Name: real time detection of in vitro tumor cell apoptosis induced by cd8+ t cells to study immune suppressive functions of tumor-infiltrating myeloid cells
Uploaded: 2019-01-29T12:30:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells at JoVE

この作品は、Wellcome の信頼 (101067/Z/13/Z (JWP)、109657/Z/15/Z (TK)、615KIT/J22738 (TK)、英国) と MRC (氏/N022556/1 (JWP、TK)、イギリス) からの助成金によって支えられました。NOC と DDS を認める国家表現型スクリーニング センター Phenomics 発見イニシアティブと癌研究イギリス (NOC) からのサポート

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著者が明らかに何もありません。

この手法は 2 つの別々 の共培養手順:+ T 細胞の潜在的なサプレッサー細胞と CD8 を共培養と共培養 '中古エアコン' CD8+ T 細胞と標的腫瘍細胞 (図 1)。共培養の最初のステップはかなり類似する CD8 の+ T 細胞増殖アッセイ CD8 サプレッサー細胞の影響を決定するために一般的に使用される+ T 細胞の機能。ただし、T 細胞の増殖では、彼らの細胞毒性と常に関連しません。たとえば、我々 は M MDSCs と MAMs 共同文化を発見した CD8 の増殖を減少ではなく増加+ T 細胞の CD3/CD28 抗体 (補足図 3) 活性化の存在下でこれらはあらかじめ CD8 をエアコンに対し+T 細胞はターゲット癌細胞 (図 4図 5図 6) に対して細胞毒性を減少を示した。これらの結果は、この CD8 によって提供されるターゲット癌細胞のアポトーシスによって立証される、機能の活動評価の重要性を強調+ T 細胞の細胞毒性の試金。
このアッセイのもとその CD8+ T 細胞 E0771 LG マウス乳腺腫瘍細胞 (図 5) の最大アポトーシスを誘導するために約 15 時間培養が必要です。この遅延は、エフェクター細胞に目標とそれに伴う免疫シナプス形成、カスパーゼ-3 (補足の映画 1 の活性化によって測定されるターゲットでアポトーシス シグナルを誘導するために必要な時間との最初の接触間のタイムラグが原因かもしれない).また腫瘍細胞のアポトーシスの数はおそらく T 細胞によるターゲットの排除、死んだ細胞からの蛍光信号の損失のため 24 時間後高原に達することがわかりました。最適な時点の決定はさまざまな条件の適切な比較のために重要なので、ピーク アポトーシスの時間を特定するこの機能はこの試金の主要な利点の 1 つです。今回は+ T の間コントロール CD8 細胞傷害の違いなど細胞および CD8 の MDSC/ママの教育がある+ T 細胞は 15-18 h 72 h (図 5) と比較して大きく、したがってエンドポイントは、72 時間の潜伏期間を使って試してみる誤解を招く結果となります。
このメソッドにより CD8 限られた毒性のメカニズムに深い洞察力を提供するリアルタイムのエフェクタ-ターゲット細胞の相互作用の可視化、また+ T 細胞は抑制性細胞でプレインキュベートしました。例えば、我々 はことを観察した CD8+ T M MDSCs または MAMs プレインキュベートした細胞発生と標的腫瘍細胞相互作用、アポトーシス (附則ムービー 4、附則ムービー 5 附則ムービー 6) を常に誘発しなかった。我々 は、このイベントを定量化しなかったが可能かつ定量化し、アポトーシス誘導との相関相互作用時間と出会いの割合を比較する興味深いでしょう。もう一つの大きな利点は、このメソッドが (例えば、1 x 103ターゲットの) と 4 x 103ウェルあたりのエフェクター細胞の細胞の数が少ないを必要とすることです。実際には、必要な場合は、384 ウェル プレート形式のこのプロトコルをさらに小型することができます。したがって、このアッセイなど体内からまたは生体サンプル ex 派生の in vitroテスト貴重な細胞を使用して細胞の数が限られている高スループット スクリーニングと実験に適しています。
その一方で、現在の試金の制限は、いくつかの条件で死んだエフェクター細胞の重要な番号の存在です。エフェクター CD8 のターゲット癌細胞のアポトーシスを区別するに精度を高めるために+ T 細胞、細胞が分類されるターゲットの核と核のデータ分析のため (エフェクター細胞を含まない) のサイズ制限が適用されます。試金 (図 2)。ただし、いくつかのインスタンスは、+ T (緑) アポトーシス CD8 の集計のオーバーレイが結果を混同するかもしれない非アポトーシス ターゲット癌細胞に細胞があります。この制限は、エフェクターとエフェクター細胞の十分な数が利用できると仮定して、標的腫瘍細胞共培養する前に細胞の死んだ細胞除去カラムを使用によって軽減することができます。複雑な顕微鏡システムとエフェクター CD8 をラベリングによって偽の肯定的な信号を減少させることがあります+ T 細胞蛍光体ターゲット細胞核および蛍光カスパーゼ 3 基板とは異なります。
これまでのところ、このプロトコルは CD8 抗原非特異的活性化を調査するため利用されている+ T 細胞。MDSCs と Tam 腫瘍微小環境における T 細胞機能を抑制する、抗原非特異的メカニズムを介して、末梢リンパ組織において MDSCs は、抗原特定の方法18T 細胞反応を抑制します。OT 1 から+ T 細胞のような携帯型の免疫抑制機能に CD8 を使用して生体外で増殖アッセイを調査するトランスジェニック マウスは一般的に使用されます。このアッセイで (卵白アルブミン (OVA) 特異的 T 細胞受容体を発現する) OT 1 T 細胞共培養している OVA ペプチドの存在下で抑制 MDSCs と私たちの細胞毒性の試金の最初の文化のために適当である (すなわち.、の細胞の活性化 T存在または抑制の不在)。また、OVA は、OT 1 T 細胞による抗原特異的癌細胞殺害を誘発することができますを表現する標的がん細胞を操作することは不可能です。したがって、アッセイも MAM/MDSC を介する抗原特異的 T 細胞の活性化抑制の調査を有効になります。また、人間の CD3 と CD28 に対する活性化抗体は、市販と臨床検体から人間の Tam を分離するためのプロトコルが確立された19をされている人間の細胞を調査するアッセイを適用することが可能です。
この試金をまとめて非常に汎用性は、他の免疫細胞型の細胞毒性を調べるために使用できます。現在、我々 のラボでそれが様々 な条件の下で抗原依存性細胞毒性を調べる拡張、スクリーニングも高スループットの開発中です。

