Name: real time detection of in vitro tumor cell apoptosis induced by cd8+ t cells to study immune suppressive functions of tumor-infiltrating myeloid cells
Uploaded: 2019-01-29T12:30:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells at JoVE

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal Wellcome Trust (101067/Z/13/Z (JWP), 109657/Z/15/Z (TK), 615KIT/J22738 (TK), UK) e il MRC (MR/N022556/1 (JWP, TK), UK). NOC e DDS riconoscere sostegno dalla nazionale fenotipica Screening Centre Phenomics scoperta iniziativa e Cancer Research UK (NOC)

<ol>
	<li>Barry, M., Bleackley, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+T+lymphocytes:+all+roads+lead+to+death.">Cytotoxic T lymphocytes: all roads lead to death.</a> Nature Reviews in Immunology. 2, 401-409 (2002).</li><li>Durgeau, A., Virk, Y., Corgnac, S., Mami-Chouaib, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+targeting+CD8+T-cell+immunity+for+more+effective+cancer+immunotherapy.+Frontiers+in+Immunology.">Recent advances in targeting CD8 T-cell immunity for more effective cancer immunotherapy. Frontiers in Immunology.</a> 9. , 14 (2018).</li><li>Tanaka, A., Sakaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cells+in+cancer+immunotherapy.">Regulatory T cells in cancer immunotherapy.</a> Cell Research. 27, 109-118 (2017).</li><li>Fleming, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+myeloid-derived+suppressor+cells+to+bypass+tumor-induced+immunosuppression.">Targeting myeloid-derived suppressor cells to bypass tumor-induced immunosuppression.</a> Frontiers in Immunology. 9, 398 (2018).</li><li>Cassetta, L., Kitamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+targeting:+opening+new+possibilities+for+cancer+immunotherapy.">Macrophage targeting: opening new possibilities for cancer immunotherapy.</a> Immunology. 155, 285-293 (2018).</li><li>Chahroudi, A., Silvestri, G., Feinberg, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+T+cell-mediated+cytotoxicity+using+fluorogenic+caspase+substrates.">Measuring T cell-mediated cytotoxicity using fluorogenic caspase substrates.</a> Methods. 31, 120-126 (2003).</li><li>Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+flow+cytometric+assays+for+monitoring+cell-mediated+cytotoxicity.">New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity.</a> Expert Review of Vaccines. 9, 601-616 (2010).</li><li>Azimi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification,+isolation,+and+functional+assay+of+regulatory+T+Cells.">Identification, isolation, and functional assay of regulatory T Cells.</a> Immunological Investigation. 45, 584-602 (2016).</li><li>Bruger, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+measure+the+immunosuppressive+activity+of+MDSC:+assays,+problems+and+potential+solutions.">How to measure the immunosuppressive activity of MDSC: assays, problems and potential solutions.</a> Cancer Immunology Immunotherapy. , (2018).</li><li>Qian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+macrophage+population+mediates+metastatic+breast+cancer+cell+extravasation,+establishment+and+growth.">A distinct macrophage population mediates metastatic breast cancer cell extravasation, establishment and growth.</a> PLoS One. 4, e6562 (2009).</li><li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytes+differentiate+to+immune+suppressive+precursors+of+metastasis-associated+macrophages+in+mouse+models+of+metastatic+breast+cancer.">Monocytes differentiate to immune suppressive precursors of metastasis-associated macrophages in mouse models of metastatic breast cancer.</a> Frontiers in Immunology. 8, 2004 (2018).</li><li>Bronte, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+myeloid-derived+suppressor+cell+nomenclature+and+characterization+standards.">Recommendations for myeloid-derived suppressor cell nomenclature and characterization standards.</a> Nature Communications. 7, 12150 (2016).</li><li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCL2-induced+chemokine+cascade+promotes+breast+cancer+metastasis+by+enhancing+retention+of+metastasis-associated+macrophages.">CCL2-induced chemokine cascade promotes breast cancer metastasis by enhancing retention of metastasis-associated macrophages.</a> Journal of Experimental Medicine. 212, 1043-1059 (2015).</li><li>Ewens, A., Mihich, E., Ehrke, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distant+metastasis+from+subcutaneously+grown+E0771+medullary+breast+adenocarcinoma.">Distant metastasis from subcutaneously grown E0771 medullary breast adenocarcinoma.</a> AnticancerResearch. 25, 3905-3915 (2005).</li><li>Choppa, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+PCR+for+the+detection+of+Mycoplasma+fermentans,+M.+hominisandM.+penetransin+cell+cultures+and+blood+samples+of+patients+with+chronic+fatigue+syndrome.">Multiplex PCR for the detection of Mycoplasma fermentans, M. hominisandM. penetransin cell cultures and blood samples of patients with chronic fatigue syndrome.</a> Molecular and Cellular Probes. 12, 301-308 (1998).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current protocols in immunology. , (2001).</li><li>Koyanagi, M., Kawakabe, S., Arimura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+colorimetric+cell+proliferation+assays+in+immune+cells.">A comparative study of colorimetric cell proliferation assays in immune cells.</a> Cytotechnology. 68, 1489-1498 (2016).</li><li>Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid-derived-suppressor+cells+as+regulators+of+the+immune+system.">Myeloid-derived-suppressor cells as regulators of the immune system.</a> Nature Reviews in Immunology. 9, 162-174 (2009).</li><li>Cassetta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+and+human+tumor-associated+macrophages.">Isolation of mouse and human tumor-associated macrophages.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 899. 899, 211-229 (2016).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo metodo si basa su due passaggi separati co-cultura: co-coltura CD8+ T cellule con potenziale cellule del soppressore e co-coltura il CD8 'pre-condizionato'+ T cellule con le cellule tumorali bersaglio (Figura 1). Il primo passo di co-coltura è abbastanza simile a quella per CD8+ T cell analisi di proliferazione comunemente utilizzate per determinare l'effetto delle cellule del soppressore il CD8+ la funzione delle cellule T. Tuttavia, la proliferazione delle cellule T non correla sempre con loro citotossicità. Ad esempio, abbiamo trovato che la co-cultura con M-MDSC o MAMs aumentato piuttosto che ridotta proliferazione di CD8+ T cellule in presenza di CD3/CD28 attivando anticorpi (complementare figura 3), mentre questi pre-condizionata CD8+ Cellule di T hanno dimostrato ridotta citotossicità contro le cellule tumorali bersaglio (Figura 4, Figura 5, Figura 6). Questi risultati evidenziano l'importanza della valutazione dell'attività funzionale, evidenziato dalla destinazione apoptosi di cancro, offerti da questo CD8+ analisi di citotossicità delle cellule T.
