Name: real time detection of in vitro tumor cell apoptosis induced by cd8+ t cells to study immune suppressive functions of tumor-infiltrating myeloid cells
Uploaded: 2019-01-29T12:30:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells at JoVE

Este trabalho foi apoiado por concessões do Wellcome Trust (101067/Z/13/Z (JWP), 109657/Z/15/Z (TK), 615KIT/J22738 (TK), UK) e o MRC (Sr/N022556/1 (JWP, TK), UK). NOC e DDS reconhece apoio da fenotípica triagem centro Phenomics descoberta iniciativa nacional e Cancer Research UK (NOC)

<ol>
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Os autores não têm nada para divulgar.

Este método baseia-se em duas etapas distintas co-cultura: co cultivo CD8+ T células com potencial células supressoras e cultivo co o CD8 'pré-condicionado'+ T células com células de tumor do alvo (Figura 1). O primeiro passo de co-cultura é bastante semelhante de CD8+ T normalmente usados para determinar o efeito de células supressoras na CD8 de ensaios de proliferação de células+ função de célula T. No entanto, proliferação de células T não sempre se correlaciona com sua citotoxicidade. Por exemplo, nós encontramos aquele co-cultura com M-MDSCs ou mamas aumentou ao invés de reduzida proliferação de CD8+ T células na presença de CD3/CD28 activando anticorpos (complementar a Figura 3), Considerando que estas pre-condicionado CD8+ Células T demonstraram redução citotoxicidade contra células de câncer de alvo (Figura 4, Figura 5, Figura 6). Esses resultados destacam a importância da avaliação da atividade funcional, evidenciada pelo alvo câncer apoptosis da pilha, oferecidos por este CD8+ ensaio de citotoxicidade de células T.
Neste ensaio, nós identificamos que CD8+ T células requer aproximadamente 15 h de co-cultura para induzir apoptose máxima de células de tumor mamário de rato E0771-LG (Figura 5). Este atraso pode ser devido a defasagem entre o contato inicial de células efetoras com alvos e acompanhamento formação sinapse imunológica, bem como o tempo necessário para induzir sinais apoptotic em alvos como medido pela ativação de caspase-3 (complementar 1 filme ). Também identificamos que o número de células tumorais de apoptotic alcançado um platô após 24 h, que é provavelmente devido à eliminação de alvos por células T e/ou perda de sinal fluorescente de células mortas. Esta capacidade para identificar o tempo de pico apoptose é uma das principais vantagens deste teste, desde que a determinação de um ponto de tempo ideal é importante para comparações adequadas entre diferentes condições. No nosso caso, por exemplo, a diferença de citotoxicidade entre controle CD8+ T células e CD8 MDSC/MAM-educado+ T células era muito maior a 15-18 h em comparação com 72 h (Figura 5), e, portanto, um ponto de extremidade experimento usando um período de incubação de 72 h produziria resultados enganosos.
Esse método também permite a visualização da interação em tempo real células efetoras-ao-alvo, que proporcionaria maiores insights sobre o mecanismo subjacente a citotoxicidade limitada de CD8+ T células pré-incubados com células supressoras. Por exemplo, observamos que CD8+ T células pré-incubadas com M-MDSCs ou mamas encontrada e interagiu com células de tumor do alvo, mas não sempre induz a apoptose (complementar Movie 4, complementar filme 5, 6 complementar do filme). Embora nós não quantificar esse evento, seria viável e interessante para quantificar e comparar a proporção de encontros e seu tempo de interação em correlação com a indução de apoptose. Outra grande vantagem é que este método exige um pequeno número de células (por exemplo, 1 x 103 do alvo) e 4 x 103 de células efetoras por bem. Na verdade, este protocolo pode ser ainda mais miniaturizado para o formato de placa 384 se desejado. Portanto, este ensaio é apropriado para experiências e rastreio de alto rendimento onde celulares são limitados, tais como em vitro testes usando células preciosas derivado em vivo ou ex vivo amostras.
Por outro lado, uma limitação do ensaio atual é a presença de um número significativo de células efetoras morto em algumas condições. A fim de aumentar a precisão na distinção entre apoptose de células cancerosas de destino dos efetoras CD8+ T células, os núcleos das células são rotuladas de destino e uma restrição de tamanho (o que exclui as células efetoras) é aplicada para análise de dados no presente de núcleos ensaio (Figura 2). No entanto, existem alguns casos onde a sobreposição de agregados de apoptotic (verde) CD8+ T células em apoptose não alvo as células cancerosas, que podem confundir os resultados. Essa limitação poderia ser atenuada pelo uso de uma coluna de remoção de células mortas na prévia de células efetoras à cultura co com pilhas do tumor do alvo, assumindo um número suficiente de células efetoras está disponível. Com sistemas mais complexos de microscopia, também pode ser possível reduzir o sinal positivo falso de rotulagem a CD8 efetoras+ T células com um fluoróforo distinto dos núcleos de célula de destino e o substrato de caspase-3 fluorogenic.
Até agora, este protocolo tem sido utilizado para investigar a ativação de específico de antígeno de CD8+ T células. Embora MDSCs e TAMs no microambiente do tumor suprimem funções de células T através de mecanismos de antígeno específico, MDSCs nos tecidos linfoides periféricos suprimem respostas de células T em um antígeno específico maneira18. Para investigar as funções imunológicas supressivas tais tipos de células, um ensaio de proliferação in vitro usando CD8+ T células de OT-1 ratos transgénicos é comumente usado. Neste ensaio, as células de OT-1 T (expressando o receptor de célula T específica de ovalbumina (OVA)) são co cultivadas com supressor MDSCs na presença de peptídeos de óvulos, que é aplicável para a primeira cultura no nosso ensaio de citotoxicidade (i. e., em células a ativação de T a presença ou ausência de supressores). Também é possível manipular as células de câncer de alvo para expressar os óvulos, que podem induzir a matança de célula de câncer antígeno-específicas por pilhas de T de OT-1. Portanto, o ensaio também permitirá a investigação do MAM/MDSC-mediada supressão da ativação da pilha de T antígeno-específicas. Também é possível aplicar o ensaio para investigar as células humanas, como ativação de anticorpos contra humanos CD3 e CD28 é comercialmente disponível, e um protocolo para isolar TAMs humanas de amostras clínicas tem sido estabelecido19.
Coletivamente, este ensaio é bastante versátil e pode ser usado para examinar a citotoxicidade de outros tipos de células imunes. Atualmente, em nossos laboratórios, está sendo estendido para examinar a citotoxicidade celular dependente de antígeno sob diferentes condições e é também está sendo desenvolvido para alto throughput screening.