知られているその CD8+ T のフルの細胞毒性を出すとき、細胞は腫瘍細胞をなくすことができます。T 細胞受容体 (TCR)、CD8 の活性化後+ T 細胞増殖し、細胞傷害性エフェクター細胞に分化します。展開と活性化 CD8+ T 細胞は、細胞傷害顆粒、パーフォリンが標的細胞へ転送され、カスパーゼ 3 を介したアポトーシス1など様々 な溶解経路を開始する granzymes などを分泌します。CD8+ T 細胞もアポトーシスを誘導する腫瘍細胞腫瘍壊死因子-α (TNF-α) の受容体などの標的細胞上の受容体を活性化して最初信号 ligand (FasL) または TNF 関連アポトーシス誘導リガンド (TRAIL)。さらに、活性化された CD8+ T 細胞分泌するインターフェロン-γ (IFN-γ) 腫瘍細胞増殖を抑制でき、cd8 陽性腫瘍細胞の感受性を高める+ T 細胞を介してのアップレギュレーション FasL 受容体1の。Cd8 陽性の可能性を考えると+ T 腫瘍殺害能力、(例えば、チェックポイント阻害剤、がん予防接種と養子伝キメラ抗原受容体 (車) 発現 T 細胞) の細胞毒性を後押しするいくつかの戦略が確立されています。癌2の特定の種類に示されている重要な治療効果。しかし、腫瘍浸潤の免疫が制御性 T 細胞など細胞、骨髄由来抑制細胞 (MDSCs)、腫瘍関連マクロファージ (Tam) が CD8 を抑制することができますを示唆証拠の蓄積+ T 細胞の機能と有効性を制限します。免疫療法の3,の4,5。このような免疫療法を改善するためにどのように免疫抑制細胞制限 CD8 を理解することが重要です+ T 細胞細胞毒性。CD8 の識別+ T 細胞抑制メカニズムとそれを克服する druggable ターゲットが必要になります開発および生体外の試金の活用。
ゴールド スタンダードは、CD8 を測定法+細胞毒性 T 細胞は CD8 によってターゲットから放射性プローブ (51Cr) のリリース細胞をクロム リリース試金は分離+ T 細胞、決定6。しかし、この試金は比較的低感度、高いバック グラウンド、早期アポトーシス イベント、有害ゴ ミ処理問題、および自動液体ハンドリングと検出をサポートする限られた互換性を検出できないことを含むいくつかの欠点スループットの高いアプリケーション。別の一般的な方法は、標的腫瘍細胞のアポトーシスがアネキシン V7のバインドによって検出される流れフローサイトメトリー解析です。このアッセイでは、7 の標的細胞でのアポトーシスに加えて、CD107a または CD69 の式によって示されるエフェクター細胞の活性化や 7 aminoactinomycin D (7 AAD) propidium ヨウ化 (PI) を使用してターゲット細胞死などの他のパラメーターを検出することが可能.ただし、この試金はクロム リリース アッセイに比べてサプレッサー細胞の数が多い必要があります。それはまた剥離、付着性細胞の分解を要求し、これは結果をバイアスすることができます。確かに、クロム リリースのアッセイまたはフローサイトメトリーアッセイ T 細胞機能に及ぼす影響抑制細胞を調査するため一般的に使用されません。代わりに、T 細胞にあらかじめロード蛍光染料 (例えば、CFSE) の希釈によって示される T 細胞増殖の測定は頻繁に CD8 の抑制を評価する使用+サプレッサー細胞による T 細胞機能。IFN-γ 産生 T 細胞の検出は、サプレッサー細胞の T 細胞活性化8,9に及ぼす影響を評価するための別の標準的な方法です。ただし、これらのアッセイの結果は必ずしも相関がない CD8 の能力を殺す目的セルに+ T 細胞。
サプレッサー細胞、転移性腫瘍、特にマクロファージの cd8 陽性の細胞毒性に及ぼす影響を評価するための代替機能アッセイをご紹介+ T 細胞。このメソッドは、cd8 陽性の細胞毒性を決定します+ T 細胞、腫瘍細胞のアポトーシスを検出することにより抗 CD3/CD28 活性化抗体の存在下で抑制性細胞の有無を事前に培養が蛍光のカスパーゼ 3 からの蛍光性によって示される微速度顕微鏡観察 (図 1) を自動基板6を使用しています。このプロトコルは、他の方法に比べていくつかの利点少数の細胞のみが必要ですし、感度が高い付着性腫瘍細胞死の検出を可能にし、リアルタイムのエフェクタ-ターゲット相互作用をイメージすることができます高スループット スクリーニングを受けやすいです。
このプロトコルでは転移関連付けられた大食細胞 (MAMs) およびその前駆細胞単球性-MDSCs (M MDSCs) マウスの転移性腫瘍から分離されたが、サプレッサー細胞として使用されます。転移性乳癌のマウス ・ モデル、マクロファージの明瞭な人口を特徴とする転移性腫瘍を含む肺に蓄積されます-CD11b高Ly6C低F4/80高Ly6G として。このマクロファージの人口は頻度の低い正常肺で発見し、こうして転移関連マクロファージ (MAMs)10と呼ばれます。これらのマウス モデルで別の骨髄性細胞母集団、定義として F4/80高Ly6G-CD11b高Ly6C高も主に蓄積 MAMs11に上昇を与えるそれ肺転移。彼らの特性に基づき、CD11b高Ly6C高MAM 前駆細胞が M MDSCs12あります。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin EDTA (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Freiner Bio-One</td>
			<td>665-180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL Plystyrene Round-Bottom Tube</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Cell Culture Plate (Round Bottom )</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3799</td>
			<td>Co-culture of CD8+T cells with sorted myeloid cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate (Flat bottom)</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>165305</td>
			<td>Co-culture of CD8+T cells with target cells for cytotoxicity assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF647 anti-mouse F4/80 Antibody</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>MCA497A647</td>
			<td>Clone: CIA3-1, Lot#: 1707, 2 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor700 anti-mouse CD8 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100730</td>
			<td>Clone: 53-6.7, Lot#: B205738, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD28 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102111</td>
			<td>Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 37.51, Lot#: B256340</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD3e Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100314</td>
			<td>Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 145-2C11, Lot#: B233720</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD3 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100236</td>
			<td>Clone: 17A2, Lot#: B198730, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cy7 anti-mouse Ly6C Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>128026</td>
			<td>Clone: HK1.4, Lot#: B248351, 1 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albmin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1470-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer (100&#956;m Nylon)</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352360</td>
			<td>To smash the spleen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer (40&#956;m Nylon)</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352340</td>
			<td>To filter the lung digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>422801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8242;s Modified Eagle&#8242;s Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>19853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse CD4 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100406</td>
			<td>Clone: GK1.5, Lot#: B179194, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex Ready-to-Use</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1596-01</td>
			<td>Coating the 96-well plates for cytotoxicity assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte NucLight Red Lentivirus Reagent</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>4476</td>
			<td>Lenti viral particules encoding mKate2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte ZOOM</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td></td>
			<td>Detector (fluorescence microscope)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte ZOOM 2018A</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td></td>
			<td>Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2916801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lung Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-095-927</td>
			<td>Preparation of single cell suspension from the tumor-bearing lung</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MycoAlert Mycoplasma Detection Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>LT07-318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acid (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucView488</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>10403</td>
			<td>Fluoregenic caspase-3 substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse Ly6G Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>127607</td>
			<td>Clone: 1A8, Lot#: B258704, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 anti-mouse CD11b Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101216</td>
			<td>Clone: M1/70, Lot#: B249268, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Penicillin Streptomycin for primary culture of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103132</td>
			<td>Clone: 30-F11, Lot#: B249564, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene (Hexadimethrine bromide)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis Buffer (10X)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine IL-2</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>212-12</td>
			<td>Activation of isolated CD8+ T cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruStain fcX (anti-mouse CD16/32) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>&#160;: Nikon 10X objective (resolution 1.22 &#181;m) 
			&#160;: Green channel excitation: 440 - 480 nm 
			&#160;: Green channel emission: 504 - 544 nm 
			&#160;: Red channel excitation: 565-605 nm 
			&#160;: Red channel emission: 625 - 705 nm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real time detection of in vitro tumor cell apoptosis induced by cd8+ t cells to study immune suppressive functions of tumor-infiltrating myeloid cells

