מאפשר הערכת ההשפעות של תאים משתיק קול על cytotoxicity של CD8+ T תאים.
בדרך כלל, תאים סרטניים להגדיל פלורסצנטיות ירוק בגרעין שלהם בעקבות ההפעלה של ביוסנסור קספאז גרעיני פילוח כאשר תאים אלה ליצור קשר עם CD8+ T תאים זה מראש מופעלים על ידי נוגדנים בהיעדר (תאים משתיק קול איור 3; הסרט משלים 1). קרינה פלואורסצנטית ירוק מן המצע קספאז היה לזיהוי לפחות 15 h אחרי אפופטוזיס יזמו. כמה אפופטוזיס ספונטנית של אפקטור CD8+ T תאים נצפתה גם לאורך זמן גם אם תאים אלה היו תרבותי בבידוד (איור 4; הסרט משלים 2). עם זאת, הגרעינים הגדלים של CD8+ T תאים קטנים מאלה של תאים סרטניים, ובכך בתאים אפופטוטיים להיפגע 'אפקטור"יכול לא ייכללו מוות התא 'יעד' נחשב על ידי מהווה גודל התמונה ניתוח שיטת הגבלה (איור 2 , איור 4). למרות כמה תאים סרטניים המטרה להראות צורה מעוגלת קטן ללא קרינה פלואורסצנטית ירוק, זה אינו משפיע על הניתוח כפי תאים אלו עוברים מיטוזה ולא אפופטוזיס (3 הסרט משלים), ולכן אינם נכללים מוות 'יעד' תא מונה על ידי מסיכת חפיפה אדום/ירוק (משלים איור 2). אפופטוזיס ספונטנית של היעד תאים סרטניים מעת לעת מתגלות אפילו בתרבות יחיד (3 הסרט משלים). עם זאת, התרבות שיתוף של היעד סרטן תאים עם מראש הופעל CD8+ T תאים אפופטוזיס תא הגידול גדל מעל הרמות של אפופטוזיס ספונטנית מונוקולטורה של תאים סרטניים (איור 4). באופן כללי, בעת שימוש יחס מיטבי של היעד תאים סרטניים לתאי אפקטור, לשיא במספר של מוות לחסל תאי סרטן יכול להיות שנצפו (איור 5A). שיא זה הוא ברור יותר כאשר הנתונים מבוטאת השבר מוות של האוכלוסייה תא המטרה (איור 5B). בניסוי זה אפופטוזיס הבזליים של היעד תאים סרטניים לשיאה ב- 24 שעות (אפופטוטיים להיפגע שברים = 0.08), אבל CD8+ תא T-induced אפופטוזיס להגיע לרמה המקסימלית ב 17 h (אפופטוטיים להיפגע שברים = 0.66).
עוד מצאנו כי CD8+ T תאים מודגרות מראש עם MAMs או M-MDSCs יכול להפוך קשר עם היעד תאים סרטניים אך קשר זה נראה את התוצאה פחות מקרים של סרטן תאים אפופטוזיס בהשוואה CD8+ T תאים מופעל מראש ללא משתיק קול תאים (איור 3 ו 4 איור; הסרט משלים 4 וסרטים משלים 5). למרות CD8+ T תאים טרום מודגרות עם התאים מיאלואידית מדי פעם המושרה סרטן התא אפופטוזיס, היה שם גם כמה התפשטות של תאים סרטניים המטרה זה לא כבר עוררו במנגנוני במהלך הזמן הניסוי (6 הסרט משלים). השבר שיא של תאים סרטניים מוות בקנה אחד עם הממצאים הללו, תרבותי עם CD8+ T תאים טרום מודגרות עם התאים מיאלואידית (אפופטוטיים להיפגע שבר = 0.38 ב 23 h עבור MDSC-E ו- 0.25-20 h עבור אמא-E) היה נמוך באופן משמעותי מזה של תאים סרטניים בתרבית עם CD8+ T תאים אשר לא היו incubated מראש עם משתיק קול התאים (איור 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig1.jpg"> איור 1: ערכת מציג את הליך ניסיוני. CD8 הטחול תמים+ T תאים מתורבתים עם אנטי-CD3/CD28 הפעלת נוגדנים עם או ללא גרורות-הקשורים מקרופאגים (MAMs) או monocytic מיאלואידית-נגזר משתיק קול תאים (M-MDSCs). אחרי ארבעה ימים, צף CD8+ T תאים נאספים וכוח תרבותי משותף עם היעד תאים סרטניים בנוכחות סובסטרט קספאז-3 fluorogenic. תאים סרטניים אפופטוטיים להיפגע מזוהים תחת מיקרוסקופ פלורסצנטיות בזמן אמת. הראו תמונות נרכשו באמצעות פלטפורמה הדמיה תא חי (עיין טבלה של חומרים). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig2.jpg"> איור 2: זיהוי של מוות התאים היעד נפרדות מתאי אפקטור אפופטוטיים להיפגע. תמונה: שורה עליונה רכישה ב ערוץ הצבע האדום מאפשר הזיהוי של גרעיני תא היעד על-ידי היעד איתור מסכת (ניתוח ורוד מסיכה). בשורה האמצעית: תמונות שרכש את הערוץ הירוק לציין אפקטור אפופטוטיים להיפגע ותאי המטרה. מסכת אפופטוזיס מוגבלת Asize (ניתוח טיל מסיכה; גדול מ מיקרומטר 802) מאפשר מוות בודד אפקטור תאים ייכללו הניתוח. שורה תחתונה: הפרדות צבע תמונות אדום הממוזג, ערוצי ירוק עם שלב חדות תמונה (משמאל) או אדום/ירוק חפיפה מסכה (מימין). זיהוי של שותף מקומי, בעל הגבלת גודל פלורסצנטיות ירוק עם פלואורסצנטי אדום (מסיכה ניתוח צהוב), מאפשר זיהוי מדויק יותר של מוות היעד גרעינים (חץ צהוב) על-ידי להוציא אגרגטים של מוות אפקטור תאים (לבן ראשי חץ). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig3.jpg"> איור 3: האינטראקציה בין CD8+ T תאים ותאים סרטניים. צילומי סטילס מתוך סרטים זמן לשגות נציג של התאים היעד E0771-LG_NLR (T) ותרבותית משותפת עם אפקטור CD8+ T תאים (E) ביחס 4:1 אפקטור/יעד. MDSC-E ואמא-E מציינים אפקטור תאים טרום מודגרות עם M-MDSCs ו- MAMs בהתאמה. מוצגות תמונות ללא הפרדות צבע (כולל תמונות מערוצים ניגודיות, אדום וירוק שלב). ראשי חץ עוקבים אותם התאים דרך שדות שונים נקודות זמן. ראשי חץ צהוב: יעד זה משייך effectors ועוברים ראשי חץ אפופטוזיס, לבן: יעד זה משייך effectors אבל לא עוברים אפופטוזיס. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig4.jpg"> איור 4: זיהוי של תאים סרטניים אפופטוטיים להיפגע. שדות נציג שחולצו מן זמן לשגות סרטים ב- 18 h לאחר דימות. תמונות ללא הפרדות צבע (שמאל; ערוצי שלב ניגודיות, אדום וירוק) ותמונות מאדום לתקשר ללא (באמצע) או עם חפיפה (מימין) אדום/ירוק מוצגים מסכת (צהוב). נקודות צהובות בעמודה השמאלית מייצגים מוות תאים סרטניים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig5.jpg"> איור 5: CD8+ תא T-induced סרטן התא אפופטוזיס. (א) מספר מוות תאים סרטניים בתרבית עם אפקטור C8+ T תאים ב אפקטור שונה היעד יחס (E:T)-מוות (B) שבר מאוכלוסיית תא היעד. הנתונים הם אמצעי ± SD. אומר אזור תחת עקומת (AUC) מוצג גם. אינטראקצית t-test עם התיקון של וולש שימש כדי לנתח את חאן אל. * P < 0.0001 בהשוואה E:T = 0:1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig6.jpg"> איור 6: ההשפעות של גידולים הסתננות התאים מיאלואידית על cytotoxicity של CD8+ T תאים. (א) מספר תאים סרטניים אפופטוטיים להיפגע (המטרה: T) תרבותי עם C8+ T תאים (אפקטור: E)-4:1 של יחס E:T. CD8+ T תאים היו מראש תרבותי היעדרות (עיגול שחור) או נוכחות של תאים monocytic מיאלואידית-נגזר משתיק קול (MDSC-e: כחול מעגל) או גרורות-הקשורים מקרופאגים (MAM-e: עיגול אדום). הנתונים הם אמצעי ± SD. (B) מוות שבר מאוכלוסיית תא היעד. הנתונים הם אמצעי ± SD. מתכוון חאן אל מוצג גם. אינטראקצית t-test עם התיקון של וולש שימש כדי לנתח את חאן אל. * P < 0.0001 בהשוואה ל- T בלבד, #P < 0.0001 בהשוואה ל- E + טי <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