In questa analisi, abbiamo identificato che CD8+ T cellule richiede circa 15 h di co-coltura al fine di indurre la massima apoptosi delle cellule di tumore mammario del topo E0771-LG (Figura 5). Questo ritardo potrebbe essere dovuto il ritardo tra il contatto iniziale di cellule effettrici con obiettivi e accompagnamento immuni sinaptogenesi, così come tempo necessario per indurre segnali apoptotici in destinazioni come misurato dall'attivazione di caspase-3 (supplementari Movie 1 ). Inoltre abbiamo identificato che il numero delle cellule apoptotiche tumore ha raggiunto un plateau dopo 24 h, che è probabilmente dovuto l'eliminazione degli obiettivi dalle cellule T e/o perdita di segnale fluorescente dalle cellule morte. Questa funzionalità per identificare il tempo di picco apoptosi è uno dei principali vantaggi di questo test, poiché la determinazione di un punto di tempo ottimale è importante per paragoni adeguati tra diverse condizioni. Nel nostro caso, ad esempio, la differenza nella citotossicità tra controllo CD8+ T cellule e CD8 MDSC/MAM-istruiti+ T cellule era molto più grande a 15-18 h rispetto a 72 h (Figura 5), e quindi un endpoint esperimento utilizzando un periodo di incubazione di 72h produrrebbe risultati fuorvianti.
Questo metodo consente anche la visualizzazione dell'interazione delle cellule effettrici-target in tempo reale, che fornirebbe maggiori approfondimenti il meccanismo alla base di citotossicità limitata di CD8+ T cellule pre-incubate con cellule del soppressore. Ad esempio, abbiamo osservato che CD8+ T cellule pre-incubate con M-MDSC o MAMs incontrato e interagito con le cellule del tumore di destinazione ma non ha sempre indotto apoptosi (complementare 4 film, complementare Movie 5, complementare Movie 6). Anche se non abbiamo quantificare questo evento, che sarebbe fattibile e interessante quantificare e confrontare la proporzione di incontri e il loro tempo di interazione in correlazione con l'induzione di apoptosi. Un altro grande vantaggio è che questo metodo richiede un piccolo numero di cellule (ad es., 1 x 103 di destinazione) e 4 x 103 di cellule effettrici per pozzetto. In realtà, questo protocollo può essere ulteriormente miniaturizzato per il formato piastra 384 pozzetti se lo si desidera. Pertanto, questo test è adatto per esperimenti e screening su vasta scala dove i numeri delle cellule sono limitati come test in vitro utilizzando preziose cellule derivate da in vivo o ex vivo campioni.
D'altra parte, una limitazione del dosaggio attuale è la presenza di un numero significativo di cellule effettrici morto in alcune condizioni. Al fine di aumentare la precisione nel distinguere l'apoptosi delle cellule tumorali bersaglio da quella di effettrici CD8+ T cellule, i nuclei delle cellule sono etichettati come destinazione ed una restrizione di dimensione (che esclude le cellule effettrici) viene applicato per l'analisi dei dati in questo i nuclei test (Figura 2). Tuttavia, ci sono alcuni casi dove sovrapposizione degli aggregati di apoptotic (verde) CD8+ T cellule in cellule di cancro non-apoptotica bersaglio, che possono confondere i risultati. Questa limitazione potrebbe essere ridotto dall'uso di una colonna di rimozione di cellule morte il priore di cellule effettrici di co-coltura con le cellule del tumore di destinazione, presupponendo che un numero sufficiente di cellule effettrici è disponibile. Con i più complessi sistemi di microscopia, potrebbe anche essere possibile ridurre il falso segnale positivo di etichettatura effettrici CD8+ T cellule con un fluoroforo distinto dai nuclei delle cellule bersaglio e substrato fluorogenic caspase-3.
Finora, questo protocollo è stato utilizzato per indagare l'antigene aspecifica attivazione di CD8+ T cellule. Anche se MDSC e TAMs nel microambiente tumorale sopprimere le funzioni delle cellule T attraverso meccanismi non specifico antigene, MDSC nei tessuti linfoidi periferici sopprimere le risposte delle cellule T in un modo specifico antigene18. Per indagare le funzioni immunitarie soppressive di tali tipi di cellule, un'analisi di proliferazione in vitro usando CD8+ T cellule da OT-1 topi transgenici è comunemente usato. In questa analisi, le cellule di OT-1 T (che esprimono il recettore specifico delle cellule di T di ovoalbumina (uova)) sono co-coltivate con soppressore MDSC in presenza di peptidi di ovuli, che è applicabile per la prima cultura nella nostra analisi di citotossicità (vale a dire., l'attivazione delle T cellule in la presenza o l'assenza di soppressori). È anche fattibile per manipolare le cellule tumorali bersaglio per esprimere gli ovuli, che possono indurre l'uccisione delle cellule antigene-specifiche cancro dalle cellule di OT-1 T. Di conseguenza, l'analisi consentirà inoltre indagine della MAM/MDSC-mediata soppressione dell'attivazione di cellule T antigene-specifiche. È anche possibile applicare l'analisi per studiare le cellule umane, come l'attivazione anticorpi contro umano CD3 e CD28 sono commercialmente disponibili, e un protocollo per isolare TAMs umana da campioni clinici è stato stabilito19.
Collettivamente, questo test è molto versatile e può essere utilizzato per esaminare la citotossicità di altri tipi delle cellule immuni. Attualmente, nei nostri laboratori, esso viene esteso per esaminare la citotossicità delle cellule antigene-dipendente in varie condizioni ed è anche in fase di sviluppo per high throughput screening.