Cd8 陽性の腫瘍を殺す能力の増強+ T と共に、効率的な腫瘍浸潤、腫瘍細胞は免疫療法の成功の重要な要素です。いくつかの研究は、腫瘍浸潤骨髄性細胞 (骨髄由来抑制細胞 (MDSCs) と腫瘍関連マクロファージ (Tam) など) は、cd8 陽性の細胞毒性を抑制することが示されている+ T 細胞腫瘍微小環境とそのターゲットこれらの規制の骨髄細胞は、免疫療法を改善できます。Cd8 陽性の腫瘍を殺す能力単球 MDSCs と Tam の免疫抑制効果を評価するための in vitro アッセイ システムを提案するここでは、+ T 細胞。このためには、まず素朴な培養を行った脾 CD8+ T サプレッサー細胞の存在の有無で抗 CD3/CD28 活性化抗体と細胞し、蛍光の存在下でターゲット癌細胞と活性化 T 細胞を共培養カスパーゼ 3 基板。がん細胞における基板から蛍光が T 細胞による腫瘍細胞のアポトーシスの指標としてリアルタイム蛍光顕微鏡で検出されました。この分析では、我々 は正常に CD8 によって腫瘍細胞のアポトーシスの増加を検出できます+ T 細胞と Tam または MDSCs と前培養による抑制。この機能の試金は CD8 を調査するために有用な+ T 細胞骨髄性と高スループット スクリーニングを介してそれを克服するために識別 druggable ターゲットによって抑制機構を細胞します。