משלים איור 1. אסטרטגיה חסימה כדי לבודד תאים מדכא סרטן ריאות גרורתי. (A) נקודה נציג מתווה לבודד תאים משתיק קול מיאלואידית נגזר monocytic (M-MDSCs) ו מקרופאגים הקשורים גרורות (MAMs). סף Ly6C רמת להבחין MAMs (Ly6Cנמוכה) ו- M-MDSCs (Ly6Cגבוהה) מבוססת על זו של תושב מכתשי מקרופאגים (RMAC). (B) טוהר ממוינות M-MDSCs (CD45+Ly6G–CD11b+Ly6Cגבוהה), MAMs (CD45+Ly6G–CD11b+Ly6Cנמוך). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/FigureS1_Rvd.pdf">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>
משלים באיור 2. תמונות נציג של התאים mitotic היעד. צילומי סטילס מתוך סרטים זמן לשגות נציג של המטרה E0771-LG_NLR מונו-תרבית תאים. העליון: תמונות ללא הפרדות צבע, כולל תמונות מערוצים ניגודיות, אדום וירוק שלב. למטה: תמונות ללא הפרדות צבע (אדום וירוק ערוצים) עם אדום/ירוק חפיפה מסכה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/FigureS2_Rvd.pdf">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>
משלים איור 3. ההשפעות של גידולים הסתננות התאים מיאלואידית על התפשטות של CD8+ תאי T. (א) נציג היסטוגרמות מציג דילול של תיוג פלורסנט עם CFSE ב CD8+ T תאים. CD8 הטחול תמים+ T תאים היו מבודדים כפי שמתואר פרוטוקול-3 ומוענקת 5 מיקרומטר של CFSE ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. תאי T שכותרתו היו בתרבית בנוכחות il-2 ו anti-CD3/CD28 הפעלת נוגדנים עם או בלי התאים מיאלואידית כפי שמתואר פרוטוקול 4. אחרי ארבעה ימים, זריחה ירוק בתאי T זוהה על ידי זרימה cytometer. (B) חטיבת אינדקס של CD8+ T תאים מחושבים כפי שתואר לעיל17. הנתונים הם אמצעי ± ב- SEM * P < 0.01 בהשוואה לשלוט, #P < 0.05 בהשוואה לαcd3/CD28 השתמשנו <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/FigureS3_Rvd.pdf">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>
הסרט משלים 1. סרט של דמויות 3 ו- 4; E + טי <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS1.mp4">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>
הסרט משלים 2. סרט של דמויות 3 ו- 4; אפקטור (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS2.mp4">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>
הסרט משלים 3. סרט של דמויות 3 ו- 4; היעד (T). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS3.mp4">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>
הסרט משלים 4. סרט של דמויות 3 ו- 4; MDSC-E + טי <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS4.mp4">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>
הסרט משלים 5. סרט של דמויות 3 ו- 4; אמא-E + טי <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS5.mp4">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>
הסרט משלים 6. סרט של דמויות 3 ו- 4; אמא-E + T (הפצה). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS6.mp4">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells at JoVE