È noto che CD8+ T cellule in grado di eliminare le cellule tumorali quando esercitano la loro citotossicità completo. Dopo l'attivazione del recettore delle cellule T (TCR), CD8+ T cellule proliferano e si differenziano in cellule effettrici citotossiche. L'espanso e attivati CD8+ T cellule secernono granuli citotossici, compreso perforine e granzimi, che vengono trasferiti in cellule bersaglio e avviare varie vie litiche come caspase-3 mediata apoptosi1. CD8+ T cellule possono anche indurre apoptosi delle cellule del tumore attraverso l'attivazione di recettori sulle cellule bersaglio, quali i recettori per il fattore di necrosi tumorale-α (TNF-α), apoptosi primi segnalano ligand (FasL), o TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL). Inoltre, il CD8 attivato+ T cellule secernono interferone-γ (IFN-γ) che possono sopprimere la proliferazione delle cellule tumorali e aumentare la sensibilità delle cellule del tumore di CD8+ T cellule via il su-regolamento del FasL ricevitore1. Dato il potenziale per CD8+ T capacità di uccisione di tumore, diverse strategie per aumentare la loro citotossicità (ad esempio, inibitori di checkpoint, vaccinazione anti-tumorale e trasferimento adottivo del recettore chimerico antigene (auto) che esprimono le cellule T) sono state stabilite e mostrati effetti terapeutici significativi su alcuni tipi di cancro2. Tuttavia, raccogliendo la prova suggerisce che cellule immuni di infiltrazione del tumore come cellule T regolatorie, cellule mieloidi derivato soppressore (MDSC) e macrofagi associati al tumore (TAM) possono sopprimere CD8+ T funzioni delle cellule e limitare l'efficacia di immunoterapie3,4,5. Per migliorare tale immunoterapie, è importante capire come immuni limite di cellule suppressor CD8+ la citotossicità delle cellule T. L'identificazione di CD8+ cellula T soppressione meccanismi così come bersagli per superarla, richiederà lo sviluppo e l'utilizzo di analisi in vitro.
Il metodo gold standard di misurazione CD8+ citotossicità delle cellule di T è il test di rilascio di cromo in cui il rilascio della sonda radioattiva (51Cr), dal target le cellule che vengono lisate dai CD8+ T cellule, è determinato6. Tuttavia, questo test ha diversi inconvenienti, tra cui sensibilità relativamente bassa, alta priorità bassa, incapacità di rilevare eventi apoptotici precoci, problemi di smaltimento pericolosi e limitata compatibilità con automatizzato liquid handling e rilevamento per sostenere applicazioni di throughput più elevate. Un altro metodo comune è analisi cytometric di flusso in cui apoptosi delle cellule tumorali bersaglio viene rilevato da annexin V associazione7. In questo test, è possibile rilevare altri parametri quali la morte delle cellule bersaglio utilizzando ioduro di propidio (PI) o 7-aminoactinomycin D (7-AAD) e l'attivazione delle cellule effettrici indicato dall'espressione CD107a o CD69, oltre l'apoptosi nelle cellule bersaglio7 . Tuttavia, questo test richiede tantissime cellule suppressor rispetto al test di rilascio di cromo. Richiede anche il distacco e la disaggregazione delle cellule bersaglio aderente e questo può influenzare i risultati. Infatti, il cromo rilasciare analisi o test citofluorimetrico non sono comunemente utilizzati per studiare gli effetti di cellule suppressor sulle funzioni delle cellule T. Invece, la misurazione della proliferazione di cellule T indicata dalla diluizione di un colorante fluorescente (ad es., CFSE) pre-caricati in cellule T viene spesso utilizzata per valutare l'inibizione di CD8+ funzione a cellula T di cellule del soppressore. Rilevamento della produzione di IFN-γ da cellule coltivate di T è un altro metodo standard per valutare gli effetti delle cellule del soppressore delle cellule T attivazione8,9. Tuttavia, i risultati di queste analisi non necessariamente correlato alla cella di destinazione uccidendo capacità di CD8+ T cellule.
Presentiamo qui un test funzionale alternativo per valutare gli effetti delle cellule del soppressore, specialmente macrofagi nei tumori metastatici, sulla citotossicità di CD8+ T cellule. Questo metodo determina la citotossicità di CD8+ T cellule, pre-coltivate con o senza le cellule soppressore in presenza di anticorpi attivanti anti-CD3/CD28, rilevando gli apoptosi della cellula tumorale, indicato dalla fluorescenza da un fluorogenic caspase-3 substrato6 utilizzo automatizzato microscopia time-lapse (Figura 1). Questo protocollo ha diversi vantaggi rispetto ad altri metodi; richiede solo un piccolo numero di cellule, consente il rilevamento di morte delle cellule tumorali aderente con alta sensibilità, può immagine interazione effettore--obiettivo in tempo reale ed è favorevole alla screening su vasta scala.
In questo protocollo, macrofagi associati a metastasi (MAMs) e loro progenitore monocytic-MDSC (M-MDSC) isolato da tumori metastatici in topi sono utilizzati come cellule del soppressore. In modelli murini di cancro della mammella metastatico, una popolazione distinta dei macrofagi caratterizzata come F4/80altaLy6G-CD11baltaLy6Cbasso si accumula nel polmone contenente i tumori metastatici. Questa popolazione del macrofago è raramente trovata nel polmone normale e così chiamata macrofagi associati a metastasi (MAMs)10. In questi modelli di mouse, un altro mieloide cellule popolazione, definita come F4/80altaLy6G-CD11baltaLy6Calta, inoltre si accumula principalmente nel polmone metastatico dove dà luogo a muia11. Base alle loro caratteristiche, il CD11baltaLy6Calta MAM cellule progenitrici potrebbero rappresentare M-MDSC12.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin EDTA (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Freiner Bio-One</td>
			<td>665-180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL Plystyrene Round-Bottom Tube</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Cell Culture Plate (Round Bottom )</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3799</td>
			<td>Co-culture of CD8+T cells with sorted myeloid cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate (Flat bottom)</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>165305</td>
			<td>Co-culture of CD8+T cells with target cells for cytotoxicity assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF647 anti-mouse F4/80 Antibody</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>MCA497A647</td>
			<td>Clone: CIA3-1, Lot#: 1707, 2 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor700 anti-mouse CD8 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100730</td>
			<td>Clone: 53-6.7, Lot#: B205738, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD28 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102111</td>
			<td>Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 37.51, Lot#: B256340</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD3e Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100314</td>
			<td>Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 145-2C11, Lot#: B233720</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD3 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100236</td>
			<td>Clone: 17A2, Lot#: B198730, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cy7 anti-mouse Ly6C Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>128026</td>
			<td>Clone: HK1.4, Lot#: B248351, 1 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albmin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1470-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer (100&#956;m Nylon)</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352360</td>
			<td>To smash the spleen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer (40&#956;m Nylon)</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352340</td>
			<td>To filter the lung digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>422801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8242;s Modified Eagle&#8242;s Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>19853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse CD4 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100406</td>
			<td>Clone: GK1.5, Lot#: B179194, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex Ready-to-Use</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1596-01</td>
			<td>Coating the 96-well plates for cytotoxicity assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte NucLight Red Lentivirus Reagent</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>4476</td>
			<td>Lenti viral particules encoding mKate2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte ZOOM</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td></td>
			<td>Detector (fluorescence microscope)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte ZOOM 2018A</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td></td>
			<td>Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2916801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lung Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-095-927</td>
			<td>Preparation of single cell suspension from the tumor-bearing lung</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MycoAlert Mycoplasma Detection Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>LT07-318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acid (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucView488</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>10403</td>
			<td>Fluoregenic caspase-3 substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse Ly6G Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>127607</td>
			<td>Clone: 1A8, Lot#: B258704, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 anti-mouse CD11b Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101216</td>
			<td>Clone: M1/70, Lot#: B249268, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Penicillin Streptomycin for primary culture of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103132</td>
			<td>Clone: 30-F11, Lot#: B249564, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene (Hexadimethrine bromide)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis Buffer (10X)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine IL-2</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>212-12</td>
			<td>Activation of isolated CD8+ T cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruStain fcX (anti-mouse CD16/32) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>&#160;: Nikon 10X objective (resolution 1.22 &#181;m) 
			&#160;: Green channel excitation: 440 - 480 nm 
			&#160;: Green channel emission: 504 - 544 nm 
			&#160;: Red channel excitation: 565-605 nm 
			&#160;: Red channel emission: 625 - 705 nm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real time detection of in vitro tumor cell apoptosis induced by cd8+ t cells to study immune suppressive functions of tumor-infiltrating myeloid cells