É sabido que CD8+ T células podem eliminar células tumorais, quando elas exercem sua citotoxicidade completa. Após a ativação do receptor de células T (TCR), CD8+ T células proliferam e se diferenciar em células citotóxicas efetoras. O CD8 expandida e ativado+ T células secretam grânulos citotóxicos, incluindo perforina e granzymes, que são transferidos para células-alvo e iniciar vários caminhos líticas como caspase-3 mediada por apoptose1. CD8+ T células podem também induzir apoptose de células de tumor activando os receptores em células-alvo, tais como os receptores de fator de necrose tumoral-α (TNF-α), apoptose primeiro sinal ligand (FasL), ou relacionados com TNF ligante de indução de apoptose (pista). Além disso, o CD8 ativado+ T células secretam interferon-γ (IFN-γ) que pode suprimir a proliferação de células do tumor e aumentar a sensibilidade das células do tumor para CD8+ T células através da regulação de FasL receptor1. Dado o potencial para CD8+ T estabeleceram-se a capacidade de abate de tumor, várias estratégias para aumentar sua citotoxidade (por exemplo, inibidores de ponto de verificação, vacinação de câncer e transferência adoptiva do receptor de antígeno Quimérico (carro) expressando as células T) e mostrados efeitos terapêuticos significativos em determinados tipos de câncer2. No entanto, acumular evidências sugere que células de tumor infiltrando imune tais como pilhas de T reguladoras, supressor mieloide-derivado de células (MDSCs) e macrófagos tumor-associado (TAMs) podem suprimir CD8+ T funções de pilha e restringir a eficácia de imunoterapias3,4,5. Para melhorar tais imunoterapias, é importante entender o limite de células imunes como supressores CD8+ citotoxidade de células T. A identificação de CD8+ célula T mecanismos de repressão, bem como druggable alvos para superá-lo, exigirá o desenvolvimento e a utilização de ensaios in vitro.
O método padrão ouro de medição CD8+ citotoxidade de células T é o ensaio de liberação de cromo em que o lançamento da sonda radioativa (51Cr), da target células que lysed por CD8+ T células, determinado6. No entanto, este ensaio tem várias desvantagens, incluindo sensibilidade relativamente baixa, fundo elevado, incapacidade para detectar cedo apoptotic eventos, problemas de eliminação perigosos e compatibilidade limitada com manipulação automatizada de líquido e deteção de apoio aplicações de taxa de transferência maiores. Um outro método comum é análises de fluxo cytometric em que a apoptose de células tumorais de alvo é detectado pelo anexina V ligação7. Neste ensaio, é possível detectar outros parâmetros tais como a morte de célula de destino usando iodeto de propidium (PI) ou 7-aminoactinomycin D (7-AAD) e ativação de células efetoras, indicada pela expressão CD107a ou CD69, além a apoptose em células alvo7 . No entanto, este ensaio requer um grande número de células supressoras, comparados com o ensaio de liberação de cromo. Também exige o desprendimento e a desagregação das células alvo aderentes e isto pode influenciar os resultados. Com efeito, o cromo liberar fluxo cytometric do ou ensaio não são comumente usados para investigar os efeitos de célula supressor sobre as funções de células T. Em vez disso, a medição da proliferação de células T, indicada pela diluição de uma tintura fluorescente (por exemplo, CFSE) pré-carregada em células T é frequentemente usada para avaliar a inibição de CD8+ função de células T por células supressoras. Detecção de produção de IFN-γ de culturas de células T é outro método padrão para avaliar os efeitos de células supressoras na ativação de células T8,9. No entanto, os resultados desses ensaios não necessariamente se correlacionam à célula alvo matando capacidade de CD8+ T células.
Apresentamos aqui um ensaio funcional alternativo para avaliar efeitos de células supressoras, particularmente de macrófagos em tumores metastáticos, sobre a citotoxidade de CD8+ T células. Este método determina a citotoxidade de CD8+ T células, pre-cultivadas com ou sem as células supressoras na presença de anticorpos anti-CD3/CD28 de activação através da detecção de apoptose de células do tumor, indicaram por fluorescência de uma fluorogenic caspase-3 automatizado de substrato6 usando microscopia de lapso de tempo (Figura 1). Este protocolo tem várias vantagens em comparação com outros métodos; requer apenas um pequeno número de células, permite a detecção de morte de células do tumor aderentes com alta sensibilidade, pode imagem interação efetor-alvo em tempo real e é passível de rastreio de alto rendimento.
Neste protocolo, macrófagos associada a metástase (mamas) e suas progenitoras monocítica-MDSCs (M-MDSCs) isoladas de tumores metastáticos em camundongos são usados como células supressoras. Em modelos do rato do cancro da mama metastático, uma população distinta de macrófagos caracterizada como F4/80altaLy6G–CD11baltaLy6Cbaixa se acumula no pulmão contendo tumores metastáticos. Esta população de macrófagos é raramente encontrada no pulmão normal e assim chamada macrófagos associada a metástase (mamas)10. Nestes modelos de rato, outro mieloide célula população, definida como F4/80altaLy6G–CD11baltaLy6Calta, também acumula-se predominantemente no pulmão metastático onde dá origem a mamas11. Baseado em suas características, as CD11baltaLy6Calta MAM células progenitoras podem representar MDSCs M12.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin EDTA (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Freiner Bio-One</td>
			<td>665-180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL Plystyrene Round-Bottom Tube</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Cell Culture Plate (Round Bottom )</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3799</td>
			<td>Co-culture of CD8+T cells with sorted myeloid cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate (Flat bottom)</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>165305</td>
			<td>Co-culture of CD8+T cells with target cells for cytotoxicity assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF647 anti-mouse F4/80 Antibody</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>MCA497A647</td>
			<td>Clone: CIA3-1, Lot#: 1707, 2 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor700 anti-mouse CD8 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100730</td>
			<td>Clone: 53-6.7, Lot#: B205738, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD28 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102111</td>
			<td>Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 37.51, Lot#: B256340</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD3e Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100314</td>
			<td>Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 145-2C11, Lot#: B233720</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD3 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100236</td>
			<td>Clone: 17A2, Lot#: B198730, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cy7 anti-mouse Ly6C Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>128026</td>
			<td>Clone: HK1.4, Lot#: B248351, 1 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albmin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1470-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer (100&#956;m Nylon)</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352360</td>
			<td>To smash the spleen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer (40&#956;m Nylon)</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352340</td>
			<td>To filter the lung digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>422801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8242;s Modified Eagle&#8242;s Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>19853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse CD4 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100406</td>
			<td>Clone: GK1.5, Lot#: B179194, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex Ready-to-Use</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1596-01</td>
			<td>Coating the 96-well plates for cytotoxicity assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte NucLight Red Lentivirus Reagent</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td>4476</td>
			<td>Lenti viral particules encoding mKate2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte ZOOM</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td></td>
			<td>Detector (fluorescence microscope)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuCyte ZOOM 2018A</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td></td>
			<td>Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2916801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lung Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-095-927</td>
			<td>Preparation of single cell suspension from the tumor-bearing lung</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MycoAlert Mycoplasma Detection Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>LT07-318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acid (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucView488</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>10403</td>
			<td>Fluoregenic caspase-3 substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse Ly6G Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>127607</td>
			<td>Clone: 1A8, Lot#: B258704, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 anti-mouse CD11b Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101216</td>
			<td>Clone: M1/70, Lot#: B249268, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Penicillin Streptomycin for primary culture of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103132</td>
			<td>Clone: 30-F11, Lot#: B249564, 0.5 &#956;L/1x10^6 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene (Hexadimethrine bromide)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis Buffer (10X)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine IL-2</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>212-12</td>
			<td>Activation of isolated CD8+ T cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruStain fcX (anti-mouse CD16/32) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>&#160;: Nikon 10X objective (resolution 1.22 &#181;m) 
			&#160;: Green channel excitation: 440 - 480 nm 
			&#160;: Green channel emission: 504 - 544 nm 
			&#160;: Red channel excitation: 565-605 nm 
			&#160;: Red channel emission: 625 - 705 nm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real time detection of in vitro tumor cell apoptosis induced by cd8+ t cells to study immune suppressive functions of tumor-infiltrating myeloid cells