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

נתאר כאן פרוטוקול לחקור cytotoxicity של טרום הופעל CD8+ T תאים נגד תאים סרטניים על ידי גילוי אפופטוטיים להיפגע סרטן תאים באמצעות בזמן אמת מיקרוסקופ. פרוטוקול זה יכול לחקור מנגנונים מאחורי מיאלואידית הנוצרות על-ידי תאי T cell דיכוי והערכת תרכובות שמטרתה חידוש תאי T באמצעות המצור של תאים חיסוניים מיאלואידית מדכאים.

זיהוי בזמן אמת של הגידול Vitro תאים אפופטוזיס שנגזרות CD8+ T תאים ללמוד פונקציות החיסונית מדכא גידולים הסתננות התאים מיאלואידית

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

הפרוטוקול שלנו מעריך את ההשפעות של תאים מדכאים שמקורם במיאלואידים ואת המקרופאגים הקשורים לגידול באפופטוזיס של תאי גידול הנגרמים על ידי תאי T. לצד חקירת המנגנונים הבסיסיים של התערבויות טיפוליות אפשריות. פרוטוקול זה מעריך ישירות אפופטוזיס של תאי גידול הנגרמים על-ידי תאי T ברגישות גבוהה ומאפשר ניתוח אורך והדמיה של אינטראקציות בין תאים לתאים.היעילות של מעכבי מחסום הוא הסתכל בצורה הטובה ביותר על ידי תאים מיאלואידים חדירה לגידולים בסוגי גידול מסוימים. טכניקה זו יכולה להוביל לזיהוי של טיפולים חדשניים עבור גידולים אלה. שיטה זו יכולה לא רק לקדם מחקר אימונולוגיה של סרטן, אבל יכול גם לספק תובנה לתוך כשל חיסוני ומחלות אוטואימוניות.עבור ההפעלה וההרחבה של תאי T חיוביים CD8 מבודד טחול, aliquot הראשון פעם אחת 10 כדי CD8 חיובי החמישי T-תאים ב 50 microliters של E-DMEM לתוך בארות בודדות של לוח 96-well U-bottom. לאחר מכן, הוסף פעם אחת 10 לתאי המדכא החמישי ב-50 מיקרוליטרים של E-DMEM, או 50 מיקרוליטרים של E-DMEM בלבד, לכל באר של תאי T. לאחר מכן הוסיפו 50 מיקרוליטרים של מדיום הפעלה טרי ו-50 מיקרוליטרים של E-DMEM, עם או בלי המבחן, ל הבארות המתאימות.ומ מניחים את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני עם 95% לחות במשך ארבעה ימים. כדי להגדיר תא יעד T-cell T חיובי המופעל מראש, הוסף תחילה 30 מיקרוליטרים של מטריצת קרום מרתף מסיסת מופחתת גורם גדילה 1 עד 100 ל- 100 ל הבאר המתאימה של צלחת בעלת תחתית שטוחה של 96 בארות, המתאימה למיקרוסקופיה. מנערים את הצלחת כדי להפיץ את המטריצה באופן שווה, ומ מניחים את הצלחת ב החממה לתרבות התאים למשך שעה אחת לפחות.בזמן שהצלחת נמצאת בהוויה, הכינו את תאי המטרה. שאפו את המדיום, שטפו עם PBS והוסיפו מיליליטר אחד של 05% טריפסין-EDTA בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת. הוסף תשעה מיליליטר של DMEM בתוספת סרום חזיר עוברי על ידי צינורות עדינים, ולהעביר את התאים דיסוציאציה לתוך צינורות.לאחר צנטריפוגה של התאים, תן שימוש חוזר במשטחים ב-500 מיקרוליטרים של E-DMEM. סנן את התאים המתווסתים באמצעות מסננת תאים וספירת התאים החיים. לאחר מכן התאימו את הצפיפות לפי 4 מ-10 לתאי המטרה הרביעיים למיליליטר ב-E-DMEM טרי על קרח.לאחר מכן, פיפטה תאי T חיוביים CD8 מופעל מראש כמה פעמים כדי להשתמש מחדש את התאים לתוך מתלה תא יחיד, ולהעביר את תאי T צף לתוך צינור אחד 1.5 מיליליטר לכל תנאי. לאסוף את כל התאים הנותרים עם 200 microliters של PBS לגם, להעביר את השטיפה לתוך הצינורות המתאימים 1.5 מיליליטר, וצנטריפוגה. שאפו את המדיום והוסיפו מיליליטר אחד של E-DMEM לכל צינור לצנטריפוגה.לאחר הצנטריפוגה, יש למנוסה מחדש את הכדורים ב-100 מיקרוליטרים של E-DMEM טרי לצינור. לאחר הספירה, התאים בתאים בכל צינור לצפיפות של פי 1.6 10 לתאי ה- T החיוביים של CD8 המופעלים מראש למיליליטר של מדיום, ומ מניחים את התאים על קרח. כאשר התאים מוכנים, שאפו את מטריצת קרום המרתף מכל באר של צלחת המיקרוסקופיה בת 96 הבאר, והוסיפו 50 מיקרוליטרים של תאי מטרה לבירות בודדות בתוך 60 הבאר הפנימית של הצלחת עם ערבוב.הוסף 25 מיקרוליטרים של E-DMEM בתוספת ארבע פעמים 10 ליחידות השלישיות למיליליטר של IL2, ו 10 מיקרומולרים פלואורוגניים caspase-3 מצע ל בארות המתאימות. לאחר מכן הוסיפו 25 מיקרוליטרים של תאי T חיוביים ל-CD8 שהופעלו מראש ל בארות המתאימות. ולבסוף, להוסיף E-DMEM ל בארות המתאימות כדי להפוך את נפח כולל של עד 100 microliters.