Name: real time detection of in vitro tumor cell apoptosis induced by cd8+ t cells to study immune suppressive functions of tumor-infiltrating myeloid cells
Uploaded: 2019-01-29T12:30:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells at JoVE

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Wellcome Trust (101067/Z/13/Z (JWP), 109657/Z/15/Z (TK), 615KIT/J22738 (TK), UK) og MRC (MR/N022556/1 (JWP, TK), UK). NOC og DDS anerkjenner støtte fra National fenotypiske Screening sentrum Phenomics Discovery initiativ og kreft forskning UK (NOC)

<ol>
	<li>Barry, M., Bleackley, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+T+lymphocytes:+all+roads+lead+to+death.">Cytotoxic T lymphocytes: all roads lead to death.</a> Nature Reviews in Immunology. 2, 401-409 (2002).</li><li>Durgeau, A., Virk, Y., Corgnac, S., Mami-Chouaib, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+targeting+CD8+T-cell+immunity+for+more+effective+cancer+immunotherapy.+Frontiers+in+Immunology.">Recent advances in targeting CD8 T-cell immunity for more effective cancer immunotherapy. Frontiers in Immunology.</a> 9. , 14 (2018).</li><li>Tanaka, A., Sakaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cells+in+cancer+immunotherapy.">Regulatory T cells in cancer immunotherapy.</a> Cell Research. 27, 109-118 (2017).</li><li>Fleming, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+myeloid-derived+suppressor+cells+to+bypass+tumor-induced+immunosuppression.">Targeting myeloid-derived suppressor cells to bypass tumor-induced immunosuppression.</a> Frontiers in Immunology. 9, 398 (2018).</li><li>Cassetta, L., Kitamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+targeting:+opening+new+possibilities+for+cancer+immunotherapy.">Macrophage targeting: opening new possibilities for cancer immunotherapy.</a> Immunology. 155, 285-293 (2018).</li><li>Chahroudi, A., Silvestri, G., Feinberg, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+T+cell-mediated+cytotoxicity+using+fluorogenic+caspase+substrates.">Measuring T cell-mediated cytotoxicity using fluorogenic caspase substrates.</a> Methods. 31, 120-126 (2003).</li><li>Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+flow+cytometric+assays+for+monitoring+cell-mediated+cytotoxicity.">New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity.</a> Expert Review of Vaccines. 9, 601-616 (2010).</li><li>Azimi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification,+isolation,+and+functional+assay+of+regulatory+T+Cells.">Identification, isolation, and functional assay of regulatory T Cells.</a> Immunological Investigation. 45, 584-602 (2016).</li><li>Bruger, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+measure+the+immunosuppressive+activity+of+MDSC:+assays,+problems+and+potential+solutions.">How to measure the immunosuppressive activity of MDSC: assays, problems and potential solutions.</a> Cancer Immunology Immunotherapy. , (2018).</li><li>Qian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+macrophage+population+mediates+metastatic+breast+cancer+cell+extravasation,+establishment+and+growth.">A distinct macrophage population mediates metastatic breast cancer cell extravasation, establishment and growth.</a> PLoS One. 4, e6562 (2009).</li><li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytes+differentiate+to+immune+suppressive+precursors+of+metastasis-associated+macrophages+in+mouse+models+of+metastatic+breast+cancer.">Monocytes differentiate to immune suppressive precursors of metastasis-associated macrophages in mouse models of metastatic breast cancer.</a> Frontiers in Immunology. 8, 2004 (2018).</li><li>Bronte, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+myeloid-derived+suppressor+cell+nomenclature+and+characterization+standards.">Recommendations for myeloid-derived suppressor cell nomenclature and characterization standards.</a> Nature Communications. 7, 12150 (2016).</li><li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCL2-induced+chemokine+cascade+promotes+breast+cancer+metastasis+by+enhancing+retention+of+metastasis-associated+macrophages.">CCL2-induced chemokine cascade promotes breast cancer metastasis by enhancing retention of metastasis-associated macrophages.</a> Journal of Experimental Medicine. 212, 1043-1059 (2015).</li><li>Ewens, A., Mihich, E., Ehrke, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distant+metastasis+from+subcutaneously+grown+E0771+medullary+breast+adenocarcinoma.">Distant metastasis from subcutaneously grown E0771 medullary breast adenocarcinoma.</a> AnticancerResearch. 25, 3905-3915 (2005).</li><li>Choppa, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+PCR+for+the+detection+of+Mycoplasma+fermentans,+M.+hominisandM.+penetransin+cell+cultures+and+blood+samples+of+patients+with+chronic+fatigue+syndrome.">Multiplex PCR for the detection of Mycoplasma fermentans, M. hominisandM. penetransin cell cultures and blood samples of patients with chronic fatigue syndrome.</a> Molecular and Cellular Probes. 12, 301-308 (1998).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current protocols in immunology. , (2001).</li><li>Koyanagi, M., Kawakabe, S., Arimura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+colorimetric+cell+proliferation+assays+in+immune+cells.">A comparative study of colorimetric cell proliferation assays in immune cells.</a> Cytotechnology. 68, 1489-1498 (2016).</li><li>Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid-derived-suppressor+cells+as+regulators+of+the+immune+system.">Myeloid-derived-suppressor cells as regulators of the immune system.</a> Nature Reviews in Immunology. 9, 162-174 (2009).</li><li>Cassetta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+and+human+tumor-associated+macrophages.">Isolation of mouse and human tumor-associated macrophages.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 899. 899, 211-229 (2016).</li></ol>

Forfatterne ikke avsløre.