Potencialização da capacidade tumor-matança de CD8+ T células nos tumores, juntamente com sua infiltração do tumor eficiente, é um elemento-chave de sucesso imunoterapias. Vários estudos têm indicado que células mieloides infiltrante tumor (por exemplo, células supressoras mieloide-derivado (MDSCs) e macrófagos tumor-associado (TAMs)) suprimem a citotoxidade de CD8+ T no microambiente do tumor e o direcionamento de células Estas células mieloides regulamentares podem melhorar imunoterapias. Aqui, apresentamos um sistema de ensaio in vitro para avaliar imunes efeitos supressivos de monocítica-MDSCs e TAM sobre a capacidade do tumor-matança de CD8+ T células. Para este fim, nós primeiro culto ingênuo esplênica CD8+ T células com ativação anticorpos anti-CD3/CD28 na presença ou ausência de células supressoras e em seguida co cultivadas as células T pré-ativado com células de câncer de alvo na presença de um fluorogenic substrato de caspase-3. Fluorescência de substrato em células de câncer foi detectada por microscopia de fluorescência em tempo real como um indicador da apoptose de células T-celular induzida por tumor. Neste ensaio, com sucesso podemos detectar o aumento da apoptose de células de tumor por CD8+ T células e sua supressão pela pré-cultura com Prof de fisica ou MDSCs. Este ensaio funcional é útil para investigar CD8+ T mecanismos de supressão de células por células mieloides regulamentares e identificando alvos druggable de superá-lo através do rastreio de alto rendimento.