הוסיפו 200 מיקרוליטרים של PBS או מים סטריליים לכל בארות הריקות. לנער את הצלחת, ולהשאיר את הצלחת על משטח שטוח במשך 10 דקות. כדי לדמיין את התאים, הגדר את המיקרוסקופ לרכישת תמונות בניגודיות פאזה.כמו גם תעלות פלואורסצנטיות המתאימות לחלבון הפלואורסצנטי המוגבל לגרעין, ולפליאואורופורים פלואורוגניים המופעלים על ידי מצעים-3 המשמשים בניסוי. ואז ללכוד תמונות של כל באר ניסיונית בניגוד פאזה ואת שני ערוצי פלואורסצנטיות כל שעה עד שלוש שעות לפחות 72 שעות. כדי לנתח את התמונות שנלכדו, פתח תמונה מ באר בקרה המכילה רק תאי יעד ובינוניים ללא מצע CASPASE-3 בערוץ הפלואורסצנטי המשמש לאות מצע.שימו לב אם אות פלואורסצנטי לא הולם נפלט על ידי הגרעינים. אם אות המצע ניכר בתוך הגרעינים, השתמש בספקטרלי unmixing כדי להגדיל את אחוז אות המצע הוסר מאות הגרעינים, עד אות המצע נעלם. לאחר מכן, הצג באר בקרה המכילה רק תאי אפקט גרעינים ללא חגורה במדיום ללא מצע Caspase-3 בשני ערוצי הפלואורסצנטיות בנפרד.שימו לב אם אות נפלט על ידי הגרעינים. אם אין אות ברור בערוצים הבודדים, אין צורך בהיסוס ספקטרלי. כדי לפתור את האובייקטים הפלואורסצנטיים בשני ערוצי הפלואורסצנטיות, השתמש בשיטת חיסור רקע פלואורסצנטי עם פרמטרים רלוונטיים עבור המדגם ואת הפרמטרים המתאימים לפיצול קצה.השתמש בתמונות של מונוקולטורה של תאי היעד כדי לקבוע פרמטרים עבור פלואורסצנטיות גרעינית של תאי היעד. השתמש בתמונות של מונוקולטורה של תאים משפיעים כדי ליצור פרמטרים עבור פלואורסצנטיות גרעינית אפופוטוטית הנגרמת על ידי מצע. השתמש בתמונות של תרבות-משנה כדי לאמת או לחדד פרמטרים עבור פלואורסצנטיות גרעינית אפופוטוטית הנגרמת על ידי מצעים בתאי היעד.כדי לקבוע את הגודל המינימלי של גרעיני היעד, השתמש בתמונות בערוץ אות הגרעינים מה בארות המכילות רק תאי יעד עם מצע מדורג. כדי לקבוע את הגודל הממוצע של גרעיני אפקט אפופוטוטיקה, השתמש בתמונות בערוץ אות המצע מה בארות המכילות רק תאים משפיעים עם מצע מדורג. כדי לספור את מספר גרעיני תאי היעד של הפלואורסצנטיות, הגדר הליך ניתוח באמצעות הגבלת גודל מינימלית מתאימה.באמצעות תמונות monoculture תא אפקטור, להגדיר הליך ניתוח שני כדי לספור את מספר גרעיני apoptotic כי הם גדולים יותר מהגודל הממוצע של גרעיני אפקט apoptotic. לאחר מכן הגדר הליך ניתוח שלישי כדי לספור את מספר תאי היעד האפטוטיים על-ידי ספירת מספר הגרעינים שבהם אות הגרעין ואות המצע המוגבל בגודלם מאופנים באופן משמעותי. בדרך כלל, תאים סרטניים להגדיל את אות הפלואורסצנטיות בגרעין שלהם בעקבות ההפעלה של biosensor caspase מיקוד גרעיני כאשר התאים ליצור קשר עם CD8 חיובי T-תאים מופעל מראש על ידי נוגדנים בהעדר תאים מדכאים.גדלי הגרעין של תאי T חיוביים CD8 קטנים יותר מאלה של תאים סרטניים. לכן, תאים אפטוטיים אפקטר ניתן לא לכלול ספירת תאי יעד apoptotic על ידי שיטת ניתוח תמונה הגבלת גודל. למרות כמה תאים סרטניים היעד להפגין צורה מעוגל קטן ללא פלואורסצנטיות מצע, זה לא משפיע על הניתוח.כמו תאים אלה עוברים מיטוזה ולא אפופטוזיס ולכן אינם נכללים ספירת תאי יעד apoptotic על ידי מסכת חפיפה אות מצע גרעיני. התרבות השיתוף של תאים סרטניים היעד עם מופעל מראש CD8 חיובי T-תאים מגביר אפופטוזיס תאים סרטניים מעל רמות של אפופטוזיס ספונטני מונוקולטורות תאים סרטניים. בדרך כלל, בעת שימוש ביחס אופטימלי של תאים סרטניים היעד לתאי אפקט, שיא במספר תאים סרטניים היעד apoptotic ניתן לראות.שיא זה הופך להיות ברור יותר כאשר הנתונים מבוטאים כשבר האפטוטי של אוכלוסיית תאי היעד. הדבר החשוב ביותר שיש לזכור בעת ניסיון פרוטוקול זה הוא להגדיר monocultures של תאי היעד monocultures של תאים משפיעים לשימוש בפיתוח מסכות ניתוח. שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי משך ותדירות תאי T לאינטראקציות תאים סרטניים, והתנאים הקשורים לציטוטוקסיות תלוית גנים בתאי האדם והעכבר.אנו מפתחים כעת בדיקה זו לתוך מסך תפוקה גבוהה באמצעות תאים אנושיים כדי לזהות תרכובות המעכבות דיכוי חיסוני מתווך תאים מיאלואידים ובכך לשפר את היעילות מעכבי מחסום.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