Denne metoden er basert på to separate co kultur trinn: co dyrking CD8+ T celler med potensielle suppressor cellene og co dyrking av pre-betinget CD8+ T celler med mål kreftceller (figur 1). Steg 1 co kultur er ganske ligner CD8+ T celle spredning analyser vanligvis brukes til å fastslå effekten av suppressor cellene på CD8+ T celle-funksjonen. Men samsvarer T celle spredning ikke alltid med deres cytotoksisitet. For eksempel vi har funnet at co kultur med M-MDSCs eller mammaer økt i stedet for redusert spredning av CD8+ T celler i nærvær av CD3/CD28 aktivere antistoffer (supplerende figur 3), mens disse pre betinget CD8+ T-celler viste redusert cytotoksisitet mot målet celler (Figur 4, figur 5, figur 6). Disse resultatene markere betydningen av evalueringen av funksjonelle aktiviteten, dokumentert av målet kreft celle apoptose, som denne CD8+ T celle cytotoksisitet analysen.
I denne analysen, har vi identifisert som CD8+ T celler krever ca 15 h co kultur for å indusere maksimal apoptose av E0771-LG musen mammary kreftceller (figur 5). Denne forsinkelsen kan skyldes lag mellom første kontakt Effektor celler med mål samt tilhørende immun synapse dannelse og tiden det tar å indusere apoptotisk signaler i mål målt ved aktivering av caspase-3 (supplerende film 1 ). Vi har også identifisert som antall apoptotisk tumorceller nådd et platå etter 24 h, som er trolig på grunn av eliminering av mål av T-celler og/eller tap av fluorescerende signal fra døde celler. Denne evnen til å identifisere av topp apoptose er en stor fordel av denne analysen siden bestemmelse av en optimal tidspunkt er viktig for riktig sammenligninger mellom ulike forhold. I vårt tilfelle for eksempel forskjellen i cytotoksisitet mellom kontroll CD8+ T celler og MDSC/MAM-utdannede CD8+ T celler var mye større på 15-18 h sammenlignet med 72 h (figur 5), og dermed et sluttpunkt eksperimentere med en 72 h inkubasjonstid ville gi misvisende resultater.
Denne metoden kan også visualisering av sanntids effektor til mål celle interaksjon, som gir bedre innsikt i mekanismen underliggende begrenset cytotoksisitet av CD8+ T celler pre inkubert med suppressor cellene. For eksempel vi observerte at CD8+ T celler pre inkubert med M-MDSCs eller mammaer oppdaget og interaksjon med mål kreftceller, men ikke alltid få apoptose (supplerende Movie 4, utfyllende film 5, utfyllende filmen 6). Selv om vi ikke tallfeste denne hendelsen, ville det være mulig og interessant å kvantifisere og sammenligne andelen møter og samhandling tiden sammen med apoptose induksjon. En annen stor fordel er at denne metoden krever et lite antall celler (f.eks 1 x 103 mål) og 4 x 103 Effektor celler per brønn. Faktisk kan denne protokollen videre miniatyriserte for 384-vel plate format hvis ønskelig. Derfor er denne analysen egnet for høy gjennomstrømning screening og eksperimenter der cellen tallene er begrenset som i vitro testing ved bruk av dyrebare celler avledet fra i vivo eller ex vivo prøver.
På den annen side, er en begrensning av gjeldende analysen tilstedeværelsen av betydelig antall døde Effektor celler i noen forhold. For å øke nøyaktigheten i atskillende apoptose av mål kreftceller enn effektor CD8+ T celler, kjerner i målet celler er merket og en kjerner størrelsesbegrensningen (som utelukker Effektor celler) brukes for dataanalyse i dette analysen (figur 2). Men er det noen tilfeller der overlegg av aggregater av (grønn) apoptotisk CD8+ T celler på ikke-apoptotisk mål kreftceller, som kan forvirre resultatene. Denne begrensningen kan begrenses ved bruk av en død celle fjerning kolonne på Effektor celler før co kultur med mål kreftceller, forutsatt at tilstrekkelig antall Effektor celler er tilgjengelig. Med mer komplekse mikroskopi systemer, det kan også være mulig å redusere falske positive signalet ved merking effektor CD8+ T celler med en fluorophore forskjellig fra målet cellen kjerner og fluorogenic caspase-3 underlaget.
Så langt denne protokollen blitt benyttet for å undersøke antigen uspesifisert aktivering av CD8+ T celler. Selv om MDSCs og TAMs i svulst microenvironment undertrykke T celle funksjoner gjennom antigen uspesifisert mekanismer, undertrykke MDSCs i perifere lymfoide vev T celle svar i en antigen bestemt måte18. Undersøke immun undertrykkende funksjoner slik celletyper, i vitro spredning analysen bruker CD8+ T celler fra OT-1 transgene mus er vanlig. I denne analysen, OT-1 T-celler (uttrykke ovalbumin (OVA) bestemt T-celle reseptor) er co kultivert med suppressor MDSCs i nærvær av OVA peptider som gjelder for den første kulturen i analysen vår cytotoksisitet (i.e., aktivering av T celler i tilstedeværelse eller fravær av suppressors). Det er også mulig å manipulere mål kreftceller å uttrykke OVA, som kan indusere antigen-spesifikke kreft cellen dreping av OT-1 T celler. Derfor vil analysen også aktivere undersøkelse av MAM/MDSC-mediert undertrykkelse av antigen-spesifikke T celle aktivering. Det er også mulig å bruke analysen for å undersøke menneskelige celler, aktivisering antistoffer mot CD3 og CD28 er kommersielt tilgjengelig, og en protokoll for å isolere menneskelige TAMs fra klinisk prøver har vært etablert19.
Kollektivt denne analysen er ganske allsidig og kan brukes til å undersøke cytotoksisitet andre immun celletyper. Foreløpig i våre laboratorier, det blir utvidet for å undersøke antigen-avhengig celle cytotoksisitet under ulike forhold, og er også utviklet for høy gjennomstrømning screening.