この手法はターゲット癌細胞エフェクター CD8 と+ T の単純な培養抗 CD3/CD28 活性化抗体の存在下で抑制性細胞の有無事前培養されている細胞。CD8 が検出された+共培養、cd8 陽性の細胞障害作用に対する抑制性細胞の効果の評価ができ、時間の経過と共に T 細胞による癌細胞アポトーシス誘導+ T 細胞。
通常、がん細胞を増やす、原子核緑の蛍光性核ターゲットのカスパーゼ バイオ センサーのアクティブ化後これらの細胞は CD8 との接触を作るとき+ T 細胞をサプレッサー細胞 (不在で抗体による事前ライセンス認証図 3;附則ムービー 1)。アポトーシスが開始された後、少なくとも 15 時間のカスパーゼ基板から緑色蛍光ができた。いくつか自発的アポトーシス+ T エフェクター cd8 陽性の細胞が認められた時間をかけてこれらの細胞は分離 (図 4; で培養した場合でも附則ムービー 2)。ただし、CD8 の核サイズ+ T 細胞はがん細胞よりも小さく、サイズ制限画像解析法 (図 2と図 4) によるアポトーシス 'ターゲット' 細胞数からアポトーシス 'エフェクター' 細胞を除外できます従って。分析はこれらの細胞はアポトーシス (附則ムービー 3) よりもむしろ細胞分裂を行っている、従ってアポトーシス 'ターゲット' から除外されます、この影響しませんターゲット癌細胞は蛍光グリーンのない小さな丸みを帯びた形状を表示、赤/緑重複マスク (補足図 2) によってセルをカウントします。ターゲット癌細胞の自発的アポトーシスは単一文化 (附則ムービー 3) でも時折あります。ただし、対象となるガンの共培養細胞活性化 CD8+ T 細胞のがん細胞 (図 4) の単作で自発的アポトーシスの水準を超える増加腫瘍細胞のアポトーシス。一般的には、エフェクター細胞にがん細胞を標的の最適な比率を使用して、アポトーシス ターゲット癌細胞数のピークが見られる (図 5 a)。このピークはより明確なデータが (図 5 b) ターゲット細胞のアポトーシスの割合として表される場合です。この実験で標的腫瘍細胞の基底のアポトーシスは 24 h でピーク (アポトーシスの割合 = 0.08)、CD8 が 17 h で最大レベルに達した+ T 細胞によるアポトーシスの誘導 (アポトーシスの割合 = 0.66)。
我々 はさらに発見した CD8+ T MAMs と M MDSCs プレインキュベートした細胞を作ることができる標的がん細胞との接触が、この連絡先は CD8 と比較してがん細胞のアポトーシスの少ないインスタンスに見えた+ T なし事前活性化細胞サプレッサー細胞 (図 3および図 4;附則ムービー 4、附則ムービー 5)。ただし CD8+ T 事前時折骨髄細胞と培養細胞による癌細胞アポトーシス誘導、またいくつかの時間中にアポトーシスを受けるに刺激されてがないターゲット癌細胞増殖があった、実験 (附則ムービー 6)。これらの知見と一致して、がん細胞のアポトーシスのピーク画分培養 CD8+ T 細胞は、骨髄系細胞でプレインキュベートした (アポトーシスの割合 23 h で 0.38 MDSC E と 20 h で 0.25 MAM e =) がん細胞よりも有意に低かったCD8 培養+ T 細胞の抑制性細胞 (図 6) でなかった。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig1.jpg"> 図 1: 実験手順を示す図。素朴な脾 CD8+ T 抗 CD3/CD28 活性化抗体転移関連マクロファージ (MAMs) の有無で培養される細胞や単球性-骨髄由来抑制細胞 (M MDSCs)。CD8 をフローティング 4 日後+ T 細胞の収集し、出来るカスパーゼ 3 蛍光基質の存在下でターゲット癌細胞と共培養します。がん細胞のアポトーシスは、リアルタイム蛍光顕微鏡下で検出されます。示されている画像は、生きている細胞イメージング プラットフォームを使用して取得した (資料の表を参照)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig2.jpg"> 図 2: エフェクター細胞のアポトーシスとは異なるターゲット細胞のアポトーシスの Id 。赤のチャンネルのトップ行: 画像の取得によりターゲット検出マスク (ピンク解析マスク)、ターゲット細胞核の識別。中段: 緑のチャンネルで画像エフェクタとターゲット細胞のアポトーシスを示します。サイズ制限されたアポトーシス マスク (ティール解析マスク; 80 μ m2以上) により、単一のアポトーシス解析から除外するエフェクター細胞。最下行: 複合画像結合の赤、位相コントラスト (左) または赤/緑と緑のチャンネル重複マスク (右)。赤い蛍光性 (黄色解析マスク) と共局在、サイズが制限された緑の蛍光性の同定により、アポトーシスのより正確な検出はエフェクター細胞のアポトーシス (白の集計を除外することによって標的核 (黄色の矢印)矢印)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig3.jpg"> 図 3: 相互作用 CD8+ T 細胞と癌細胞。エフェクター CD8 と共同培養されたターゲット E0771 LG_NLR 細胞 (T) の代表的なコマ撮りムービーから静止画+ T 細胞 (E) エフェクター/ターゲット 4:1 の比率で。MDSC E と MAM E は、エフェクター細胞プレインキュベートした M MDSCs と MAMs それぞれを示します。合成画像 (位相コントラスト、赤と緑のチャンネルからイメージを含む) が表示されます。矢印を同じセル異なるフィールドと時間点 ~ 追跡します。黄色の矢印: エフェクターに関連付けます、アポトーシス、白い矢印を受けるターゲット: ターゲットをエフェクターに関連付けますが、アポトーシスを起こしません。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig4.jpg"> 図 4: 癌細胞のアポトーシスの検出。イメージング後 18 時間でコマ撮りムービーから抽出した代表的なフィールド。合成画像 (左; 位相コントラスト、赤と緑のチャンネル) と赤から画像なし (中央) チャネルまたは赤/緑 (右) 重複マスク (黄色) が表示されます。