Potenziamento della capacità di tumore-uccisione di CD8+ T cellule nei tumori, insieme a loro infiltrazione del tumore efficiente, è un elemento chiave del successo immunoterapie. Diversi studi hanno indicato che le cellule mieloidi di infiltrazione del tumore (ad es., cellule mieloidi-derivato del soppressore (MDSC) e macrofagi associati al tumore (TAM)) sopprimono citotossicità di CD8+ T cellule nel microambiente tumorale e quello di targeting Queste cellule mieloidi normative possono migliorare immunoterapie. Qui, presentiamo un sistema di analisi in vitro per valutare gli effetti soppressivi immuni di monocytic MDSC e TAMs sulla capacità di tumore-uccisione di CD8+ T cellule. A tal fine, abbiamo coltivato prima ingenuo splenica CD8+ T cellule con anticorpi attivanti anti-CD3/CD28 in presenza o in assenza di cellule del soppressore e poi co-coltivate le cellule T pre-attivate con cellule tumorali bersaglio in presenza di un fluorogenici substrato di caspase-3. Fluorescenza dal substrato in cellule di cancro è stato rilevato da microscopia di fluorescenza in tempo reale come indicatore di apoptosi delle cellule di T-cellula indotta da tumore. In questa analisi, possiamo rilevare con successo l'aumento di apoptosi delle cellule del tumore di CD8+ T cellule e la sua soppressione dalla pre-cultura con TAMs o MDSC. Questo saggio funzionale è utile per investigare CD8+ T cell meccanismi di soppressione di cellule mieloidi regolatorie e identificazione bersagli per superarla tramite screening su vasta scala.