Este método é baseado na simples co-cultura de células de câncer de alvo com efetoras CD8+ T células que têm sido pre-cultivadas com ou sem células supressoras na presença de activação anticorpos anti-CD3/CD28. Ele detecta o CD8+ câncer de células T-induzida apoptose celular ao longo do tempo seguindo co-cultura, permitindo assim a avaliação dos efeitos de células supressoras na citotoxicidade de CD8+ T células.
Normalmente, as células cancerosas aumentam fluorescência verde em seus núcleos na sequência de ativação de um biossensor de caspase nuclear-direcionamento quando estas células fazem contato com CD8+ T células que são pre-ativado por anticorpos na ausência de supressor células ( Figura 3; Filme complementar 1). Fluorescência verde de caspase substrato foi detectável pelo menos 15 h depois de apoptose foi iniciado. Alguns apoptose espontânea de efetoras CD8+ T células também foi observada ao longo do tempo, mesmo se essas células foram cultivadas em isolamento (Figura 4-; Filme complementar 2). No entanto, tamanhos de núcleos de CD8+ T células são menores do que as das células cancerosas e, portanto, células apoptóticas 'efetoras' podem ser excluídas da apoptose celular 'destino' conta por um tamanho restrição imagem método de análise (Figura 2 e Figura 4). Embora algumas células cancerosas do alvo mostram uma pequena forma arredondada sem fluorescência verde, isso não afeta a análise como essas células estão passando por mitose, ao invés de apoptose (complementar 3 de filme) e, portanto, estão excluídas do apoptotic 'destino' contagens de células por uma máscara de sobreposição vermelho/verde (complementar a Figura 2). Apoptose espontânea das células cancerosas de destino é ocasionalmente encontrado nem na cultura única (complementar Movie 3). No entanto, a cultura co de câncer alvo células com CD8 pré-activated+ T células apoptosis da pilha tumor aumento acima dos níveis de apoptose espontânea em monocultura das células cancerosas (Figura 4). Geralmente, quando se utiliza uma óptima relação alvo de células de câncer de células efetoras, um pico no número de células de câncer de alvo de apoptotic pode ser observado (Figura 5A). Este pico é mais distinto quando os dados é expressa como a fração de apoptotic da populacao de celula alvo (Figura 5B). Neste experimento o basal apoptose de células tumorais de alvo atingiu um pico de 24 h (com fração de apoptotic = 0,08), mas o CD8+ apoptose induzida por células T atingiu um nível máximo às 17h (com fração de apoptotic = 0,66).
Encontramos mais que CD8+ T células pré-incubadas com mamas ou M-MDSCs poderiam fazer contato com as células cancerosas do alvo mas este contato parecia resultar em menos instâncias da apoptose de células de câncer comparado com CD8+ T células pré-ativado sem células supressoras (Figura 3 e Figura 4; Filme complementar 4 e complementar filme 5). Embora o CD8+ T células pré-incubadas com as células mieloides ocasionalmente induzida apoptose de células de câncer, havia também alguns proliferação das células cancerosas de destino que não tem sido estimulado a sofrer apoptose durante o tempo da experimento (6 complementar do filme). Consistente com esses achados, a fração de pico de células de câncer de apoptotic cultivadas com CD8+ T células pré-incubados com células mieloides (fração apoptotic = 0,38 às 23h para MDSC-E e 0,25 a 20 h para MAM-E) foi significativamente menor do que as células cancerosas cultivadas com CD8+ T células que não foram previamente incubadas com as células supressoras (Figura 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig1.jpg"> Figura 1: um esquema mostrando o procedimento experimental. CD8 esplênica ingênuo+ T células são cultivadas com os anticorpos anti-CD3/CD28 ativando com ou sem metástase-associado macrófagos (mamas) ou supressor monocítica mieloide derivada de células (M-MDSCs). Após 4 dias, flutuando CD8+ T células são coletadas e co cultivadas com células de câncer alvo na presença de fluorogenic caspase-3 de substrato. Apoptose de células de câncer são detectadas sob microscopia de fluorescência em tempo real. Imagens mostradas foram adquiridas utilizando uma plataforma de célula de imagem ao vivo (consulte a Tabela de materiais). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig2.jpg"> Figura 2: identificação de apoptose nas células-alvo distintas de células efetoras de apoptotic. Top de linha: imagem aquisição no canal vermelho permite a identificação dos núcleos de células alvo por máscara de deteção do alvo (máscara de análise-de-rosa). Fila do meio: imagens adquiridas em canal verde indicam células efetoras e alvo de apoptotic. Máscara de apoptose restrito Asize (análise teal máscara; superior a 80 µm2) permite único apoptotic células efetoras ser excluídas da análise. Linha inferior: composto de imagens vermelho mesclado e verdes canais com imagem de contraste de fase (à esquerda) ou vermelho/verde sobreposição de máscara (à direita). Identificação de fluorescência verde co localizada, tamanho restrito com fluorescência vermelha (máscara de análise amarelo), permite a detecção mais precisa de apoptotic núcleos alvo (seta amarela), excluindo os agregados de células efetoras de apoptotic (branco pontas de seta). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig3.jpg"> Figura 3: Interação entre CD8+ T células e células cancerosas. Alambiques de filmes de lapso de tempo representativos das células alvo E0771-LG_NLR (T) co cultivadas com efetoras CD8+ T células (E) na proporção de 4:1. o efetor/alvo. MDSC-E e MAM-E indicam células efetoras pré-incubados com M-MDSCs e mamas, respectivamente. São mostradas imagens compostas (incluindo imagens de canais verde, vermelho e contraste de fase). Pontas de seta seguem as mesmas células através dos campos diferentes e pontos de tempo. Setas de amarelo: um alvo que associa efetores e sofre apoptose, branco setas: um alvo que associa efetores, mas não sofre apoptose. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig4.jpg"> Figura 4: deteção das células cancerosas de apoptotic. Representante campos extraídos de lapso de tempo filmes a 18 h após a imagem. Imagens compostas (esquerda; canais de verde, vermelho e contraste de fase) e imagens de red canal sem (médio) ou com sobreposição (à direita) vermelho/verde máscara (amarelo) são mostrados. Pontos amarelos na coluna da direita representam as células cancerosas apoptotic. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig5.jpg"> Figura 5: CD8+ induzida por células T câncer apoptosis da pilha. (A) número de células cancerosas de apoptotic cultivadas com effector C8+ T células em diferentes efetores à relação de destino (E:T). (B) Apoptotic fração da populacao de celula alvo. Dados são meios ± SD. quer dizer área sob a curva (AUC) também é mostrada. Unpaired t-teste com correção de Welch foi usado para analisar o AUC. * P < 0,0001 comparado com E:T = 0:1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig6.jpg"> Figura 6: Efeitos de células mieloides tumor infiltrando na citotoxicidade de CD8+ T células. (A) número de células de câncer de apoptotic (alvo: T) cultivadas com C8+ T células (efetor: E) a 4:1 da relação E:T. CD8+ T células pre-foram cultivadas na ausência (círculo preto) ou presença de células supressoras monocítica-mieloide derivados (MDSC-e: azul círculo) ou macrófagos associada a metástase (MAM-e: círculo vermelho). Dados são meios ± SD. (B) Apoptotic fração da populacao de celula alvo. Dados são meios ± SD. dizer AUC também é mostrado. Unpaired t-teste com correção de Welch foi usado para analisar o AUC. * P < 0,0001 comparado ao T apenas, #P < 0,0001 comparado a I + g. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig6large.jpg" target="_blank">, por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Complementar Figura 1. Retenção de estratégia para isolar as células supressoras do pulmão metastático. (A) representante ponto parcelas para isolar as células supressoras de mieloide-derivado monocítica (M-MDSCs) e macrófagos associada a metástase (mamas). O limite de nível de Ly6C para distinguir mamas (Ly6Cbaixo) e M-MDSCs (Ly6Calta) é baseado de macrófagos alveolares residentes (RMAC). (B) pureza das M-MDSCs classificadas (CD45+Ly6G–CD11b+Ly6Calta) e mamas (CD45+Ly6G–CD11b +Ly6Cbaixo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/FigureS1_Rvd.pdf">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Complementar Figura 2. Imagens representativas de células mitóticas alvo. Alambiques de filmes de lapso de tempo representativos da mono-cultura de células alvo E0771-LG_NLR. Top: imagens compostas incluindo imagens de canais verde, vermelho e contraste de fase. Fundo: imagens compostas (canais vermelho e verdes) com máscara de sobreposição vermelho/verde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/FigureS2_Rvd.pdf">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Complementar Figura 3. Efeitos de células mieloides tumor infiltrando na proliferação de CD8+ células T. (A) representante histogramas mostrando a diluição de rotulagem fluorescente com CFSE em CD8+ T células. CD8 esplênica ingênuo+ T células foram isoladas, conforme descrito no protocolo-3 e rotuladas com 5 µM de CFSE a 37 ° C por 15 min. As pilhas de T etiquetadas foram cultivadas na presença de IL-2 e anti-CD3/CD28 activando anticorpos com ou sem pilhas myeloid, conforme descrito no protocolo n º 4. Após 4 dias, fluorescência verde em células T foi detectada pelo citômetro de fluxo. (B) índice de divisão de CD8+ T células calculada como descrito anteriormente,17. Dados são meios ± SEM. * P < 0,01 comparado ao controle, #P < 0.05 em comparação com αCD3/CD28 AB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/FigureS3_Rvd.pdf">clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Filme complementar 1. Filme de figuras 3 e 4; I + g. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS1.mp4">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Complementar filme 2. Filme de figuras 3 e 4; Efetor (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS2.mp4">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Complementar filme 3. Filme de figuras 3 e 4; Alvo (T). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS3.mp4">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Filme complementar 4. Filme de figuras 3 e 4; MDSC-E + T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS4.mp4">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Filme complementar 5. Filme de figuras 3 e 4; MAM-E + T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS5.mp4">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Complementar filme 6. Filme de figuras 3 e 4; MAM-E + T (proliferação). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS6.mp4">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