Det er kjent at CD8+ T celler kan eliminere kreftceller når de utøve sine full cytotoksisitet. Etter aktivering av T-celle reseptor (TCR), CD8+ T celler spredning og differensiere i cytotoksiske Effektor celler. Utvidet og aktivert CD8+ T celler skiller cytotoksiske korn, inkludert perforin og granzymes, som overføres til målcellene og starte ulike lytisk trasé som caspase-3 mediert apoptose1. CD8+ T celler kan også indusere svulst celle apoptose av reseptorer på målet celler, for eksempel reseptorer for tumor nekrose faktor-α (TNF-α), første apoptose signal ligand (FasL) eller TNF-relaterte apoptose-inducing ligand (sti). Videre aktivert CD8+ T celler skiller interferon-γ (IFN-γ) som kan undertrykke svulst celle spredning og øke sensitiviteten av kreftceller til CD8+ T celler via opp-regulering av FasL reseptor1. Gitt potensialet for CD8+ T svulst drapet evne, flere strategier for å øke deres cytotoksisitet (f.eks checkpoint hemmere, kreft vaksinasjon og adopsjon overføring av chimeric antigen reseptor (bil) uttrykker T celler) har blitt etablert og vist signifikant terapeutisk effekt på visse typer kreft2. Men samler bevis antyder at svulsten-infiltrere immunceller som regulatoriske T-celler, myelogen-avledet suppressor cellene (MDSCs), og svulst-assosiert makrofager (TAMs) kan undertrykke CD8+ T celle funksjoner og begrense effekten immunotherapies3,4,5. For å forbedre slike immunotherapies, er det viktig å forstå hvordan immun suppressor cellene grense CD8+ T celle cytotoksisitet. Identifikasjon av CD8+ T celle undertrykkelse mekanismer samt druggable mål å overvinne den, vil kreve utvikling og utnyttelse av in vitro analyser.
Metoden gullstandarden måle CD8+ T celle cytotoksisitet er krom utgivelsen analysen der utgivelsen av radioaktivt sonden (51Cr), fra målet celler som er lysed av CD8+ T celler er bestemt6. Denne analysen har imidlertid flere ulemper inkludert relativt lav følsomhet, høye, manglende evne til å oppdage tidlig apoptotisk hendelser, farlig disposisjon problemer og begrenset kompatibilitet med automatisert flytende håndtering og gjenkjenning for å støtte programmer med høyere ytelse. En annen vanlig metode er flyt cytometric analyser som apoptose av mål kreftceller oppdages av annexin V bindende7. I denne analysen er det mulig å oppdage andre parametere som mål celledød bruker propidium iodide (PI) eller 7-aminoactinomycin D (7-AAD) og effektor celle aktivering angitt av CD107a eller CD69 uttrykk, i tillegg til apoptose i målcellene7 . Denne analysen krever imidlertid stort antall suppressor cellene sammenlignet med krom utgivelsen analysen. Det krever også løsgjøring og disaggregation av tilhenger målcellene og dette kan påvirke resultatene. Faktisk krom slipper analysen eller flyt cytometric analysen brukes vanligvis ikke til å undersøke suppressor celle effekter på T celle funksjoner. I stedet måling av T-celle spredning angitt av fortynning av en fluorescerende farge (f.eks CFSE) pre-lastet inn T celler brukes ofte til å evaluere hemming av CD8+ T celle funksjon av suppressor cellene. Oppdagelsen av IFN-γ produksjon fra kulturperler T-celler er en annen metode å evaluere effekten av suppressor cellene på T celle aktivering8,9. Men resultatene fra disse analyser ikke nødvendigvis samsvarer målcellen drepe evnen til CD8+ T celler.
Vi presenterer her en alternativ funksjonell analyse for å vurdere effekten av suppressor cellene, spesielt makrofager i metastatisk svulster, på cytotoksisitet av CD8+ T celler. Denne metoden angir cytotoksisitet av CD8+ T celler, pre kultivert med eller uten suppressor cellene i nærvær av anti-CD3/CD28 aktivering antistoffer, ved å registrere svulst celle apoptose, angitt av fluorescens fra en fluorogenic caspase-3 substrat6 bruke automatisert time-lapse mikroskopi (figur 1). Denne protokollen har flere fordeler sammenlignet med andre metoder; det krever bare et lite antall celler, gjør påvisning av tilhenger svulst celledød med høy følsomhet, kan bildet sanntid effektor til mål interaksjon og er mottakelig for høy gjennomstrømning screening.
I denne protokollen brukes metastasering-assosiert makrofager (mammaer) og deres stamfar monocytic-MDSCs (M-MDSCs) isolert fra metastatisk svulster i mus som suppressor cellene. I musen modeller for metastatisk brystkreft, forskjellige innbyggere makrofager preget som F4/80høyLy6G-CD11bhøyLy6Clav akkumuleres i lungene som inneholder metastatisk svulster. Denne macrophage befolkningen er sjelden funnet i normale lungene og dermed kalles metastasering-assosiert makrofager (mammaer)10. I disse musen modeller, en annen myelogen celle befolkningen, definert som F4/80høyLy6G-CD11bhøyLy6Chøy, også tjener hovedsakelig i metastatisk lungene hvor det gir stige til mammaer11. Basert på deres egenskaper, representere CD11bhøyLy6Chøy MAM progenitor celler M-MDSCs12.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin EDTA (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Freiner Bio-One</td>
			<td>665-180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL Plystyrene Round-Bottom Tube</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Cell Culture Plate (Round Bottom )</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3799</td>
			<td>Co-culture of CD8+T cells with sorted myeloid cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate (Flat bottom)</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>165305</td>
			<td>Co-culture of CD8+T cells with target cells for cytotoxicity assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF647 anti-mouse F4/80 Antibody</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>MCA497A647</td>
			<td>Clone: CIA3-1, Lot#: 1707, 2 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor700 anti-mouse CD8 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100730</td>
			<td>Clone: 53-6.7, Lot#: B205738, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD28 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102111</td>
			<td>Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 37.51, Lot#: B256340</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD3e Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100314</td>
			<td>Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 145-2C11, Lot#: B233720</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD3 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100236</td>
			<td>Clone: 17A2, Lot#: B198730, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cy7 anti-mouse Ly6C Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>128026</td>
			<td>Clone: HK1.4, Lot#: B248351, 1 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albmin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1470-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer (100&#956;m Nylon)</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352360</td>
			<td>To smash the spleen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer (40&#956;m Nylon)</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352340</td>
			<td>To filter the lung digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>422801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8242;s Modified Eagle&#8242;s Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>19853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse CD4 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100406</td>
			<td>Clone: GK1.5, Lot#: B179194, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex Ready-to-Use</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1596-01</td>
			<td>Coating the 96-well plates for cytotoxicity assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte NucLight Red Lentivirus Reagent</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>4476</td>
			<td>Lenti viral particules encoding mKate2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte ZOOM</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td></td>
			<td>Detector (fluorescence microscope)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte ZOOM 2018A</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td></td>
			<td>Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2916801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lung Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-095-927</td>
			<td>Preparation of single cell suspension from the tumor-bearing lung</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MycoAlert Mycoplasma Detection Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>LT07-318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acid (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucView488</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>10403</td>
			<td>Fluoregenic caspase-3 substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse Ly6G Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>127607</td>
			<td>Clone: 1A8, Lot#: B258704, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 anti-mouse CD11b Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101216</td>
			<td>Clone: M1/70, Lot#: B249268, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Penicillin Streptomycin for primary culture of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103132</td>
			<td>Clone: 30-F11, Lot#: B249564, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene (Hexadimethrine bromide)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis Buffer (10X)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine IL-2</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>212-12</td>
			<td>Activation of isolated CD8+ T cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruStain fcX (anti-mouse CD16/32) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>&#160;: Nikon 10X objective (resolution 1.22 &#181;m) 
			&#160;: Green channel excitation: 440 - 480 nm 
			&#160;: Green channel emission: 504 - 544 nm 
			&#160;: Red channel excitation: 565-605 nm 
			&#160;: Red channel emission: 625 - 705 nm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real time detection of in vitro tumor cell apoptosis induced by cd8+ t cells to study immune suppressive functions of tumor-infiltrating myeloid cells