Questo metodo si basa sulla semplice co-coltura delle cellule di cancro del bersaglio con effettrici CD8+ T cellule che sono state pre-coltivate con o senza cellule del soppressore in presenza di anticorpi attivanti anti-CD3/CD28. Rileva CD8+ apoptosi cellulare indotta da cellule T del cancro nel tempo dopo co-coltura, permettendo così la valutazione degli effetti delle cellule del soppressore su citotossicità di CD8+ T cellule.
In genere, le cellule tumorali aumentano la fluorescenza verde nei loro nuclei dopo l'attivazione di un biosensore di caspase nucleare-targeting quando queste cellule mettersi in contatto con CD8+ T cellule che sono pre-attivato dagli anticorpi in assenza di celle (soppressore Figura 3; Film supplementare 1). Fluorescenza verde dal substrato caspase era rilevabile per almeno 15 h dopo l'apoptosi è stata iniziata. Alcuni apoptosi spontanea di effettrici CD8+ T cellule inoltre è stata osservata nel corso del tempo, anche se queste cellule sono state coltivate in isolamento (Figura 4; Film supplementare 2). Tuttavia, dimensioni di nuclei di CD8+ T cellule sono più piccole rispetto a quelle delle cellule tumorali e così cellule apoptotiche 'effettrici' possono essere esclusi dalla apoptotic cell 'target' conta con un metodo di analisi di dimensione limitazione immagine (Figura 2 e Figura 4). Anche se alcune cellule tumorali bersaglio mostrano una piccola forma arrotondata senza fluorescenza verde, ciò non pregiudica l'analisi come queste cellule sono in fase di mitosi piuttosto che apoptosi (complementare Movie 3) e quindi sono escluse dal apoptotica 'target' conta delle cellule da una maschera di sovrapposizione di rosso/verde (complementare figura 2). Apoptosi spontanea delle cellule tumorali bersaglio occasionalmente sono trovato anche nella cultura singola (complementare Movie 3). Tuttavia, la co-cultura di cancro di destinazione le celle con pre-attivato CD8+ T cellule apoptosi delle cellule del tumore aumentato sopra i livelli di apoptosi spontanea in monocoltura delle cellule tumorali (Figura 4). In genere, quando si utilizza un rapporto ottimale di cellule tumorali bersaglio per le cellule effettrici, un picco del numero delle cellule apoptotiche destinazione cancro può essere osservato (Figura 5A). Questo picco è più distinto, quando i dati sono espressi come la frazione di apoptotic della popolazione delle cellule bersaglio (figura 5B). In questo esperimento l'apoptosi basale delle cellule del tumore di destinazione ha alzato a 24 h (con frazione di apoptotic = 0,08), ma CD8+ apoptosi indotta da cellula di T ha raggiunto un livello massimo a 17 h (con frazione apoptotica = 0,66).
Più ulteriormente abbiamo trovato che CD8+ T cellule pre-incubate con MAMs o M-MDSC potrebbero fare contatto con cellule tumorali bersaglio ma questo contatto sembrava per provocare meno casi di apoptosi delle cellule di cancro rispetto ai CD8+ T cellule pre-attivato senza cellule del soppressore (Figura 3 e Figura 4; Film supplementare 4 e complementare 5). Anche se il CD8+ T cellule pre-incubate con le cellule mieloidi occasionalmente indotto apoptosi delle cellule di cancro, c'era anche qualche proliferazione delle cellule tumorali di destinazione che non sono stati stimolati all'apoptosi nel corso del tempo il esperimento (complementare Movie 6). Coerentemente con questi risultati, la frazione di picco delle cellule tumorali apoptotiche coltivate con CD8+ T cellule pre-incubate con cellule mieloidi (frazione di apoptotic = 0,38 a 23 h per MDSC-E e 0.25 a 20 h per MAM-E) era significativamente inferiore a quello delle cellule tumorali coltivate con CD8+ T cellule che non erano pre-incubate con le cellule del soppressore (Figura 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig1.jpg"> Figura 1: uno schema che mostra la procedura sperimentale. Ingenuo splenica CD8+ T le cellule sono coltivate con anticorpi attivanti anti-CD3/CD28 con o senza macrofagi associati a metastasi (MAMs) o cellule suppressor monocytic-mieloide-derivati (M-MDSC). Dopo 4 giorni, galleggiante CD8+ T cellule vengono raccolti e co-coltivate con le cellule tumorali bersaglio in presenza di substrato fluorogenico caspase-3. Cellule tumorali apoptotiche vengono rilevate nell'ambito di microscopia di fluorescenza in tempo reale. Le immagini sono state acquisite utilizzando una piattaforma live cell imaging (vedere Tabella materiali). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig2.jpg"> Figura 2: identificazione delle cellule apoptotiche di destinazione distinte da cellule effettrici apoptotiche. Acquisizione immagine: riga in alto nel canale rosso permette l'identificazione dei nuclei delle cellule bersaglio di maschera di rilevazione di destinazione (maschera rosa analisi). Riga centrale: immagini acquisite nel verde del canale indicano le cellule effettrici e destinazione apoptotiche. State limitate apoptosi maschera (maschera di analisi teal; maggiore di 80 µm2) permette singolo apoptotic cellule effettrici devono essere esclusi dall'analisi. Riga inferiore: composito immagini unita rosso e verde canali con immagine di contrasto di fase (a sinistra) o rosso/verde si sovrappongono maschera (a destra). Identificazione della fluorescenza verde co-localizzata, con dimensioni limitate con fluorescenza rossa (maschera giallo analisi), consente maggiore accuratezza nel rilevamento di apoptotic nuclei di destinazione (freccia gialla) escludendo gli aggregati di cellule effettrici apoptotica (bianco punte di freccia). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig3.jpg"> Figura 3: Interazione tra CD8+ T cellule e le cellule tumorali. Stills da filmati time-lapse rappresentativi delle cellule bersaglio E0771-LG_NLR (T) co-coltivate con effettrici CD8+ T cellule (E) con rapporto 4:1 dell'effettore/obiettivo. MDSC-E e MAM-E indicare le cellule effettrici pre-incubate con M-MDSC e MAMs rispettivamente. Immagini composite (incluse le immagini da canali di contrasto, rosso e verde di fase) sono mostrati. Punte di freccia sono tracking le stesse cellule attraverso i diversi campi e intervalli di tempo. Giallo di punte di freccia: un obiettivo che associa gli effettori e subisce le punte di freccia di apoptosi, bianco: una destinazione che associa gli effettori ma non andare incontro ad apoptosi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig4.jpg"> Figura 4: rilevazione delle cellule tumorali apoptotiche. Rappresentante campi estratti da filmati time-lapse a 18 h dopo formazione immagine. Immagini composite (sinistra; canali di contrasto, rosso e verde di fase) e immagini dal rosso canale senza (al centro) o con sovrapposizione (a destra) rosso/verde maschera (giallo) sono indicati. Punti gialli nella colonna di destra rappresentano cellule tumorali apoptotiche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig5.jpg"> Figura 5: CD8+ apoptosi cellulare indotta da cellule T del cancro. (A) numero di cellule tumorali apoptotiche coltivate con effettore C8+ T cellule alle diverse realizzatore al rapporto di destinazione (E:T). apoptotica (B) frazione della popolazione delle cellule bersaglio. Dati sono mezzi ± SD. Mean area sotto la curva (AUC) è inoltre indicato. Spaiati t-test con correzione di Welch è stato utilizzato per analizzare l'AUC. * P < 0,0001 rispetto a t = 0:1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig6.jpg"> Figura 6: Effetti di tumore-infiltrazione di cellule mieloidi su citotossicità di CD8+ T cellule. (A) numero di cellule tumorali apoptotiche (destinazione: T) coltivate con C8+ T cellule (effettrici: E) a 4:1 di rapporto di E:T. CD8+ T cellule pre-sono state coltivate in assenza (cerchio nero) o in presenza di cellule monocytic-mieloide-derivati del soppressore (MDSC-e: blu cerchio) o macrofagi associati a metastasi (MAM-e: cerchio rosso). Dati sono mezzi ± SD. (B) apoptotica frazione della popolazione delle cellule bersaglio. Dati sono mezzi ± SD. dire AUC è anche mostrato. Spaiati t-test con correzione di Welch è stato utilizzato per analizzare l'AUC. * P < 0,0001 rispetto a T, #P < 0,0001 rispetto a E + T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Complementare figura 1. Strategia di gating per isolare cellule del soppressore dal polmone metastatico. (A) rappresentante dot trame isolare cellule monocytic soppressore mieloidi-derivato (M-MDSC) e macrofagi associati a metastasi (MAMs). La soglia del livello di Ly6C per distinguere MAMs (Ly6Cbasso) e M-MDSC (Ly6Calta) è basata su quella di macrofagi alveolari residenti (RMAC). (B) purezza dei M-MDSC ordinato (CD45+Ly6G–CD11b+Ly6Calta) e MAMs (CD45+Ly6G–CD11b+Ly6Cbasso). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/FigureS1_Rvd.pdf">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
Complementare nella figura 2. Immagini rappresentative delle cellule bersaglio mitotica. Stills dal rappresentante filmati time-lapse di mono-coltura cellulare di destinazione E0771-LG_NLR. In alto: immagini composite comprese le immagini da canali di contrasto, rosso e verde di fase. In basso: immagini composite (canali rosso e verde) con maschera di sovrapposizione di rosso/verde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/FigureS2_Rvd.pdf">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
Complementare nella figura 3. Gli effetti di tumore-infiltrazione di cellule mieloidi sulla proliferazione di CD8+ cellule di T. (A) rappresentante istogrammi risultati diluizione di etichettatura fluorescente con CFSE in CD8+ T cellule. Ingenuo splenica CD8+ T cellule erano isolate come descritto nel protocollo-3 ed etichettate con 5 µM di CFSE a 37 ° C per 15 min. Le cellule di T con etichettate erano coltivate in presenza di IL-2 e anti-CD3/CD28 attivando anticorpi con o senza cellule mieloidi come descritto nel protocollo n. 4. Dopo 4 giorni, è stato rilevato in cellule di T di fluorescenza verde citometro a flusso. (B) indice di divisione di CD8+ T celle calcolate come descritto in precedenza17. Dati sono mezzi ± SEM. * P < 0.01 rispetto al controllo, #P < 0,05 rispetto al αCD3/CD28 ab. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/FigureS3_Rvd.pdf">per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
Film supplementare 1. Film di figure 3 e 4; E + T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS1.mp4">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
Film supplementare 2. Film di figure 3 e 4; Effettrici (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS2.mp4">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
Complementare film 3. Film di figure 3 e 4; Destinazione (T). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS3.mp4">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
Complementare Movie 4. Film di figure 3 e 4; MDSC-E + T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS4.mp4">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
Film supplementare 5. Film di figure 3 e 4; MAM-E + T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS5.mp4">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
Complementare film 6. Film di figure 3 e 4; MAM-E + T (proliferazione). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS6.mp4">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells at JoVE