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Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Descrevemos aqui um protocolo para investigar a citotoxidade de CD8 pré-activated+ T células contra as células cancerosas através da detecção de apoptotic câncer células através do tempo real microscopia. Este protocolo pode investigar os mecanismos subjacentes mieloide induzida por células T cell supressão e avaliar compostos vistos reabastecer T células através do bloqueio de células mieloides supressivas do sistema imunológico.

Detecção de tempo real em Vitro Tumor celular apoptose induzida por CD8+ T células para estudar as funções imunológicas supressora de Tumor infiltrando células mieloides

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Nosso protocolo avalia os efeitos das células supressoras derivadas do mieloide e dos macrófagos associados ao tumor na apoptose celular induzida por células T. Ao lado da investigação dos mecanismos subjacentes de possíveis intervenções terapêuticas. Este protocolo avalia diretamente a apoptose de células T induzidas por células T com alta sensibilidade e permite análise longitudinal e imagem de interações célula-célula.A eficácia do inibidor de ponto de verificação é melhor analisada por células mielóides infiltradas por tumores em certos tipos de tumores. Essa técnica pode levar à identificação de novas terapias para esses tumores. Esse método poderia não apenas avançar na pesquisa de imunologia do câncer, mas poderia potencialmente também fornecer insights sobre a imunodeficiência e doenças autoimunes.Para a ativação e expansão de células T isoladas de baço, a primeira alíquota é de uma vez 10 para a quinta célula T CD8 positiva em 50 microliters de E-DMEM em poços individuais de uma placa de fundo U de 96 poços. Em seguida, adicione uma vezes 10 às quintas células supressoras em 50 microliters de E-DMEM, ou 50 microliters de E-DMEM sozinho, em cada poço de células T. Em seguida, adicione 50 microliters de meio de ativação recém-preparado e 50 microliters de E-DMEM, com ou sem os reagentes de teste de interesse, aos poços apropriados.E coloque a placa em uma incubadora de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono com 95% de umidade por quatro dias. Para configurar uma co-cultura de células-T pré-ativada CD8-positiva, adicione primeiro 30 microliters de 1 a 100 diluídos de membrana de porão solúvel reduzida pelo fator de crescimento aos poços apropriados de uma placa de fundo plano de 96 poços, adequada para microscopia. Agite a placa para espalhar a matriz uniformemente, e coloque a placa na incubadora de cultura celular por pelo menos uma hora.Enquanto a placa está equilibrando, prepare as células-alvo. Aspire o médio, lave com PBS e adicione um mililitro de 05% Trypsin-EDTA à temperatura ambiente por um minuto. Adicione nove mililitros de DMEM suplementados com soro bovino fetal por tubulação suave, e transfira as células dissociadas em tubos.Depois de centrifugar as células, resuspense a palete em 500 microliters de E-DMEM. Filtre as células resuspended através de um coador celular, e conte as células vivas. Em seguida, ajuste a densidade para quatro vezes 10 para as células-alvo quarta por mililitro em E-DMEM fresco no gelo.Em seguida, pipeta as células T pré-ativadas CD8-positivas algumas vezes para resuspensar as células em uma única suspensão celular, e transferir as células T flutuantes para um tubo de 1,5 mililitro por condição. Colete todas as células restantes com 200 microliters de PBS por poço, transfira as lavagens para os tubos apropriados de 1,5 mililitro e centrífuga. Aspire o meio e adicione um mililitro de E-DMEM a cada tubo para centrifugação.Após a centrifugação, resuspenja as pelotas em 100 microliters de E-DMEM fresco por tubo. Após a contagem, ajuste as células em cada tubo para uma densidade de 1,6 vezes 10 para a quinta célula T pré-ativada CD8-positiva por mililitro de médio, e coloque as células no gelo. Quando as células estiverem prontas, aspire a matriz de membrana do porão de cada poço da placa de microscopia de 96 poços, e adicione 50 microliters de células-alvo a poços individuais dentro dos 60 poços internos da placa com mistura.Adicione 25 microliters de E-DMEM complementados com quatro vezes 10 às terceiras unidades por mililitro de IL2, e 10 micromolars de caspase-3 fluorogênicas aos poços apropriados. Em seguida, adicione 25 microliters de células T cd8-positivas pré-ativadas aos poços apropriados. E, finalmente, adicione E-DMEM aos poços apropriados para fazer um volume total de até 100 microliters.Adicione 200 microliters de PBS ou água estéril em todos os poços vazios. Agite a placa e deixe a placa em uma superfície plana por 10 minutos. Para imaginar as células, defina o microscópio para adquirir imagens em contraste de