Potensiering av svulst-drapet evne til CD8+ T celler i svulster, sammen med deres effektiv svulst infiltrasjon, er nøkkelen til vellykket immunotherapies. Flere studier har indikert at svulsten infiltrere myeloide celler (f.eks myelogen-avledet suppressor cellene (MDSCs) og svulst-assosiert makrofager (TAMs)) undertrykke cytotoksisitet av CD8+ T celler i svulst microenvironment og at målretting disse regulatoriske myeloide celler kan forbedre immunotherapies. Her presenterer vi en i vitro analysen system for å vurdere immun undertrykkende effekter av monocytic-MDSCs og TAMs på svulst-drapet evne til CD8+ T celler. Dette vi først kultivert naive splenic CD8+ T celler med anti-CD3/CD28 aktivering antistoffer i tilstedeværelse eller fravær av suppressor cellene, og deretter co kultivert pre-aktivert T cellene mål kreftceller i nærvær av en fluorogenic caspase-3 substrat. Fluorescens fra underlaget i kreftcellene ble oppdaget av sanntids fluorescens mikroskopi som en indikator på T-celle indusert svulst celle apoptose. I denne analysen, kan vi oppdage økningen av svulst celle apoptose av CD8+ T celler og sin undertrykkelse av pre kultur med TAMs eller MDSCs. Denne funksjonelle analysen er nyttig for å undersøke CD8+ T celle undertrykkelse mekanismer av regulatoriske myeloide celler og identifisere druggable mål å overvinne den via høy gjennomstrømning screening.