右の列に黄色のドットは、がん細胞のアポトーシスを表します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig5.jpg"> 図 5: CD8+ T 細胞による癌細胞アポトーシス誘導。(A) の数アポトーシスの癌細胞エフェクター C8 と+ T 細胞ターゲットの比率 (E:T) に異なるエフェクターで。 ターゲット セル人口の (B) アポトーシスの割合。データは、平均 ± 曲線 (AUC) 下の SD 平均面積も表示されます。対になっていないt-ウェルチの補正とテストは、AUC を分析に使用されました。* P < E:T に比べて 0.0001 = 0:1。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig6.jpg"> 図 6: cd8 陽性の細胞毒性に及ぼす骨髄細胞の腫瘍浸潤+ T 細胞。(A) がんのアポトーシス細胞数 (対象: T) C8 で培養された+ T 細胞 (エフェクター: E) E:T 比 4:1 で。CD8+ T 細胞を単球性-骨髄由来抑制細胞の液体 (黒丸) の有無で培養済み (MDSC e: 青円) または大食細胞の転移関連 (MAM e: 赤い円)。データは、平均 ± SD. (B) アポトーシス ターゲット セル人口の。データは、平均 ± SD. 意味 AUC を示します。対になっていないt-ウェルチの補正とテストは、AUC を分析に使用されました。* P < 0.0001 に比べて T のみ、 #P < 0.0001 E + T に比べると<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
補足図 1。肺転移からサプレッサー細胞を分離するための戦略をゲートします。(A) 代表的なドット プロット単球性骨髄由来抑制細胞 (M MDSCs) と転移関連マクロファージ (MAMs) を分離します。MAMs (Ly6C低) と M-MDSCs (Ly6C高) を区別するために Ly6C レベルのしきい値は、肺胞マクロファージ (RMAC) のそれに基づいています。並べ替えられた M MDSCs (B) 純度 (CD45+Ly6G-CD11b+Ly6C高) と MAMs (CD45+Ly6G-CD11b+Ly6C低)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/FigureS1_Rvd.pdf">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
補足図 2。分裂細胞の代表的なイメージ。ターゲット E0771 LG_NLR モノラル細胞の代表的なコマ撮りムービーから静止画。トップ: 位相コントラスト、赤と緑のチャンネルの画像を含む画像合成。下: 赤/緑の複合画像 (赤と緑のチャンネル) 重複マスクです。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/FigureS2_Rvd.pdf">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
補足図 3。骨髄系細胞の腫瘍浸潤の CD8 の増殖に及ぼす影響+ T 細胞。CD8 の CFSE と蛍光標識希釈を示す (A) 代表的なヒストグラム+ T 細胞。素朴な脾 CD8+ T 細胞がプロトコル 3 で説明したように分離・ CFSE の 5 μ M の 37 ° C 15 分で付いた。ラベル付きの T 細胞は IL-2 の存在下で培養と抗 CD3/CD28 プロトコル 4 で説明したように骨髄系細胞の有無と抗体を活性化.4 日後、フローサイト メーターによる T 細胞の蛍光グリーンが検出されました。(B) 課インデックス CD8 の+ T 細胞は前述の17として計算。データは、平均 ± SEM. * P < 制御、 #P と比較して 0.01 < αCD3/CD28 株式会社に比べて 0.05<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/FigureS3_Rvd.pdf">ファイルのダウンロードは、こちらをご覧ください</a>。
附則ムービー 1。図 3、4 の映画E + t.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS1.mp4">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
附則ムービー 2。図 3、4 の映画エフェクター (E)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS2.mp4">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
附則ムービー 3。図 3、4 の映画ターゲット (T)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS3.mp4">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
附則ムービー 4。図 3、4 の映画MDSC E + t.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS4.mp4">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
附則ムービー 5。図 3、4 の映画MAM E + t.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS5.mp4">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
附則ムービー 6。図 3、4 の映画MAM E + T (増殖).<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS6.mp4">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。