fase.Assim como os canais de fluorescência adequados para a proteína fluorescente nuclear restrita, e os fluorogênicos ativados caspase-3 fluoroforos usados no experimento. Em seguida, capture imagens de cada poço experimental em contraste de fase e os dois canais de fluorescência a cada uma ou três horas por pelo menos 72 horas. Para analisar as imagens capturadas, abra uma imagem de um poço de controle contendo apenas células-alvo e meio sem substrato caspase-3 no canal de fluorescência usado para sinal de substrato.Observe se um sinal de fluorescência inadequado está sendo emitido pelos núcleos. Se o sinal do substrato for aparente dentro dos núcleos, use descomprturação espectral para aumentar a porcentagem de sinal de substrato removido do sinal dos núcleos, até que o sinal do substrato desapareça. Em seguida, veja um poço de controle contendo apenas núcleos de células efetivas sem rótulo no meio sem substrato caspase-3 nos dois canais de fluorescência individualmente.Observe se um sinal é emitido pelos núcleos. Se nenhum sinal for aparente nos canais individuais, não é necessário descompração espectral. Para resolver os objetos fluorescentes em ambos os canais de fluorescência, use um método de subtração de fundo de fluorescência com parâmetros relevantes para a amostra e os parâmetros apropriados para a divisão da borda.Use imagens da monocultura celular alvo para estabelecer parâmetros para fluorescência nuclear de células-alvo. Use imagens da monocultura celular efetiva para estabelecer parâmetros para fluorescência nuclear apoptótica induzida por substrato. Use imagens de co-cultura para verificar ou refinar parâmetros para fluorescência nuclear apoptótica induzida por substrato em células-alvo.Para determinar o tamanho mínimo dos núcleos alvo, use imagens no canal de sinal dos núcleos dos poços contendo apenas células-alvo com substrato de caspase. Para determinar o tamanho médio dos núcleos de efeitos apoptóticos, use imagens no canal de sinal substrato dos poços contendo apenas células efeito ou com substrato de caspase. Para contar o número de núcleos celulares alvo de fluorescência, configure um procedimento de análise usando uma restrição de tamanho mínimo apropriada.Utilizando imagens de monocultura celular efeitoor, configure um segundo procedimento de análise para contar o número de núcleos apoptóticos que são maiores do que o tamanho médio dos núcleos de efeito apoptótico. Em seguida, configure um terceiro procedimento de análise para contar o número de células-alvo apoptóticas contando o número de núcleos em que o sinal do núcleo e o sinal de substrato restrito de tamanho co-localizam significativamente. Normalmente, as células cancerígenas aumentam o sinal de fluorescência em seus núcleos após a ativação de um biosensor de caspase de alvo nuclear quando as células fazem contato com células T CD8 positivas pré-ativadas por anticorpos na ausência de células supressoras.Os tamanhos do núcleo das células T CD8 positivos são menores do que os das células cancerosas. Assim, as células efeitos apoptóticas podem ser excluídas da contagem de células-alvo apoptóticas por um método de análise de imagem de restrição de tamanho. Embora algumas células cancerígenas alvos apresentem uma pequena forma arredondada sem fluorescência de substrato, isso não afeta a análise.Como essas células estão sofrendo mitose em vez de apoptose e, portanto, são excluídas da contagem de células-alvo apoptóticas por uma máscara de sobreposição de sinal de substrato nuclear. A co-cultura de células cancerígenas-alvo com células T pré-ativadas CD8-positivas aumenta a apoptose das células tumorais acima dos níveis de apoptose espontânea em monoculturas de células cancerosas. Geralmente, ao usar uma proporção ideal de células cancerígenas-alvo para células efetivas, um pico no número de células cancerígenas alvo apoptóticas pode ser observado.Esse pico se torna mais distinto quando os dados são expressos como a fração apoptótica da população celular alvo. A coisa mais importante a ser lembrada ao tentar este protocolo é configurar monoculturas de células-alvo e monoculturas de células effectoras para uso no desenvolvimento das máscaras de análise. Este método pode fornecer uma visão da duração e frequência das células T às interações de células cancerosas, e as condições associadas à citotoxicidade dependente de genes em células humanas e camundongos.No momento, estamos desenvolvendo este ensaio em uma tela de alta produtividade usando células humanas para identificar compostos que inibem a imunossupressão mediada por células mieloides e, assim, aumentam a eficácia do inibidor de ponto de verificação.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imagem de linfócitos de T CD8 residente no Tumor de pulmão humano fatias utilizando microscopia Confocal