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Descriviamo qui un protocollo per studiare la citotossicità di pre-attivato CD8+ T cellule contro le cellule tumorali dalla rilevazione apoptotic microscopia del cancro cellule via in tempo reale. Questo protocollo può studiare i meccanismi dietro la soppressione delle cellule T indotta da cellula mieloide e valutare composti puntati replenishing T cellule tramite blocco delle cellule mieloidi soppressive immuni.

Rilevazione in tempo reale nell'apoptosi delle cellule tumorali in Vitro indotta da CD8+ T cellule per studiare funzioni immuni soppressive di tumore-infiltrazione di cellule mieloidi

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Il nostro protocollo valuta gli effetti delle cellule soppressori derivate dal mieloide e dei macrofagi associati al tumore nell'apoptosi delle cellule tumorali indotte da cellule T. Accanto all'indagine dei meccanismi sottostanti dei potenziali interventi terapeutici. Questo protocollo valuta direttamente l'apoptosi delle cellule tumorali indotte da cellule T ad alta sensibilità e consente l'analisi longitudinale e l'imaging delle interazioni da cellula a cellula.L'efficacia dell'inibitore del checkpoint è meglio esaminata dalle cellule mieloidi che si infiltrano nel tumore in alcuni tipi di tumore. Questa tecnica potrebbe portare all'identificazione di nuove terapie per questi tumori. Questo metodo potrebbe non solo far progredire la ricerca sull'immunologia del cancro, ma potrebbe anche fornire informazioni sull'immunodeficienza e sulle malattie autoimmuni.Per l'attivazione e l'espansione di cellule T CD8-positive isolate con milza, prima aliquota uno per 10 alla quinta T-celle CD8-positive in 50 microlitri di E-DMEM in singoli pozzi di una piastra inferiore a U da 96 porri. Successivamente, aggiungere uno per 10 alla quinta cellule soppressore in 50 microlitri di E-DMEM, o 50 microlitri di E-DMEM da soli, in ogni pozzo di cellule T. Aggiungere quindi 50 microlitri di mezzo di attivazione appena preparato e 50 microlitri di E-DMEM, con o senza i reagenti di prova di interesse, ai pozzi appropriati.E posizionare la piastra in un incubatore di anidride carbonica di 37 gradi Celsius e 5% con il 95% di umidità per quattro giorni. Per impostare una co-coltura di cellule bersaglio a cellule T cd8 positiva pre-attivata, aggiungere prima 30 microlitri di matrice di membrana basale solubile ridotta del fattore di crescita diluito da 1 a 100 ai pozzi appropriati di una piastra a fondo piatto da 96 po ', adatta per la microscopia. Agitare la piastra per stendere la matrice in modo uniforme e posizionare la piastra nell'incubatore di coltura cellulare per almeno un'ora.Mentre la piastra è equilibrante, preparare le cellule bersaglio. Aspirare il mezzo, lavare con PBS e aggiungere un millilitro di 05%Tripina-EDTA a temperatura ambiente per un minuto. Aggiungere nove millilitri di DMEM integrati con siero bovino fetale mediante pipettazione delicata e trasferire le cellule dissociate in tubi.Dopo aver centrifugato le celle, rimorsi il pallet in 500 microlitri di E-DMEM. Filtrare le celle rimorsiate attraverso un filtro cella e contare le celle vive. Quindi regolare la densità a quattro volte 10 alla quarta cellule bersaglio per millilitro in E-DMEM fresco sul ghiaccio.Successivamente, pipettare le cellule T CD8-positive pre-attivate alcune volte per rimosorne le cellule in una singola sospensione cellulare e trasferire le cellule T galleggianti in un tubo da 1,5 millilitri per condizione. Raccogliere tutte le celle rimanenti con 200 microlitri di PBS per pozzo, trasferire i lavaggi nei tubi appropriati da 1,5 millilitri e centrifugare. Aspirare il mezzo e aggiungere un millilitro di E-DMEM a ciascun tubo per la centrifugazione.Dopo la centrifugazione, resuspend i pellet in 100 microlitri di E-DMEM fresco per tubo. Dopo il conteggio, regolare le celle in ogni tubo ad una densità di 1,6 volte 10 alla quinta T-cellule CD8 positiva preattivata per millilitro di mezzo, e posizionare le cellule sul ghiaccio. Quando le cellule sono pronte, aspirare la matrice della membrana basale da ogni pozzo della piastra di microscopia a 96 po 'e aggiungere 50 microlitri di cellule bersaglio ai singoli pozzi all'interno dei 60 pozzi interni della piastra con miscelazione.Aggiungere 25 microlitri di E-DMEM integrati con quattro volte 10 alle terze unità per millilitro di IL2 e 10-micromolare fluorogenico caspasi-3 substrato ai pozzi appropriati. Quindi aggiungere 25 microlitri di cellule T CD8-positive preattivate ai pozzi appropriati. Infine, aggiungere E-DMEM ai pozzi appropriati per realizzare un volume totale fino a 100 microlitri.Aggiungere 200 microlitri di PBS o acqua sterile in tutti i pozzi vuoti. Agitare la piastra e lasciare la piastra su una superficie piana per 10 minuti. Per immagini le celle, impostare il microscopio per acquisire immagini in contrasto di fase.Così come i canali di fluorescenza adatti alla proteina fluorescente a restrizioni nucleari e i fluorofori del substrato fluorogenico attivato caspasi-3 utilizzati nell'esperimento. Quindi cattura le immagini di ogni pozzo sperimentale in contrasto di fase e i due canali di fluorescenza ogni una o tre ore per almeno 72 ore. Per analizzare le immagini acquisite, aprire un'immagine da un pozzo di controllo contenente solo cellule bersaglio e mezzo senza substrato caspasi-3 nel canale di fluorescenza utilizzato per il segnale del substrato.Osservare se i nuclei emettono un segnale di fluorescenza inappropriato. Se il segnale del substrato è evidente all'interno dei nuclei, utilizzare l'unmixing spettrale per aumentare la percentuale di segnale del substrato rimosso dal segnale dei nuclei, fino a quando il segnale del substrato scompare. Successivamente, visualizzare un pozzo di controllo contenente solo nuclei di cellule dell'effettore non etichettate in mezzo senza substrato di caspasi-3 nei due canali di fluorescenza singolarmente.Osservare se un segnale viene emesso dai nuclei. Se nei singoli canali non è presente alcun segnale, non è necessaria alcuna unmixing spettrale. Per risolvere gli oggetti fluorescenti in entrambi i canali di fluorescenza, utilizzare un metodo di sottrazione di fondo a fluorescenza con parametri rilevanti per il campione e i parametri appropriati per la divisione dei bordi.Utilizzare immagini della monocoltura cellulare bersaglio per stabilire parametri per la fluorescenza nucleare delle cellule bersaglio. Utilizzare immagini della monocoltura delle cellule dell'effettore per stabilire parametri per la fluorescenza nucleare apoptotica indotta dal substrato. Utilizzare immagini di co-coltura per verificare o perfezionare i parametri per la fluorescenza nucleare apoptotica indotta dal substrato nelle cellule bersaglio.Per determinare la dimensione minima dei nuclei bersaglio, utilizzare immagini nel canale del segnale dei nuclei dai pozzi contenenti solo cellule bersaglio con substrato caspasi. Per determinare la dimensione media dei nuclei dell'effettore apoptotico, utilizzare immagini nel canale del segnale del substrato dai pozzi contenenti solo cellule effettori con substrato caspasi. Per contare il numero di nuclei cellulari bersaglio a fluorescenza, impostare una procedura di analisi utilizzando un'appropriata limitazione delle dimensioni minime.Utilizzando immagini monocoltura di cellule effettori, impostare una seconda procedura di analisi per contare il numero di nuclei apoptotici più grandi della dimensione media dei nuclei dell'effettore apoptotico. Quindi impostare una terza procedura di analisi per contare il numero di cellule bersaglio apoptotiche contando il numero di nuclei in cui il segnale del nucleo e il segnale del substrato limitato dalle dimensioni co-localizzano in modo significativo. Tipicamente, le cellule tumorali aumentano il segnale di fluorescenza nei loro nuclei in seguito all'attivazione di un biosensore di caspasi nucleare quando le cellule vengono a contatto con cellule T cd8-positive pre-attivate dagli anticorpi in assenza di cellule soppressori.Le dimensioni del nucleo delle cellule T positive al CD8 sono più piccole di quelle delle cellule tumorali. Pertanto, le cellule effettore apoptotiche possono essere escluse dal conteggio delle celle di destinazione apoptotiche con un metodo di analisi dell'immagine di restrizione delle dimensioni. Sebbene alcune cellule tumorali bersaglio mostrino una piccola forma arrotondata senza fluorescenza del substrato, ciò non influisce sull'analisi.Poiché queste cellule sono sottoposte a mitosi piuttosto che apoptosi e quindi sono escluse dal conteggio delle cellule bersaglio apoptotiche da una maschera di sovrapposizione del segnale del substrato nucleare. La co-coltura delle cellule tumorali bersaglio con cellule T CD8 positive preattivate aumenta l'apoptosi delle cellule tumorali al di sopra dei livelli di apoptosi spontanea nelle monocolture delle cellule tumorali. Generalmente, quando si utilizza un rapporto ottimale tra le cellule tumorali bersaglio e le cellule di effettore, si può osservare un picco nel numero di cellule tumorali bersaglio apoptotiche.Questo picco diventa più distinto quando i dati sono espressi come frazione apoptotica della popolazione di cellule bersaglio. La cosa più importante da ricordare quando si tenta questo protocollo è quello di impostare monocolture di cellule bersaglio e monocolture di cellule effettori da utilizzare nello sviluppo delle maschere di analisi. Questo metodo può fornire informazioni sulla durata e la frequenza delle interazioni tra cellule T e cellule tumorali e sulle condizioni associate alla citotossicità gene-dipendente sia nelle cellule umane che in quello del topo.Attualmente stiamo sviluppando questo test in uno schermo ad alta produttività utilizzando cellule umane per identificare composti che inibiscono l'immunosoppressione mediata da cellule mieloidi e quindi migliorano l'efficacia dell'inibitore del checkpoint.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging dei linfociti T CD8 residente nel tumore del polmone umano mediante microscopia confocale a fette