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Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

ここで前の活性化 cd8 陽性の細胞毒性を調査するプロトコルについて述べるリアルタイム顕微鏡を介してアポトーシスがん細胞を検出することにより癌細胞に対して細胞の+ T。このプロトコルは、骨髄細胞による T 細胞抑制の背後にあるメカニズムを調査し、免疫抑制の骨髄系細胞の封鎖を介してT 細胞を補給を目的とした化合物を評価できます。

CD8 による培養腫瘍細胞のアポトーシスのリアルタイム検出+ T 細胞腫瘍浸潤骨髄細胞の免疫抑制機能を勉強するには

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

我々のプロトコルは、T細胞誘発腫瘍細胞アポトーシスにおける骨髄由来サプレッサー細胞および腫瘍関連マクロファージの効果を評価する。潜在的な治療介入の根本的なメカニズムの調査と並んで。このプロトコルは、T細胞誘導性腫瘍細胞アポトーシスを高感度で直接評価し、細胞間相互作用の縦方向解析およびイメージングを可能にする。チェックポイント阻害剤の有効性は、特定の腫瘍タイプにおける腫瘍浸潤骨髄細胞によって最もよく見られる。この技術は、これらの腫瘍に対する新しい治療法の同定につながる可能性がある。この方法は、がん免疫学の研究を進めるだけでなく、免疫不全や自己免疫疾患に関する洞察を提供する可能性もあります。脾臓分離CD8陽性T細胞の活性化および増殖のために、最初のアリコートは、E-DMEMの50マイクロリットルの50マイクロリットルのCD8陽性T細胞に10回10回、96ウェルU-底板の個々のウェルに入った。次に、50マイクロリットルのE-DMEM、または50マイクロリットルのE-DMEM単独で50マイクロリットルの5番目のサプレッサー細胞に10回10をT細胞の各ウェルに加える。次に、50マイクロリットルの新たに調製した活性化培地と50マイクロリットルのE-DMEMを、目的の試験試薬の有無にかかわらず、適切なウェルに加えます。そして、プレートを摂氏37度、湿度95%の5%の二酸化炭素インキュベーターに4日間置きます。事前活性化CD8陽性T細胞標的細胞共培養をセットアップするには、まず顕微鏡に適した96ウェルフラットボトムプレートの適切なウェルに、1〜100-希釈成長因子減少可溶性基底膜マトリックスの30マイクロリットルを追加します。プレートを振ってマトリックスを均等に広げ、プレートを細胞培養インキュベーターに少なくとも1時間置きます。プレートが平衡している間、ターゲット細胞を準備する。培地を吸引し、PBSで洗浄し、室温で05%トリプシン-EDTAの1ミリリットルを1分間加えます。9ミリリットルのDMEMを、穏やかなピペットによって胎児ウシ血清を添加し、解き分けた細胞をチューブに移す。細胞を遠心した後、500マイクロリットルのE-DMEMでパレットを再懸濁する。細胞ストレーナーを通して再中断された細胞をフィルタリングし、生きている細胞を数えます。次に、氷上の新鮮なE-DMEMで1ミリリットル当たり4倍の標的細胞に密度を10倍に調整します。次に、プリ活性化CD8陽性T細胞を数回ピペットし、細胞を単一の細胞懸濁液に再懸濁させ、浮遊T細胞を1つの1.5ミリリットルチューブに1つの条件に移した。井戸あたり200マイクロリットルのPBSで残りの細胞を収集し、適切な1.5ミリリットルチューブに流し込み、遠心分離機を入れ替えます。培地を吸引し、遠心分離のために各チューブにE-DMEMを1ミリリットル加えます。遠心分離後、1管当たり新鮮なE-DMEMの100マイクロリットルでペレットを再懸濁する。カウント後、各チューブ内の細胞を1.6倍の密度に調整し、培地1ミリリットル当たり5番目の事前活性化CD8陽性T細胞に調整し、細胞を氷の上に置きます。細胞の準備ができたら、96ウェル顕微鏡プレートの各ウェルから基部膜マトリックスを吸引し、混合してプレートの内側60ウェル内の個々のウェルにターゲット細胞の50マイクロリットルを追加します。25マイクロリットルのE-DMEMをIL2のミリリットル当たり3単位に4倍10回添加し、10マイクロモルフルオロゲンカスパーゼ-3基質を適切なウェルに加えます。