Denne metoden er basert på enkel co kultur av målet kreftceller med effektor CD8+ T celler som har vært pre kultivert med eller uten suppressor cellene i nærvær av anti-CD3/CD28 aktivering antistoffer. Den oppdager CD8+ T celle-indusert kreft celle apoptose over tid etter co kultur, dermed muliggjør evaluering av virkningene av suppressor cellene på cytotoksisitet av CD8+ T celler.
Vanligvis kreftceller øke grønne fluorescens i sine atomkjerner etter aktivering av en kjernefysisk målretting caspase biosensor når disse cellene ta kontakt med CD8+ T celler som er pre-aktivert av antistoffer i fravær av suppressor cellene ( Figur 3; Sekvenser komplementære filmen 1). Grønne fluorescens fra caspase underlaget var synlig minst 15 h etter apoptose ble startet. Noen spontan apoptose av effektor CD8+ T celler ble også observert over tid selv om disse cellene ble kultivert isolert (Figur 4; Sekvenser komplementære filmen 2). Imidlertid kjerner størrelser CD8+ T celler er mindre enn kreftceller og dermed apoptotisk 'effektor' celler kan bli ekskludert fra apoptotisk 'mål' celle teller av en størrelse begrensningen bildet analysemetode (figur 2 og Figur 4). Selv om noen mål kreftceller viser en liten avrundet form uten grønne fluorescens, påvirke dette ikke analyse som disse cellene gjennomgår mitose i stedet for apoptose (supplerende Movie 3), og dermed er utelukket fra apoptotisk "mål" cellen teller av en rød/grønn overlapping (supplerende figur 2). Spontan apoptose av mål kreftceller finnes sporadisk i enkelt kultur (supplerende Movie 3). Imidlertid co kultur målet kreft celler med pre-aktivert CD8+ T celler økt svulst celle apoptose over nivåene av spontane apoptose i monokultur av kreftceller (Figur 4). Vanligvis når du bruker en optimal ratio på målet celler Effektor celler, kan en topp i antall apoptotisk mål kreftceller observeres (figur 5A). Denne toppen er tydeligere når dataene er uttrykt som apoptotisk brøkdel av cellen målgruppen (figur 5B). I dette eksperimentet de basale apoptose av mål kreftceller nådde 24 h (med apoptotisk brøkdel = 0,08), men CD8+ T celle-indusert apoptose nådd maksimalt nivå på 17 h (med apoptotisk brøkdel = 0,66).
Vi fant videre at CD8+ T celler pre inkubert med mammaer eller M-MDSCs kan gjøre kontakt mål kreftceller, men denne kontakten syntes å føre til færre tilfeller av kreft celle apoptose sammenlignet CD8+ T celler pre-aktivert uten Suppressor cellene (Figur 3 og Figur 4; Sekvenser komplementære filmen 4 og supplerende film 5). Selv om CD8+ T celler pre inkubert med myeloide celler sporadisk indusert kreft celle apoptose, det var også noen spredning av målet celler som ikke har blitt stimulert gjennomgå apoptose løpet tid av den eksperiment (supplerende filmen 6). Samsvar med disse funnene, topp brøkdel av apoptotisk kreftceller kultivert med CD8+ T celler pre inkubert med myeloide celler (apoptotisk brøkdel = 0,38 på 23t for MDSC-E og 0,25 på 20 h MAM-e) var betydelig lavere enn kreftceller kultivert med CD8+ T celler som ikke var pre inkubert med suppressor cellene (figur 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig1.jpg"> Figur 1: et oppsett som viser den eksperimentelle prosedyren. Naive splenic CD8+ T celler er kultivert med anti-CD3/CD28 aktivering antistoffer med eller uten metastasering-assosiert makrofager (mammaer) eller monocytic-myelogen-avledet suppressor cellene (M-MDSCs). Etter 4 dager, flytende CD8+ T celler er samlet og co kultivert mål kreftceller i nærvær av fluorogenic caspase-3 substrat. Apoptotisk kreftceller oppdages under sanntid fluorescens mikroskopi. Bilder vist anskaffet bruk en levende celle-imaging plattform (se Tabell for materiale). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig2.jpg"> Figur 2: Identifikasjon av apoptotisk målcellene forskjellig fra apoptotisk Effektor celler. Øverste rad: bildeopptak i den røde kanalen kan identifikasjonen av målet cellen kjerner av målet gjenkjenning (rosa analyse maske). Midtre rad: bilder i den grønne kanalen angi apoptotisk mål og Effektor celler. Asize begrenset apoptose maske (Blågrønn analyse maske; større enn 80 µm2) kan enkelt apoptotisk Effektor celler skal utelates fra analyse. Nederste rad: kompositt bilder flettede røde og grønne kanaler med fase kontrast bilde (venstre) eller rød/grønn overlapper maske (høyre). Identifikasjon av samlokalisert, størrelse-begrenset grønne fluorescens med røde fluorescens (gul analyse maske), kan mer nøyaktig oppdagelse av apoptotisk mål kjerner (gul pilspiss) ved å ekskludere aggregater apoptotisk Effektor celler (hvit pilspisser). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig3.jpg"> Figur 3: Samspillet mellom CD8+ T celler og kreftceller. Stillbilder fra representant time-lapse filmer av målet E0771-LG_NLR celler (T) co kultivert med effektor CD8+ T celler (E) på 4:1 effektor/target ratio. MDSC-E og MAM-E angir Effektor celler pre inkubert med M-MDSCs og mammaer henholdsvis. Sammensatte bilder (inkludert bilder fra fase kontrast, røde og grønne kanaler) vises. Pilspisser sporer de samme cellene gjennom de ulike feltene og tidspunkt. Gul pilspisser: et mål som knytter effektor og gjennomgår apoptose, hvit pilspisser: et mål som knytter effektor men gjennomgår apoptose. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig4.jpg"> Figur 4: gjenkjenning av apoptotisk kreftceller. Representant felt utvunnet fra time-lapse filmer på 18 h etter bildebehandling. Sammensatte bilder (venstre, fase kontrast, røde og grønne kanaler) og bilder fra røde kanalen uten (midten) eller masken (gul) vises med (høyre) rød/grønn overlapping. Gule prikker i høyre kolonne representerer apoptotisk kreftceller. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig5.jpg"> Figur 5: CD8+ T celle-indusert kreft celle apoptose. (A) antall apoptotisk kreftceller kulturperler med effektor C8+ T celler på ulike effektor målet forhold (E:T). (B) apoptotisk brøkdel av cellen målgruppen. Dataene er betyr ± SD. mener området under kurven (AUC) vises også. Unpaired t-test med welchs korreksjon ble brukt til å analysere AUC. * P < 0,0001 sammenlignet med E:T = 0:1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig6.jpg"> Figur 6: Effekter av svulst-infiltrere myeloide celler på cytotoksisitet av CD8+ T celler. (A) antall apoptotisk kreftceller (mål: T) kultivert med C8+ T celler (effektor: E) på 4:1 av E:T forhold. CD8+ T celler ble pre kultivert i fravær (svart sirkel) eller tilstedeværelse av monocytic-myelogen-avledet suppressor cellene (MDSC-E: blå sirkel) eller metastasering-assosiert makrofager (MAM-E: rød sirkel). Dataene er ± SD. (B) apoptotisk brøkdel av cellen målgruppen. Dataene er betyr ± SD. mener AUC vises også. Unpaired t-test med welchs korreksjon ble brukt til å analysere AUC. * P < 0,0001 forhold til T, #P < 0,0001 sammenlignet med E + T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig6large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
Supplerende figur 1. Gating strategi å isolere suppressor cellene fra metastatisk lungene. (A) representant dot tomter å isolere monocytic myelogen-avledet suppressor cellene (M-MDSCs) og metastasering-assosiert makrofager (mammaer). Terskelen til Ly6C nivå å skille mammaer (Ly6Clav) og M-MDSCs (Ly6Chøy) er basert på bosatt alveolar makrofager (RMAC). (B) renheten av de sorterte M-MDSCs (CD45+Ly6G-CD11b+Ly6Chøy) og mammaer (CD45+Ly6G-CD11b+Ly6Clav). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/FigureS1_Rvd.pdf">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Supplerende figur 2. Representant bilder av mitotisk målcellene. Stillbilder fra representant time-lapse filmer av målet E0771-LG_NLR celle mono-kultur. Topp: kompositt bilder inkludert bilder fra fase kontrast, røde og grønne kanaler. Bunnen: sammensatte bilder (rød og grønn kanaler) med rød/grønn overlappe maske. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/FigureS2_Rvd.pdf">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Supplerende figur 3. Effekter av svulst-infiltrere myeloide celler på spredning av CD8+ T celler. (A) representant histogrammer viser fortynning av fluorescerende merking med CFSE i CD8+ T celler. Naive splenic CD8+ T celler ble isolert som beskrevet i Protocol-3 og merket med 5 µM av CFSE på 37 ° C i 15 min. De merkede T-cellene var kulturperler i nærvær av IL-2 og anti-CD3/CD28 aktivere antistoffer med eller uten myeloide celler som beskrevet i protokoll 4. Etter 4 dager, ble grønne fluorescens i T celler oppdaget av flyt cytometer. (B) divisjon indeks over CD8+ T celler beregnet som beskrevet tidligere17. Data er betyr ± SEM. * P < 0,01 sammenlignet kontroll, #P < 0,05 sammenlignet med αCD3/CD28 Ab. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/FigureS3_Rvd.pdf">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Sekvenser komplementære filmen 1. Film av tall 3 og 4; E + T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS1.mp4">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Supplerende film 2. Film av tall 3 og 4; Effektor (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS2.mp4">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Sekvenser komplementære filmen 3. Film av tall 3 og 4; Mål (T). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS3.mp4">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Sekvenser komplementære filmen 4. Film av tall 3 og 4; MDSC-E + T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS4.mp4">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Sekvenser komplementære filmen 5. Film av tall 3 og 4; MAM-E + T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS5.mp4">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Sekvenser komplementære filmen 6. Film av tall 3 og 4; MAM-E + T (spredning). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS6.mp4">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells at JoVE