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

Pesquisa do câncer

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

Deteção do potencial de membrana mitocôndria para estudar CLIC4 HN4 induzida em Knockdown celular apoptose em Vitro

Depletion of the mitochondrial membrane potential (MMP, &#916;&#936;m) is considered the earliest event in the apoptotic cascade. It even occurs ahead of ...

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Protocolo de isolamento de células dendríticas derivadas de monócitos de rato e sua ativação subsequente em Vitro com Tumor de imunocomplexos

Dendritic cells (DC) are heterogeneous cell populations that differ in their cell membrane markers, migration patterns and distribution, and in their ...

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

Fluxo Cytometric deteção da recém-formada mama câncer células-tronco células após a reversão de apoptose

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

Intramucosal Inoculation of Squamous Cell Carcinoma Cells in Mice for Tumor Immune Profiling and Treatment Response Assessment

Intramucosal inoculação de células de Carcinoma de células escamosas em ratos para perfil imune de Tumor e tratamento avaliação de resposta

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is a debilitating and deadly disease with a high prevalence of recurrence and treatment failure. To develop ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

Em Vitro Tumor Cell reexposição para avaliação preditiva de Receptor de antígeno quimérico célula T função antitumoral

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

Ensaio in vitro para estudo do tumor-interação macrófago

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Usando células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem para a geração de células T específicas de antígeno tumoral

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Geração de tumores pancreáticos ortotópicos e caracterização ex vivo da citotoxicidade de células T infiltrada tumoral

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

Medição da resposta de drogas em tempo real em fatias de tecido tumoral organotípico

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...