次に、適切なウェルに25マイクロリットルの事前活性化CD8陽性T細胞を加えます。最後に、E-DMEMを適切なウェルに加え、最大100マイクロリットルの総容量を作ります。すべての空の井戸にPBSまたは無菌水の200マイクロリットルを追加します。プレートを振り、平らな面に10分間置いておきます。細胞を画像化するには、顕微鏡を位相コントラストで画像を取得するように設定します。核制限蛍光タンパク質に適した蛍光チャネルと同様に、実験で使用される蛍光活性カスパーゼ-3基質とが挙げられる。次に、各実験井戸の位相コントラストと2つの蛍光チャネルの画像を1~3時間ごとに、少なくとも72時間撮影します。撮影した画像を解析するために、基質信号に用いる蛍光チャネルにカスパーゼ-3基質を含まない標的細胞と培地のみを含むコントロールウェルから画像を開く。核から不適切な蛍光シグナルが出されているかどうかを観察する。基質信号が核内で明らかな場合は、スペクトルを使用して、基質信号が消失するまで、核信号から除去される基質信号の割合を増加させる。次に、2つの蛍光チャネル内のカスパーゼ-3基質を含まない培地に核非標識エフェクター細胞のみを個別に含む対照ウェルを見る。シグナルが核によって放出されるかどうかを観察します。個々のチャンネルに信号が見えない場合、スペクトルのアンミックスは必要ありません。蛍光チャネルの両方で蛍光オブジェクトを解決するには、サンプルに関連するパラメータとエッジ分割に適切なパラメータを持つ蛍光バックグラウンド減算方法を使用します。標的細胞単一培養の画像を用い、標的細胞核蛍光のパラメータを確立する。エフェクター細胞単一培養の画像を使用して、基質誘発性アポトーシス核蛍光のパラメータを確立する。共培養の画像を使用して、標的細胞における基質誘発性アポトーシス核蛍光のパラメータを検証または精製します。標的核の最小サイズを決定するには、カスパーゼ基質を有する標的細胞のみを含むウェルからの核シグナルチャネル内の画像を使用する。アポトーシスエフェクター核の平均サイズを決定するために、カスパーゼ基質を有するエフェクター細胞のみを含むウェルからの基質シグナルチャネル内の画像を使用する。蛍光標的細胞核数をカウントするには、適切な最小サイズ制限を用いて分析手順を設定する。エフェクター細胞単一培養画像を用いて、アポトーシスエフェクター核の平均サイズよりも大きいアポトーシス核の数を数える第2の分析手順を設定する。次に、核信号とサイズ制限基質シグナルが有意に共局化する核数をカウントしてアポトーシス標的細胞の数をカウントする第3の分析手順を設定する。典型的には、癌細胞は、細胞が抑制細胞の不在時に抗体によって事前活性化されたCD8陽性T細胞と接触する場合、核標的カスパーゼバイオセンサーの活性化後の核内の蛍光シグナルを増加させる。CD8陽性T細胞の核サイズは、癌細胞の核サイズよりも小さい。従って、アポトーシスエフェクター細胞は、サイズ制限画像解析法によりアポトーシス標的細胞数から除外することができる。一部の標的癌細胞は、蛍光基質のない小さな丸みを帯びた形状を示すが、これは分析に影響を与えない。これらの細胞はアポトーシスではなく有糸分裂を受けているため、核基板信号オーバーラップマスクによってアポトーシス標的細胞数から除外される。CD8陽性T細胞を有する標的癌細胞の共培養は、癌細胞単一培養における自発的アポトーシスのレベルを上回る腫瘍細胞アポトーシスを増加させる。一般的に、エフェクター細胞に対する標的癌細胞の最適比を用いた場合、アポトーシス標的癌細胞の数のピークが観察され得る。このピークは、データがターゲット細胞集団のアポトーシス画分として表される場合により明確になります。このプロトコルを試みる際に覚えておくべきことは、標的細胞の単一培養と、分析マスクの開発に使用するエフェクター細胞の単一培養を設定することです。この方法は、T細胞からがん細胞への相互作用の持続時間および頻度、およびヒトおよびマウス細胞の両方における遺伝子依存性細胞毒性に関連する条件に関する洞察を提供することができる。現在、このアッセイをヒト細胞を用いたハイスループットスクリーンに開発し、骨髄細胞介在免疫抑制を阻害する化合物を同定し、チェックポイント阻害剤の有効性を高めています。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivoひと肺腫瘍内常駐 cd8 陽性 T リンパ球の画像スライス共焦点顕微鏡を用いた