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Vi beskriver her en protokoll for å undersøke cytotoksisitet av pre-aktivert CD8+ T celler mot kreftceller ved å registrere apoptotisk kreft celler via sanntid mikroskopi. Denne protokollen kan undersøke mekanismene bak myelogen celle-indusert T celle undertrykkelse og evaluere forbindelser å fylle T celler via blokade av undertrykkende myelogen immunceller.

Sanntid påvisning av i Vitro svulst celle apoptose indusert av CD8+ T celler å studere immun undertrykkende funksjoner av svulst-infiltrere myeloide celler

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Vår protokoll vurderer effekten av myeloid-avledede suppressorceller og tumor-tilknyttede makrofager i T-celle-indusert tumorcelle apoptose. Ved siden av undersøkelse av de underliggende mekanismene for potensielle terapeutiske inngrep. Denne protokollen evaluerer direkte T-celleindusert tumorcelle apoptose med høy følsomhet og muliggjør langsgående analyse og avbildning av celle-til-celle interaksjoner.Effekten av sjekkpunkthemmeren ses best på av tumorinfiltrerende myeloide celler i visse tumortyper. Denne teknikken kan føre til identifisering av nye terapier for disse svulstene. Denne metoden kunne ikke bare fremme kreftimmunologiforskning, men kan potensielt også gi innsikt i immunsvikt og autoimmune sykdommer.For aktivering og utvidelse av miltisolerte CD8-positive T-celler, først aliquot en ganger 10 til den femte CD8-positive T-celler i 50 mikroliter av E-DMEM i individuelle brønner av en 96-brønn U-bunnplate. Deretter legger du til en gang 10 til de femte suppressorcellene i 50 mikroliter E-DMEM, eller 50 mikroliter E-DMEM alene, i hver brønn av T-celler. Tilsett deretter 50 mikroliter med nyberedt aktiveringsmedium og 50 mikroliter E-DMEM, med eller uten testreagenser av interesse, til de aktuelle brønnene.Og legg platen i en 37-graders Celsius og 5% karbondioksidinkubator med 95% fuktighet i fire dager. For å sette opp en forhåndsaktivert CD8-positiv T-celle målcellekokultur, legg først til 30 mikroliter av 1-til-100-fortynnet vekstfaktorredusert oppløselig kjellermembranmatrise til de riktige brønnene til en 96-brønns flatbunnsplate, egnet for mikroskopi. Rist platen for å spre matrisen jevnt, og legg platen i cellekulturinkubatoren i minst en time.Mens platen er likevekt, forberede målcellene. Aspirer mediet, vask med PBS, og tilsett en milliliter 05% Trypsin-EDTA ved romtemperatur i ett minutt. Tilsett ni milliliter DMEM supplert med fosterbovinserum ved skånsom pipettering, og overfør de dissosierte cellene til rør.Etter sentrifugering av cellene, resuspend pallen i 500 mikroliter av E-DMEM. Filtrer de gjenbrukte cellene gjennom en cellesil, og tell de levende cellene. Juster deretter tettheten til fire ganger 10 til fjerde målceller per milliliter i fersk E-DMEM på is.Deretter pipette de forhåndsaktiverte CD8-positive T-cellene et par ganger for å gjenbruke cellene til en enkelt celle suspensjon, og overføre flytende T-celler til en 1,5-milliliter rør per tilstand. Samle eventuelle gjenværende celler med 200 mikroliter PBS per brønn, overfør vaskene til de riktige 1,5-milliliter rørene og sentrifuge. Aspirer mediet og tilsett en milliliter E-DMEM til hvert rør for sentrifugering.Etter sentrifugering, resuspend pellets i 100 mikroliter av friske E-DMEM per rør. Etter telling, juster cellene i hvert rør til en tetthet på 1,6 ganger 10 til den femte forhåndsaktiverte CD8-positive T-celler per milliliter medium, og plasser cellene på is. Når cellene er klare, aspirerer kjellermembranmatrisen fra hver brønn av den 96-brønns mikroskopiplaten, og tilsett 50 mikroliter med målceller til individuelle brønner innenfor de indre 60 brønnene på platen med blanding.Tilsett 25 mikroliter E-DMEM supplert med fire ganger 10 til de tredje enhetene per milliliter IL2, og 10 mikromolar fluorogene caspase-3-substrat til de aktuelle brønnene. Tilsett deretter 25 mikroliter forhåndsaktiverte CD8-positive T-celler til de aktuelle brønnene. Og til slutt, legg til E-DMEM til de riktige brønnene for å lage et totalt volum på opptil 100 mikroliter.Tilsett 200 mikroliter PBS eller sterilt vann i alle de tomme brønnene. Rist platen, og la platen stå på et flatt underlag i 10 minutter. Hvis du vil bilde av cellene, angir du mikroskopet for å skaffe bilder i fasekontrast.I tillegg til fluorescenskanaler egnet for det kjernefysiske begrensede fluorescerende proteinet, og det fluorogene aktiverte caspase-3-substratet fluoroforer som brukes i forsøket. Ta deretter bilder av hver eksperimentelle brønn i fasekontrast og de to fluorescenskanalene hver en til tre timer i minst 72 timer. For å analysere de fangede bildene, åpne et bilde fra en kontrollbrønn som bare inneholder målceller og medium uten caspase-3-substrat i fluorescenskanalen som brukes til substratsignal.Vær oppmerksom på om et upassende fluorescenssignal slippes ut av kjernene. Hvis substratsignalet er tydelig i kjernene, bruk spektral unmixing for å øke prosentandelen av substratsignalet som er fjernet fra kjernesignalet, til substratsignalet forsvinner. Deretter viser du en kontrollbrønn som bare inneholder kjerner som ikke er merket effektorceller i medium uten caspase-3-substrat i de to fluorescenskanalene individuelt.Vær oppmerksom på om et signal slippes ut av kjernene. Hvis det ikke er noe signal i de enkelte kanalene, er det ikke nødvendig med spektral ubmiksing. For å løse fluorescerende objekter i begge fluorescenskanaler, bruk en fluorescens bakgrunn subtraksjonsmetode med relevante parametere for prøven og de riktige parametrene for kantsplitting.Bruk bilder av målcellemon monokultur for å etablere parametere for målcelle kjernefysisk fluorescens. Bruk bilder av effector celle monokultur for å etablere parametere for substrat-indusert apoptotisk kjernefysisk fluorescens. Bruk bilder av co-kultur for å verifisere eller avgrense parametere for substrat-indusert apoptotisk kjernefysisk fluorescens i målceller.For å bestemme minimumsstørrelsen på målkjernene, bruk bilder i kjernesignalkanalen fra brønnene som bare inneholder målceller med caspase-substrat. For å bestemme den gjennomsnittlige størrelsen på apoptotiske effekteller kjerner, bruk bilder i substratsignalkanalen fra brønnene som bare inneholder effektorceller med caspase substrat. Hvis du vil telle antall fluorescensmålscellekjerner, konfigurerer du en analyseprosedyre ved hjelp av en passende minimumsstørrelsesbegrensning.Ved hjelp av effektor celle monokultur bilder, sette opp en annen analyse prosedyre for å telle antall apoptotiske kjerner som er større enn den gjennomsnittlige størrelsen på apoptotisk effekt eller kjerner. Deretter setter du opp en tredje analyseprosedyre for å telle antall apoptotiske målceller ved å telle antall kjerner der kjernesignalet og størrelsesbegrenset substratsignalet signifikant samentiseres. Vanligvis øker kreftceller fluorescenssignalet i kjernene etter aktivering av en kjernefysisk målretting caspase biosensor når cellene kommer i kontakt med CD8-positive T-celler forhåndsaktivert av antistoffer i fravær av suppressor celler.Kjernestørrelsene på CD8-positive T-celler er mindre enn kreftcellene. Dermed kan apoptotiske effektorceller utelukkes fra apoptotiske målcelletellinger ved hjelp av en størrelsesbegrensningsbildeanalysemetode. Selv om noen målkreftceller viser en liten avrundet form uten substratfluorescens, påvirker dette ikke analysen.Som disse cellene gjennomgår mitose i stedet for apoptose og dermed er utelukket fra apoptotiske målcelle teller av en kjernefysisk substrat signal overlapping maske. Co-kulturen av målkreftceller med forhåndsaktiverte CD8-positive T-celler øker tumorcelleapoptose over nivåene av spontan apoptose i kreftcellemonokulturer. Vanligvis, når du bruker et optimalt forhold mellom målkreftceller til effektorceller, kan en topp i antall apoptotiske målkreftceller observeres.Denne toppen blir tydeligere når dataene uttrykkes som den apoptotiske fraksjonen av målcellepopulasjonen. Det viktigste å huske når du prøver denne protokollen er å sette opp monokulturer av målceller og monokulturer av effektorceller for bruk i utviklingen av analysemaskene. Denne metoden kan gi innsikt i varigheten og frekvensen av T-celle til kreftcelleinteraksjoner, og forholdene forbundet med genavhengig cytotoksisitet i både menneskelige og museceller.Vi utvikler for tiden denne analysen til en skjerm med høy gjennomstrømning ved hjelp av menneskelige celler for å identifisere forbindelser som hemmer myeloid cellemediert immunsuppresjon og dermed forbedre kontrollpunkthemmerens effekt.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Avbildning av bosatt CD8 T-lymfocytter i menneskelig lunge svulst skiver bruker AC Confocal mikroskopi