לשעבר Vivo הדמיה של לימפוציטים מסוג T CD8 תושב באמבריולוגיה הגידול פרוסות משתמש מיקרוסקופיה קונפוקלית

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

זיהוי של המיטוכונדריה פוטנציאל ממברנה לימודים CLIC4 נוקאאוט-induced HN4 תא אפופטוזיס במבחנה

Depletion of the mitochondrial membrane potential (MMP, &#916;&#936;m) is considered the earliest event in the apoptotic cascade. It even occurs ahead of ...

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

בידוד פרוטוקול של העכבר נגזר מונוציט תאים דנדריטים והפעלה שלהם עוקבות במבחנה עם מכלולים חיסוניים הגידול

Dendritic cells (DC) are heterogeneous cell populations that differ in their cell membrane markers, migration patterns and distribution, and in their ...

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

גילוי Cytometric זרימה של תאים, כמו תאי גזע סרטניים בשד החדשה לאחר היפוך אפופטוזיס

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

Intramucosal Inoculation of Squamous Cell Carcinoma Cells in Mice for Tumor Immune Profiling and Treatment Response Assessment

חיסון intramucosal של תאי קרצינומה של תאים קשקשיים עכברים עבור פרופיל החיסונית הגידול והערכת התגובה לטיפול

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is a debilitating and deadly disease with a high prevalence of recurrence and treatment failure. To develop ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

ב- Rechallenge תא הגידול חוץ גופית להערכה חזוי של Chimeric אנטיגן קולטן תא T פונקציה Antitumor

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

בתוך שיטת חוץ גופית כדי ללמוד גידול-מקרופאג אינטראקציה

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

שימוש בתאי גזע של האדם המושרה Pluriפוטנטי עבור הדור של אנטיגן גידולים-תאים T ספציפיים

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

הדור של הלבלב אורתוטואט גידולים ואפיון Vivo Ex של תאים הסתננות של הגידול תא T

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

מדידת תגובת התרופה בזמן אמת בפרוסות רקמה אורגנוטימית לגידול

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...