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

CLIC4 ノックダウン誘起 HN4 細胞アポトーシスの in Vitro研究にミトコンドリア膜電位の検出

Depletion of the mitochondrial membrane potential (MMP, &#916;&#936;m) is considered the earliest event in the apoptotic cascade. It even occurs ahead of ...

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

マウス単球由来樹状細胞とその後続の in Vitro活性化腫瘍免疫複合体との隔離のプロトコル

Dendritic cells (DC) are heterogeneous cell populations that differ in their cell membrane markers, migration patterns and distribution, and in their ...

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

アポトーシス反転後新しく形成された乳癌幹細胞様細胞の流れフローサイトメトリー法による検出

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

Intramucosal Inoculation of Squamous Cell Carcinoma Cells in Mice for Tumor Immune Profiling and Treatment Response Assessment

腫瘍免疫プロファイル用のマウスおよび治療応答評価における扁平上皮癌細胞の粘膜接種

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is a debilitating and deadly disease with a high prevalence of recurrence and treatment failure. To develop ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

キメラ抗原受容体の T 細胞の抗腫瘍機能の予測評価のため培養腫瘍細胞の再投与に

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

腫瘍マクロファージ相互作用を研究するインビトロアッセイ

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

腫瘍抗原特異的T細胞の生成にヒト誘導多能性幹細胞を用いた

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

直交トピック膵腫瘍の生成と腫瘍浸潤T細胞細胞傷害のEx生体内特性評価

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

組織性腫瘍組織スライスにおけるリアルタイム薬物応答の測定

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...