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

Påvisning av mitokondrier membran potensial til å studere CLIC4 Knockdown-indusert HN4 celle apoptose In Vitro

Depletion of the mitochondrial membrane potential (MMP, &#916;&#936;m) is considered the earliest event in the apoptotic cascade. It even occurs ahead of ...

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Isolasjon protokollen av musen monocytt-avledet dendrittiske celler og deres påfølgende In Vitro aktivisering med Tumor immun komplekser

Dendritic cells (DC) are heterogeneous cell populations that differ in their cell membrane markers, migration patterns and distribution, and in their ...

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

Flow Cytometric påvisning av nydannede brystkreft stilk cellen som celler etter apoptose reversering

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

Intramucosal Inoculation of Squamous Cell Carcinoma Cells in Mice for Tumor Immune Profiling and Treatment Response Assessment

Intramucosal vaksinasjon av Squamous celle Carcinoma celler i mus for svulst immun profilering og behandling respons vurdering

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is a debilitating and deadly disease with a high prevalence of recurrence and treatment failure. To develop ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

I Vitro svulst celle Rechallenge For prediktiv evaluering av Chimeric Antigen reseptor T celle Antitumor funksjon

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

In vitro-analysen for å studere tumor-macrophage interaksjon

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Bruke Human indusert Pluripotent stamceller for generering av tumor antigen-spesifikke T celler

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generering av Orthotopic bukspyttkjertel svulster og ex vivo karakterisering av tumor-infiltrere T Cell cytotoksisitet

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

Måle sanntids narkotikarespons i organotypic tumor vev skiver

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...