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

Rilevamento del potenziale di membrana di mitocondri per studiare CLIC4 HN4 Knockdown-indotta delle cellule apoptosi In Vitro

Depletion of the mitochondrial membrane potential (MMP, &#916;&#936;m) is considered the earliest event in the apoptotic cascade. It even occurs ahead of ...

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Protocollo di isolamento del Mouse cellule dentritiche monocito-derivate e loro attivazione successiva In Vitro con tumore immunocomplessi

Dendritic cells (DC) are heterogeneous cell populations that differ in their cell membrane markers, migration patterns and distribution, and in their ...

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

Flusso Cytometric Detection neonata al seno cancro cellule staminali-come delle cellule dopo l'inversione di apoptosi

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

Intramucosal Inoculation of Squamous Cell Carcinoma Cells in Mice for Tumor Immune Profiling and Treatment Response Assessment

Intramucosa inoculazione delle cellule di Carcinoma di cellule Squamous nei topi per profilatura Immune tumore e valutazione della risposta di trattamento

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is a debilitating and deadly disease with a high prevalence of recurrence and treatment failure. To develop ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

In Vitro del tumore delle cellule Rechallenge per valutazione predittiva della funzione antitumorale chimerico antigene recettore delle cellule T

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

In Vitro Analisi per studiare l'interazione tumora-macrophage

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Utilizzo di cellule staminali pluripotenti indotte umane per la generazione di cellule T specifiche dell'antigene tumorale

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generazione di tumori pancreatici ortotopici e caratterizzazione ex vivo della citotossicità delle cellule T infiltranti di tumore

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

Misurazione della risposta dei farmaci in tempo reale nelle fette di tessuto tumorale organotipico

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...